Nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cam thảo đất (scoparia dulcis l) và phân đoạn của dịch chiết này ở chuột nhắt trắng gây đái tháo đường thực nghiệm

Tổng quan

Bệnh đái tháo đờng

WHO (1994) và hiệp hội ĐTĐ Mỹ (America diabetes association- ADA-1997) đã định nghĩa: “Bệnh ĐTĐ biểu hiện sự tăng đờng huyết và rối loạn chuyển hóa glucid, lipid và protein, thờng kết hợp với sự giảm tuyệt đối hay tơng đối về sự bài tiết hay tác dụng insulin”[43].

Lịch sử đã ghi nhận bệnh có ít nhất 3000 năm trớc ĐTĐ (diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp.Diabetes có nghĩa là “chảy” qua một ống siphon, mellitus có nghĩa là ngọt[19]

1.1.2 Dịch tễ học bệnh ĐTĐ

♦ Trên thế giới: ĐTĐ là một bệnh phổ biến của hầu hết các quốc gia trên thế giới Tỷ lệ mắc bệnh rất khác nhau tùy theo địa d, chủng tộc, lứa tuổi, mức và lối sống[5] Tỷ lệ ngời dân mắc bệnh tăng lên cùng với tuổi, mức sống; thành thị lớn hơn nông thôn, ở các nớc công nghiệp phát triển cao hơn ở các nớc chậm phát triển[19].

Tỷ lệ mắc bệnh giữa các vùng lãnh thổ có sự khác nhau: ở châu Âu tỷ lệ mắc bệnh khoảng 3%; ở Mỹ năm 1991 là 6,6; ở châu á, bệnh ĐTĐ cũng chiếm tỷ lệ cao: ở Thái Lan 3,58%, Philippin 4,27%, Malaysia 3,0%, Hồng kông 3,0%, Hàn Quốc 2,08%, Đài Loan 1,6% Tại Singapore năm 1975 tỷ lệ mắc bệnh là 1,9%, năm 1984 là 4,7% và năm 1992 là 8,6%[23].

Bệnh có xu hớng tăng theo thời gian và sự tăng trởng kinh tế Tại Mỹ, theo NHANES II (The second National Health and Nutrition Examination Survey II) cho thấy: năm 1987, tỷ lệ ĐTĐ ở ngời nghiên cứu là 6,6%, năm

1998 tỷ lệ này tăng lên 7,8% và đến năm 2002 tỷ lệ ĐTĐ trong dân số nói chung là 8,6%[28] Tại Singapore tỷ lệ mắc ĐTĐ năm 1975 là 1,9%, đến năm

1984 là 4,7%, đến năm 1992 là 8,6% và đến năm 1998 tỷ lệ này đã lên tới 9%[11]

Theo tài liệu công bố tại Hội nghị quốc tế về ĐTĐ tháng 12 năm 1997 tại Singapore cho thấy số bệnh nhân bị ĐTĐ tại 10 nớc điển hình nh sau[29] :

Tên nớc Số bệnh nhân ĐTĐ năm 1995

Số bệnh nhân ĐTĐ năm 2025

Tổ chức Y tế thế giới đã cảnh báo có thể xuất hiện đại dịch bệnh ĐTĐ ở châu á thế kỷ 21[29].

Theo tài liệu của Viện nghiên cứu ĐTĐ quốc tế (International Diabetes Institute) số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ typ 2 trên thế giới khoảng 98,9 triệu ngời vào năm 1994 ; 157,3 triệu ngời vào năm 2000 và dự báo khoảng 215,6 vào năm 2010[23].

♦ Tình hình mắc bệnh ĐTĐ tại Việt nam ở Việt nam, cha có công bố đầy đủ về tỷ lệ ngời mắc bệnh ĐTĐ trong phạm vi cả nớc, nhng theo thông kê của một số bệnh viện lớn, bệnh đang có chiều hớng gia tăng theo nhịp độ phát triển kinh tế mà bằng chứng là số lợng bệnh nhân điều trị ở các bệnh viện lớn tăng lên hàng năm[23].

Thành phố Năm Tác giả Tỷ lệ (%)

Hà nội 1990 Phan Sĩ Quốc, Lê Huy Liệu[20] 1,1

TP Hồ Chí Minh 1994 Mai Thế Trạch [38] 2,52

Năm 2001, tỷ lệ bệnh ĐTĐ typ 2 ở các thành phố lớn (Hà nội, Hải phòng, Đà nẵng, thành phố Hồ Chí Minh) lên đến 4,1%, thì đến năm 2002, tỷ lệ ĐTĐ typ 2 ở các thành phố lớn là 4,4%[4]. ở Việt nam, tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau theo địa d Tại Hà nội, tỷ lệ mắc bệnh ở nội thành năm 1990 là 1,6% và ngoại thành là 0,6%; đến năm

1999, tỷ lệ mắc bệnh ở nội thành là 4% và ngoại thành là dới 1% Tại Long xuyên-An giang, tỷ lệ mắc bệnh ở thành phố là 4,6% và ở nông thôn là 3,5%[29].

