Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen các mẫu giống cây nghệ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN CÁC MẪU GIỐNG CÂY NGHỆ Sinh viên : Kiều Thùy Dung Mã sinh viên : 614065 Lớp : K61-CNSHB Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : GS.TS Phan Hữu Tôn Hà Nội - 2021   LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây cơng trình nghiên cứu khoa học thực hướng dẫn GS.TS Phan Hữu Tơn Tồn tất nghiệm đề tài tơi thực Tồn số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tồn thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn trích dẫn rõ nguồn gốc, theo quy định giúp đỡ cho luận văn cảm ơn   i LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành với quan tâm giúp đỡ thầy cô, anh chị bạn Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Thầy GS.TS Phan Hữu Tôn - giảng viên môn Sinh học phân tử công nghệ sinh học ứng dụng Trung tâm bảo tồn phát triển nguồn gen trồng, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện để em thực khóa luận này, người thầy tận tụy truyền đạt kinh nghiệm quý báu suốt trình làm đề tài Em xin cảm ơn thầy nhiều! Tôi xin chân thành cảm ơn cán công nhân viên thuộc Trung tâm bảo tồn phát triển nguồn gen trồng – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ suốt q trình tơi thực tập Trung tâm Đơng thời xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn công nghệ sinh học, thầy cô trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam dạy truyền đạt cho em bạn kiến thức quý báu suốt năm học qua Cuối xin chân thành cảm ơn người thân, bạn bè hết lịng giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập hồn thành báo cáo Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên   ii năm 2021 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TÓM TẮT viii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Vai trò thị phân tử việc đánh giá tính đa dạng di truyền dịng giống Chương 2: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn gốc hình thành, phân loại khoa học đặc điểm hình thái nghệ 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại khoa học 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.2 Giá trị dinh dưỡng tác dụng dược lí nghệ 2.2.1 Giá trị dinh dưỡng 2.2.2 Tác dụng dược lý nghệ 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên chất lượng củ nghệ 2.3.1 Cách trồng chăm sóc nghệ 2.3.2 Thời vụ trồng 2.3.3 Thu hoạch bảo quản   iii 2.4 Tình hình phát triển phân bố nghệ Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 12 3.3 Nội dung nghiên cứu 12 3.4 Phương pháp nghiên cứu 12 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 12 3.4.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học 13 3.4.3 Trích DNA, phân tích RAPD-PCR ISSR-PCR 13 3.4.4 Phân tích số liệu 16 Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 4.1 Đánh giá số tiêu nông sinh học cá thể chọn 17 4.1.1 Đặc điểm củ 17 4.1.2 Đặc điểm thân - 17 4.2 Kết tách chiết DNA 20 4.3 Sự đa dạng di truyền dựa thị phân tử RAPD 20 4.4 Sự đa dạng di truyền dựa thị phân tử ISSR 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 5.1 Kết luận 26 5.2 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27   iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT   PCR : Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại gen RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple Sequence Repeats EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid TE : Tris – EDTA DNA : Deoxyribo Nucleic Acid CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tên mẫu ký hiệu 25 mẫu nghệ 11 Bảng 3.2 Sự đa dạng 13 đặc tính hình thái mẫu nghệ 13 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng RAPD-PCR ISSR- PCR 14 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng RAPD-PCR ISSR-PCR 15 Bảng 3.5 Các loại mồi RAPD dùng PCR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 25 mẫu nghệ 15 Bảng 3.6 Các loại mồi ISSR dùng PCR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 25 mẫu nghệ 16 Bảng 4.1 Bảng đánh giá đa dạng 13 đặc tính 25 mẫu nghệ 18 Bảng 4.2 Hệ số tương quan 13 mẫu nghệ dựa thị RAPD 21 Bảng 4.3 Hệ số tương quan 13 mẫu nghệ dựa thị ISSR 24   vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây nghệ Hình 2.2 Một vài phận nghệ Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số 20 Hình 4.2 Phổ điện di đoạn mồi OPB07 13 mẫu nghệ 21 Hình 4.3 Sơ đồ hình nhánh dựa hệ số tương đồng di truyền 13 mẫu nghệ dựa mồi RAPD 22 Hình 4.4 Phổ điện di đoạn mồi ISSR6 13 mẫu nghệ 23 Hình 4.5 Sơ đồ hình nhánh dựa hệ số tương đồng di truyền 13 mẫu nghệ dựa mồi ISSR 24   vii TÓM TẮT Sau tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen mẫu giống nghệ” Tôi tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái nơng sinh học 25 mẫu giống nghệ bao gồm: đặc điểm củ (chiều dài củ, chiều rộng củ, màu sắc củ, số lượng chi nhanh củ, mùi hương củ, hương vị củ), đặc điểm thân (màu thân, dạng thân, chiều cao thân, mức độ nảy chồi), đặc điểm (màu sắc lá, chiều dài lá, chiều rộng lá, chiều dài cuống lá, đặc điểm gân lá, sọc tím chạy phiếm lá); đồng thời sử dụng thị phân tử PCR-RAPD PCR-ISSR để đánh giá mức độ đa dạng mẫu nghệ vật liệu nghiên cứu đề tài Thông qua kết quả, thấy sử dụng đoạn mồi RAPD đoạn mồi ISSR để phân tích đa dạng di truyền mẫu giống nghệ cho tỉ lệ đa hình cao   viii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây nghệ cịn có tên gọi Khương hồng (tên khoa học Curcuma domestica Lour.), thuộc họ gừng (Zingiberaceae) Cây nghệ xuất nhiều sống ngày, nghệ thường dùng làm gia vị ăn, nghệ dùng nhiều việc làm đẹp chăm sóc sức khỏe Củ nghệ có tác dụng tốt cho sức khỏe, đặc trưng hoạt chất curcumin Đây chất chống oxy hóa chống viêm mạnh mẽ Ngồi ra, chữa trị nhiều triệu chứng như: Diệt khuẩn, phòng ngừa ung thư đại tràng, ung thư gan, điều trị đau dày, đau bụng… Nghệ cung cấp nhiều vitamin, khoáng chất như: Vitamin C, K, E, Kali, canxi, sắt… cịn nhiều chất chống oxy hóa, kháng viêm Nghệ phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới châu Á như: Ấn Độ, Campuchia, Lào Thái Lan Ở Việt Nam, nghệ trồng hầu khắp tỉnh Nghệ trồng quanh năm, trồng mà khơng tính tốn tận dụng điều kiện thời tiết thuận lợi gây tốn chi phí không đạt hiệu cao Cây nghệ phù hợp với khí hậu ơn hịa, đất ẩm có nhu cầu lượng nước cao nên thích hợp trồng vào đầu mùa mưa: miền Bắc nghệ thường trồng vào tháng 2-4 tháng 11-12 khu vực miền Nam thời tiết có nhiều độ ẩm, thời điểm dụng lượng nước mưa, thuận lợi cho nghệ sinh trưởng phát triển Hiện nay, nhu cầu củ nghệ sản phẩm từ nghệ thị trường săn đón cơng dụng tuyệt vời Để gia tăng giá trị, hiệu khai thác chất dược liệu sử dụng bền vững nghệ, cần thiết phải đánh giá tiềm đa dạng di truyền nguồn gen nghệ nơi chúng sinh trưởng phát triển, làm sở cho việc thu thập, chọn lọc cải tiến dịng, giống có Chính vậy, thực đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen mẫu giống nghệ” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá mức độ đa dạng di truyền dòng/giống mẫu giống nghệ   Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng RAPD-PCR ISSR-PCR Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây 40 Gắn mồi Tm 30 giây Tổng hợp 72 phút Tổng hợp 72 phút Bảo quản ∞ Phản ứng PCR thực máy PCR với thành phần (Bảng 3.3) chu kỳ gia nhiệt (Bảng 3.4) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% dung dịch TAE 1X máy điện di Sau gel nhuộm với dung dịch ethidium bromide 10 phút chụp hình đèn UV Bảng 3.5 Các loại mồi RAPD dùng PCR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 25 mẫu nghệ STT Mồi RAPD Đoạn trình tự 5’- 3’ OPA03 AGTCAGCCAC Kích thước phân tử 400 - 4.000 Tài liệu tham khảo Dựa nghiên cứu Bùi Thị Cẩm Hường (2016) Khảo sát đa dạng di OPA07 GGTGACGCAG 300 - 8.000 truyền số giống nghệ miền nam Việt Nam dựa thị   OPA10 CTGCTGGGAC 500 - 4.000 15 phân tử RAPD ISSR Bảng 3.6 Các loại mồi ISSR dùng PCR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 25 mẫu nghệ STT Mồi ISSR Kích thước Đoạn trình tự 5’- 3’ Tài liệu tham khảo phân tử Dựa nghiên cứu Bùi ISSR6 (CT)8 480 - 5.000 Thị Cẩm Hường (2016) Khảo sát đa dạng di ISR10 340 - 2.800 truyền số giống (CAC)4AC nghệ miền nam Việt Nam ISSR17 (GA)8C 400 - 3.000 dựa thị phân tử RAPD ISSR 3.4.4 Phân tích số liệu Đối với thị ISSR, xuất không xuất băng DNA gel ghi nhận tương ứng Sau ghi nhận tất băng mẫu giống, số liệu thu nhập lưu trữ phần mềm Excel Phân tích sơ đồ (Cluster) đánh giá mối quan hệ