Rõ ràng ĐTĐ đang có chiều hớng phát triển nhanh ở nớc ta ĐTĐ là một bệnh thờng gặp, có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các bệnh nội tiết[23], có rất nhiều biến chứng mạn tính và cấp tính về tim mạch, thần kinh, tổn thơng thận, gây mù lòa, cắt cụt chi, giảm tuổi thọ[19] Sự gia tăng nhanh chóng của bệnh kèm theo những biến chứng của nó thực sự là mối quan tâm chung của ngành y tế cũng nh của xã hội

Việc chẩn đoán bệnh ĐTĐ sẽ không khó khăn khi bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng kinh điển nh : ăn nhiều, sụt cân, uống nhiều, đái nhiều, có đờng niệu và glucose máu tăng cao Tuy nhiên, những trờng hợp không có triệu chứng điển hình hoặc glucose máu lúc đói ở mức bình thờng thì việc chẩn đoán hoàn toàn dựa vào các xét nghiệm hóa sinh[47,54].

* Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo WHO năm 2001:

 Glucose huyết tơng lúc đói > 7,0 mmol/l (làm xét nghiệm ít nhất hai lần).

 Glucose huyết tơng bất kỳ > 11,1 mmol/l (làm xét nghiệm ít nhất hai lần).

 Glucose huyết tơng 2 giờ sau uống 75 g glucose > 11,1 mmol/l.

Dựa vào cơ chế bệnh sinh và nguy cơ mắc bệnh, năm 1985, WHO phân loại bệnh ĐTĐ thành hai loại chính[19].

1.1.4.1 §T§ typ 1 ĐTĐ typ 1 (hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin-insulin dependent diabetes millitus-IDDM) là bệnh tự miễn đợc đặc trng bởi sự phá hủy tế bào β của tuyến tụy, thờng dẫn đến thiếu hụt insulin tuyệt đối[19] Nguy cơ để phát triển thành ĐTĐ typ 1 là xuất hiện những yếu tố tự miễn trong huyết thanh nh : kháng thể kháng tế bào đảo tụy, kháng thể kháng insulin, glutamat decarboxylase (GAD) và protein tyrosin phosphatase IA-2[23].

- Sự thiếu hụt tuyệt đối hoặc gần nh tuyệt đối insulin.

- Sự xuất hiện những triệu chứng trầm trọng.

- Khả năng xuất hiện ceton niệu.

- Phụ thuộc vào insulin bên ngoài để đảm bảo sự sống.

- Thờng xuất hiện ở ngời trẻ tuổi.

1.1.4.2 §T§ typ 2 ĐTĐ typ 2 (hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin-non insulin dependent diabetes mellitus-NIDDM), cơ chế bệnh sinh chủ yếu là kháng insulin cùng với sự thiếu hụt về bài tiết insulin ĐTĐ typ 2 chiếm 85% các tr- ờng hợp ĐTĐ và chiếm tới 100 triệu dân trên toàn thế giới[23].

- Sự xuất hiện những triệu chứng thờng là ôn hòa.

- Không có khả năng xuất hiện ceton niệu.

- Không phụ thuộc insulin ngoại sinh.

- Thờng xuất hiện ở ngời trên 40 tuổi.

Phân biệt hai typ chính của bệnh ĐTĐ Đặc điểm Typ 1 Typ 2

Trọng lợng ban đầu Thờng gầy Thờng béo phì

Cách khởi bệnh Đột ngột và rầm rộ: ăn nhiÒu, uèng nhiÒu, tiÓu nhiều và gầy nhiều.

Tăng ceto máu(không điều trị)

Biến chứng mạch máu Vi mạch Mạch lớn

Tiết insulin Rất giảm Bình thờng hoặc giảm ít.

Phụ thuộc insulin Có Không

Nồng độ insulin Rất thấp hoặc bằng 0 Bình thờng hoặc tăng Kháng thể kháng tiểu đảo Có ngay từ lúc khởi bệnh Không có

1.1.4.3 Các typ khác của ĐTĐ

♦ ĐTĐ liên quan đến thiếu dinh dỡng (ĐTĐ nhiệt đới)[5] Đặc điểm :

- Bệnh bắt đầu từ khi còn trẻ (dới 30 tuổi).

- Nguyên nhân : do ăn uống thiếu thốn, đặc biệt thiếu protid.

- Nồng độ glucose máu khá cao.

- Không có biến chứng hôn mê nhiễm toan ceto.

♦ ĐTĐ kết hợp với một số bệnh và hội chứng[5]

- Bệnh về tuyến tụy (viêm tụy mạn, K tụy, cắt tụy)

- Bệnh nội tiết (Hội chứng Cushing, Basedow, U tủy thợng thận)

- Dùng liều cao và kéo dài một số thuốc (corticoid, thuốc lợi tiểu thuộc nhãm thiiazit).

♦ ĐTĐ ở phụ nữ có thai: Là ĐTĐ kết hợp với sự tăng các biến chứng lúc sinh đẻ và sự kết hợp với nguy cơ của ĐTĐ trong những năm sau khi đẻ[19].

Các phụ nữ đợc xếp vào nhóm có nguy cơ cao khi[23]:

- Tiền sử gia đình có ngời mắc bệnh ĐTĐ.

- Tiền sử sinh con trên 4 kg.

- Tiền sử xảy thai hoặc thai chết lu không rõ nguyên nhân.

♦ Giảm dung nạp glucose: Đó là những ngời cha mắc ĐTĐ nhng có nhiều nguy cơ bị ĐTĐ và các biến chứng thoái hóa mạch máu so với những ngời bình thờng[5] Thờng hay gặp ở ngời béo phì, thờng có insulin máu tăng và kháng với insulin[23].

Chẩn đoán Đờng máu 2 giờ sau uống 75 g glucose (mmol/l)

Rối loạn dung nạp glucose ≥ 7,8 ≥ 7,8

1.1.5 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

1.1.5.1 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh bệnh ĐTĐ typ 1

♦ Nguyên nhân: ở châu Âu, bệnh ĐTĐ typ 1 chiếm 10% số bệnh nhân ĐTĐ Bệnh th- ờng xảy ra ở ngời trẻ dới 40 tuổi, có thể trạng gầy[5] Khởi phát lâm sàng nói chung mang tính chất cấp tính với những triệu chứng kinh điển rầm rộ. Nguyên nhân là do có sự thiếu hụt hoắc hầu nh không có insulin do tế bào β của tuyến tụy bị phá hủy, do vậy việc điều trị bệnh phụ thuộc hoàn toàn vào việc cung cấp insulin từ ngoài vào[19].

Cam thảo đất

Còn có tên là cam thảo nam, dã cam thảo (Trung Quốc), thổ cam thảo (Trung Quốc), giả cam thảo.

Tên khoa học: Scoparia dulcris Linn

Thuộc họ Hoa mõm sói- Scrophulariaceae.

Cam thảo đất (Herbra Scopariae) là toàn cây tơi hoặc phơi khô, sấy khô của cây cam thảo đất.

Cam thảo đất là một loại cỏ mọc thẳng đứng, cao 30-80 cm, thân nhẵn, rễ to hình trụ Lá đơn, mọc đối hoặc vòng 3 lá một Phiến lá hình mác hay hình trứng ngợc, dài 1,5-3 cm, rộng 8-12 mm, phía cuống hẹp lại thành cuống ngắn, mép lá nửa phía trên có răng ca to, phía dới nguyên Mùa hạ ra hoa nhỏ màu trắng ở kẽ lá, mọc riêng lẻ hoặc thành đôi Quả nhỏ hình cầu, trong chứa nhiều hạt nhỏ.

♦ Phân bố, thu hái, chế biến.

Cây mọc hoang khắp nơi ở Việt nam Có mọc cả ở miền Nam Trung Quốc, đặc biệt vùng Quảng Tây, nhân dân cũng dùng cây này với tên dã cam thảo Tại Ân Độ, Malaixia, Thái Lan, châu Mỹ đều có Có thể thu hái quanh năm, có khi dùng tơi, nhng phần nhiều dùng khô : Đào toàn cây cả rễ, rửa sạch đất cát, phơi hay sấy khô là đợc

Theo Heyne, trong cây cam thảo đất có một lợng nhỏ ancaloid và một chất đắng.

Có tác giả cho biết rằng, trong cây có nhiều axit xilixic.

Mới đây theo các tài liệu ấn độ, trong cây này có một hoạt chất gọi là amelin dùng uống đợc để chữa các triệu chứng axit (acidose) của bệnh đái tháo đờng.

♦ Tình hình nghiên cứu về cây cam thảo đất

Theo kinh nghiệm sử dụng trong Y học dân tộc : ở Việt Nam và Trung Quốc cam thảo đất đợc dùng thay vị cam thảo bắc để chữa sốt, chữa say sắn độc, giải độc cơ thể Tại Malaixia, nhân dân dùng làm thuốc ho.Tại đảo Angti, rễ cam thảo đất đợc dùng làm thuốc thu sáp, thuốc nhầy để chữa bệnh lậu, kinh nguyệt quá nhiều Tại Braxin, lấy nớc ép cam thảo nam thụt chữa bệnh ỉa chảy và pha uống chữa ho.

Kinh nghiệm dùng cam thảo đất chữa bệnh ĐTĐ đợc ghi nhận ở ấn Độ, cam thảo đất đợc dùng để chữa triệu chứng axit (acidose) trong bệnh đái tháo đờng nhng có tác giả đã không xác nhận sự công hiệu của thuốc này.

Theo Heyen, trong cây cam thảo đất có một lợng nhỏ alcaloid và một chất đắng Có tác giả cho rằng, trong cây có nhiều acid xilixic Mới đây, theo các tài liệu Ân độ, trong cây có một hoạt chất gọi là Amelin dùng uống đợc để chữa các triệu chứng của bệnh ĐTĐ.

Tuy nhiên năm 1918, Whittaker H Trong Brit Med J Theo dõi áp dụng chất amelin trong 2 trờng hợp thì cho rằng amelin không công hiệu đối với bệnh ĐTĐ.

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới cũng đã khẳng định tác dụng hạ đờng huyết của loại dợc thảo này thông qua tác dụng tăng bài tiết insulin và gia tăng sử dụng glucose ở các tổ chức ngoại vi [57].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Đào Ngọc Phan và cộng sự (2005) đã khẳng định tác dụng hạ đờng huyết của cam thảo đất [27].

Gần đây nhóm nghiên cứu của TS Tạ Thành Văn đã bớc đầu công bố tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết từ cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng và chuột nhắt trắng đợc gây đái tháo đờng bằngStreptozotocin [39].

Các mô hình gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm

Có nhiều phơng pháp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm Dựa trên cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 có thể chia làm hai phơng pháp chính:

1.3.1 Phơng pháp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm mô phỏng theo §T§ typ 1

Cơ chế chính của phơng pháp này là dùng các thuốc hoặc hóa chất (streptozotocin, alloxan) gây tổn thơng các tế bào  của tuyến tụy dẫn đến thiếu hụt insulin, glucose máu sẽ tăng cao và gây ĐTĐ

Trớc đây, các tác giả thờng dùng alloxan, nhng do hoạt tính của alloxan không ổn định, nên hiện nay đợc thay bằng streptozotocin (STZ) STZ: 2 deoxy - 2 (3 methyl - 3 nitrosoueido) - D glucopiranose có công thức C8H15N3O7 đợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1960 nh là một sản phẩm phụ của quá trình lên men

Streptomyces achromogenas [39] STZ là kháng sinh tổng hợp kháng u, đợc sử dụng trong hóa trị liệu điều trị ung th tuyến tụy Có nhiều cách gây ĐTĐ bằng STZ, có thể cho các liều thấp dới mức gây ĐTĐ (thờng cho liều 20-30 mg/kg/ngày đối với chuột cống) hoặc cho liều cao một lần (thờng cho liều 150 mg/kg đối với chuột nhắt) Phơng pháp này đang đợc nhiều tác giả áp dụng

1.3.2 Phơng pháp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm mô phỏng theo §T§ typ 2

♦ Bằng chế độ dinh dỡng kết hợp với thuốc

Chuột đợc nuôi bằng chế độ dinh dỡng giàu hàm lợng mỡ, sau đó đợc tiêm STZ liều 50-100 mg/kg Kết quả là chuột đợc tạo ra có glucose máu tăng không nhiều, nhng điểm nổi bật là tạo ra mô hình thiếu hụt và kháng insulin, mô phỏng theo kiểu ĐTĐ typ 2 ở ngời.

♦ Bằng chọn lọc và lai tạo

Trong tự nhiên, một số chủng chuột (chủng Wistar, chủng KK-Ay,…) có các cá thể có biểu hiện rối loạn dung nạp glucose và tăng glucose máu nhng cha rõ. Nhằm tạo ra những chủng chuột có biểu hiện tăng glucose máu và kháng insulin mạnh, các nhà nghiên cứu đã cho các cá thể này sinh sản cùng dòng (chuột Wistar), lai tạo với các chuột khác, hoặc chọn lọc các chủng chuột Wistar có biểu hiện rối loạn dung nạp glucose cho lai cùng dòng.

Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu

2.1.1 Đối tợng nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu là tại Bộ môn Hóa sinh, trờng Đại học Y Hà Nội. Đối tợng nghiên cứu là cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L) (thân, lá) đợc thu hái vào đầu mùa thu (tháng 7/2006) tại xã ngoại thành Hà Nội.

Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, chủng Swiss, giống đực, cân nặng 18-22 g, do Viện Vệ sinh Dịch Tễ trung ơng cung cấp Chuột đợc nuôi tại Bộ môn Hóa sinh, trờng Đại học Y Hà Nội trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nớc uống, nhiệt độ và ánh sáng thích hợp.

2.1.3 Các thuốc và hóa chất dùng trong nghiên cứu

- Streptozotocin (STZ) do hãng Sigma-aldrich (Đức) sản xuất, là nhóm thuốc chống ung th, có tác dụng phá hủy tế bào β tuyến tụy để gây mô hình ĐTĐ trên chuột.

- Que thử định lợng glucose máu của hãng Johnson & Johnson (Mỹ).

- Và một số hóa chất khác đợc mua từ các hãng hóa chất nổi tiếng trên thế giới

- Máy cất quay chân không của hãng Buchi (Thụy sĩ).

- Cân phân tích chính xác 1/10 mg.

- Máy đo glucose máu One Touch TM Sure Step TM của hãng Johnson

- Màng lọc vô khuẩn minisart high-flow có đờng kính lỗ lọc là 0,2 àm của hãng Indochina.

- Máy đông khô Edwards của hãng BOC Edwards (Anh).

Phơng pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu đợc tiến hành theo sơ đồ sau:

Thử tác dụng hạ glucose máu

Phân đoạn bằng sắc ký

Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3

Thử tác dụng hạ glucose máu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.1 Quy trình tách chiết cây cam thảo đất:

Phơng pháp chiết xuất cây cam thảo đất dựa theo các tài iệu tham khảo của nớc ngoài đã đợc công bố.

Cam thảo đất (Scoparia dulcisL)

Hình 2.2 Quy trình tách chiết cây cam thảo đất

Cây cam thảo đất đợc thu hoạch vào đầu mùa thu Toàn thân và lá của cây cam thảo đất đã sấy khô (500 g) đợc ngâm trong 1,5 lít nớc nóng, 3 lần,lọc bỏ bã và cặn Dịch chiết thu đợc cất quay chân không ở 60 o C thu đợc dịch chiết đạng cao mềm.

Các loại cao chiết đợc bảo quản ở 2-4 o C, trớc khi sử dụng đem ra để ở nhiệt độ phòng, hòa tan bằng nớc muối sinh lý, lọc vô khuẩn bằng màng lọc 0,2 àm rồi đem tiêm cho chuột nhắt trắng thực nghiệm theo quy trình chuÈn.

2.2.2.1 Gây ĐTĐ thực nghiệm trên chuột nhắt trắng

STZ là kháng sinh có khả năng tiêu hủy các khối u và gây ĐTĐ Tác dụng gây ĐTĐ của STZ là do phá hủy chọn lọc tế bào β tuyến tụy làm tổn thơng màng tế bào Hiện nay, STZ là thuốc đang đợc sử dụng rộng rãi gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm.

Theo các tác giả, liều STZ gây ĐTĐ thay đổi tùy loài và chủng động vật Trên chuột nhắt, liều dao động 50 mg/kg – 70 mg/kg – 150 mg/kg hay 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg là liều có thể gây ĐTĐ ở các mức độ khác nhau.

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng STZ với các liều khác nhau từ 100 mg/kg đến 300 mg/kg đối với chuột nhắt trắng để phá hủy tế bào β gây mô hình ĐTĐ trên chuột.

Chuột đợc định lợng glucose máu trớc khi tiêm STZ (tiêm màng bụng), đợc chia thành 5 nhóm :

Nhãm 1 : Tmb NaCl 0,9% víi liÒu 0,1 ml/10 g chuét.

Nhãm 2 : Tmb STZ liÒu 100 mg/kg chuét.

24 và 48 giờ sau, định lợng glucose máu ở các nhóm chuột Trên cơ sở thăm dò này, chúng tôi gây ĐTĐ ở các chuột dùng trong thí nghiệm Chỉ những con chuột đạt mức tăng glucose máu theo yêu cầu mới đợc sử dụng trong nghiên cứu này.

2.2.2.2 Nghiên cứu tác dụng HGM của dịch chiết cây cam thảo đất ở chuột nhắt trắng bình thờng

Chuột đợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 con : nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9%. nhóm 2: Tiêm màng bụng dịch chiết cam thảo đất liều 300 mg/kg chuộtChuột ở cả hai nhóm đợc tiêm cùng một thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng Glucose máu đợc định lợng tại các thời điểm 0 giờ (trớc khi tiêm dịch chiết cam thảo đất), 2 giờ, 4 giờ, và 8 giờ sau khi tiêm dịch chiết cam thảo đất.

Chuột nhắt trắng bình th ờng (20g 2g) Định l ợng glucose máu (0 giờ)

Tiêm màng bụng Định l ợng glucose máu sau 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ

Hình 2.3 Khảo sát tác dụng HGM của dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng

2.2.2.3 Nghiên cứu tác dụng HGM của dịch chiết cây cam thảo đất ở chuột nhắt trắng ĐTĐ thực nghiệm

Chuột nhắt trắng đợc tiêm STZ liều 200 mg/kg thể trọng, sau 48 giờ định lợng glucose máu, những con chuột có nồng độ glucose máu > 10 mmol/ l đợc coi là bị ĐTĐ và đợc dùng cho nghiên cứu

Chuột đợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 con : nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9%. nhóm 2: Tiêm màng bụng dịch chiết cam thảo đất liều 300 mg/kg chuột.Glucose máu đợc định lợng tại các thời điểm 0 giờ (trớc khi tiêm dịch chiết cam thảo đất), 2 giờ, 4 giờ, và 8 giờ sau khi tiêm dịch chiết cam thảo đất.

Chuột gây ĐTĐ bằng STZ 200mg/kg Định l ợng glucose máu (0 giờ)

Hình 2.4 Khảo sát tác dụng HGM của dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ

2.2.2.4 Phân đoạn dịch chiết cây cam thảo đất và nghiên cứu tác dụng HGM của các phân đoạn dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng b×nh thêng

Dịch chiết cam thảo đất đợc phân tách thành các phân đoạn khác nhau để thử tác dụng HGM của từng phân đoạn đó Việc phân đoạn dịch chiết cam thảo đất đợc làm tại Viện Hóa học Quy trình phân đoạn nh sau:

Bột khô cây Cam thảo đất (1 kg) đợc chiết 3 lần bằng axit axetic 5% trong metanol ở nhiệt độ 50 o C Các dịch chiết cây Cam thảo đất đợc gộp lại và loại dung môi dới áp suất giảm, thu đợc dịch chiết Bổ sung 3 lít nớc cất vào dịch chiết này, sau đó chiết phân bố lần lợt với các dung môi tăng dần độ phân cực từ n-hexan, clorofoc, etylaxetat, n-butanol để loại phần lớp chất không chứa Ancaloit Lớp nớc chứa Ancaloit còn lại sau quá trình chiết này đợc trung hòa bằng NH4OH sau đó chiết lấy ancaloit bằng dung môi clorofooc(B)

Quá trình chiết chi tiết đợc thể hiện theo sơ đồ sau:

Quy trình chiết Cam thảo Đất

EtOAc: Dung môi Ethylaxetat n – BuOH : Dung môi n - Butanol

Hình 2.3 Sơ đồ phân đoạn của bột chiết cây cam thảo đất

2.2.2.5 Nghiên cứu tác dụng HGM của các phân đoạn dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng

Chuột đợc chia thành 4 nhóm, mỗi 7 nhóm con đợc tiêm màng bụng víi liÒu 300mg/kg chuét: nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9%

Cam thảo đất (toàn thân)

(1 kg) Thêm 0,75 lít nớc cất

Dịch chiết cam thảo đất

Bổ sung 3 lít nớc ChiÕt n -Hexan/níc: 1/1

Líp níc Líp níc nhóm 2:Tiêm màng bụng phân đoạn 1 nhóm 3:Tiêm màng bụng phân đoạn 2 nhóm 4:Tiêm màng bụng phân đoạn 3

Chuột ở cả 4 lô đợc tiêm cùng một thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng

Glucose máu đợc định lợng tại các thời điểm 0 giờ (trớc khi tiêm dịch chiết cam thảo đất), 2 giờ, 4 giờ, và 8 giờ sau khi tiêm dịch chiết cam thảo đất.

Chuột nhắt trắng bình th ờng (20g 2g) Định l ợng glucose máu (0 giờ)

Hình 2.5 Khảo sát tác dụng HGM của các phân đoạn của dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng

2.2.2.6 Phân tích sơ bộ thành phần của phân đoạn dịch chiết cây cam thảo đất có tác dụng hạ glucose máu

Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần của phân đoạn dịch chiết cây cam thảo đất có tác hạ glucose máu tại phòng thí nghiệm Viện Hoá học Việt nam.

Sau khi thử tác dụng hạ glucose máu của từng phân đoạn , ta chọn ra phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu và tiến hành phân tích sơ bộ thành phần của phân đoạn đó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và khối phổ (LC-MS).

Máy LC-MS: LC/MSD- Trap 1100 Agilent (USA).

Hệ dung môi: H2O/MeOH 35 phút H2O/MeOH

2.2.3 Các kỹ thuật xử dụng Định lợng glucose máu

Phơng pháp xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu đợc xử lý theo thuật toán thống kê y sinh học bằng phần mềm Epi-Info 6.04.

Các phép so sánh có P < 0,05 đợc coi là có ý nghĩa thống kê.

Chương 3 Kết Quả nghiên cứu

3.1 Kết quả thăm dò liều STZ gây ĐTĐ trên chuột nhắt trắng

Bảng 3.1 Tác dụng gây tăng glucose huyết của STZ trên chuột nhắt trắng với các liều khác nhau tại các thời điểm khác nhau

Nồng độ glucose máu (mmol/l)

2 STZ 100 mg/kg thể trọng 6.8 ± 0.4 7.6 ± 0.4 8.2 ± 0.3

Biểu đồ 3.1 Nồng độ glucose máu ở các nhóm chuột gây ĐTĐ theo liều l- ợng STZ và theo thời gian

Nhận xét : So với nhóm chứng đợc tiêm NaCl 0,9% thấy:

- STZ liều 100mg/kg thể trọng qua đờng tiêm màng bụng sau 24 và 48 giờ, nồng độ glucose máu tăng nhng không đáng kể(mức đờng huyết < 10 mmol/l).

STZ 100mg/kgSTZ 200mg/kgSTZ 250mg/kgSTZ 300mg/kg

- STZ liều 200 mg/kg thể trọng, 24 giờ sau tmb, nồng độ glucose máu tăng 35,5% (p < 0,05) và sau 48 giờ tăng 87% (p < 0,01)

- STZ liều 250 mg/kg thể trọng, 24 giờ sau tmb, nồng độ glucose máu tăng 168% (p < 0,01) và sau 48 giờ tăng 222% (p < 0,01).

- STZ liều 300 mg/kg thể trọng, chuột sút cân nhanh chóng, 24 giờ sau tmb, nồng độ glucose máu tăng 195% (p < 0,001) và sau 48 giờ tăng 254% (p < 0,001).

Từ kết quả thu đợc, chúng tôi quyết định chọn liều sử dụng STZ là 200 mg/kg thể trọng cho quy trình nghiên cứu thực nghiệm và tiến hành thử nghiệm 48 h sau khi tiêm STZ vào ổ bụng.

3.2 Tác dụng HGM của dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng

Chuột đợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 con

Nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9%

Nhóm 2: Tiêm màng bụng dịch chiết cam thảo đất liều 300 mg/kg chuột Chuột ở cả hai lô đợc tiêm cùng một thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng

Glucose máu đợc định lợng tại các thời điểm 0 giờ (trớc khi tiêm dịch chiết cam thảo đất), 2 giờ, 4 giờ, và 8 giờ sau khi tiêm dịch chiết cam thảo đất

Toàn bộ kết quả đợc trình bày ở bảng và đợc minh họa ở biểu đồ:

Bảng 3.2 Tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng theo đờng tiêm màng bụng

2 D ch chi t cam th o ịch chiết cam thảo ết cam thảo ảo đ ất t 5,6 0,2 ± 0,3 5,0 0,8 ± 0,3 3,1 0,4 ± 0,3 5,8 1,2 ± 0,3

Biểu đồ 3.2 Tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng NhËn xÐt : Đối chiếu với lô chuột bình thờng tiêm NaCl 0,9% chúng ta nhận thấy: Dịch chiết cam thảo đất với liều 300 mg/ kg gây hạ glucose máu sau 2 giờ là 10,7% và sau 4 giờ là 44,6% Nh vậy tác dụng HGM mạnh nhất của dịch chiết này đợc quan sát thấy là 44,6%.

3.3 Tác dụng HGM của dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ

Chuột nhắt trắng đợc tiêm STZ liều 200 mg/kg thể trọng, sau 48 giờ định l- ợng glucose máu, những con chuột có nồng độ glucose máu > 10mmol/l đợc coi là bị ĐTĐ và đợc dùng cho nghiên cứu

Chuột đợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 7 con :

N ồ n g đ ộ G lu co se ( m m o l/ l) nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9%. nhóm 2: Tiêm màng bụng dịch chiết cam thảo đất liều 300 mg/kg chuột Chuột ở cả hai nhóm đợc tiêm cùng một thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng

Bảng 3.3 Tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ theo đờng tiêm màng bụng

2 D ch chi t cam ịch chiết cam thảo ết cam thảo th o ảo đ ất t 300 mg/kg

Biểu đồ 3.3 Tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cây cam thảo đất trên chuột nhắt trắng ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ NhËn xÐt: Đối chiếu với lô chuột bình thờng tiêm NaCl 0,9% chúng ta nhận thấy:

Dịch chiết cây cam thảo đất với liều 300 mg/kg có tác dụng HGM sau

2 giờ là 21%, 4 giờ là 40,5% và sau 6 giờ là 49,5% Mức hạ tối đa của dịch chiết này là 49,5% (thời điểm sau 6 giờ).

3.4 Tác dụng HGM của các phân đoạn dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng

Chuột đợc chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm 7 con đợc tiêm màng bụng với liÒu 300mg/kg chuét: nhóm 1: Tiêm màng bụng NaCl 0,9% nhóm 2: Tiêm màng bụng phân đoạn 1 liều 300 mg/kg chuột. nhóm 3: Tiêm màng bụng phân đoạn 2 liều 300 mg/kg chuột. nhóm 4: Tiêm màng bụng phân đoạn 3 liều 300 mg/kg chuột.

Chuột ở cả 4 nhóm đợc tiêm cùng một thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng

Bảng 3.4 Tác dụng hạ glucose máu của các phân đoạn của dịch chiết cam thảo đất trên chuột nhắt trắng bình thờng theo đờng tiêm màng bụng

STT Nhóm Nồng độ glucose máu (mmol/l)

Các phân đoạn dịch chiết cam thảo đất có tác dụng HGM khác nhau.

Phân đoạn 1: Dịch chiết cam thảo đất bắt đầu có tác dụng HGM ở thời điểm 2 giờ (giảm 28,5%, p < 0,01), 4 giờ (giảm 36%, p < 0,01), 6 giờ (giảm 37,2%, p < 0,05%) Nh vậy, tác dụng mạnh nhất là ở thời điểm 6 giờ.

Phân đoạn 2: Có tác dụng mạnh nhất là giảm 18,3% nhng sự khác biệt ở cả 4 thời điểm 2,4,6 và 8 giờ đều không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Phân đoạn 3: Cũng giống nh ở phân đoạn 2, nồng độ glucose máu có giảm nhng không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Kết quả cho thấy phân đoạn 1 là phân đoạn có tác dụng gây hạ glucose máu

3.5 Phân tích sơ bộ thành phần của phân đoạn dịch chiết cây cam thảo đất có tác dụng hạ glucose máu tại phòng thí nghiệm Viện Hóa Việt nam

Sau khi thử tác dụng hạ glucose máu của từng phân đoạn, chúng tôi chọn ra phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu để tiến hành làm phân tích sơ bộ thành phần của phân đoạn đó bằng sắc ký lớp mỏng và khối phổ (LC-MS).

Kết quả phân tích phân đoạn 1 bằng LC-MS:

Phổ khối lợng (ESI-MS):

Phổ khối lợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) đợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam.

Với thời gian lu khác nhau, mẫu tổng (phân đoạn A-Chloroform) thu đ- ợc các pick ion positive phân tử có số khối tơng ứng Quan sát các tín hiệu trên phổ khối lợng ESI xuất hiện các tín hiệu ion bền tại mlz: [219,1], [240], [256,1], [274,1], [282,1], [302,9], [318,8], [334,0], [360,0], [380,8], [391,0], [415,0], [448,8], [470,8], [486,6], [494,3], [ 511,2], [522,3], [537,2], [550,4], [564,2], [582,9] m/z Các tín hiệu này phần nào cho chúng ta biết đợc hàm l- ợng các chất trong phân đoạn với các nồng độ khác nhau, tùy theo chiều cao các pick ion ở cùng điều kiện khảo sát.

Các pick ion nagative thu đợc có số khối tơng ứng: [300,7], [314,7], [447,0], [462,9], [482,8], [498,7], [506,7], [598,7] m/z Nh vậy, với các pick ion thu đợc khả năng chọn lọc của phơng pháp chiết đợc khẳng định.

Sử dụng chọn lựa các dung môi chiết tối u hóa tăng hiệu suất phân đoạn cần thiÕt.

Kết quả nghiên cứu

Kết quả thăm dò liều STZ gây ĐTĐ trên chuột nhắt trắng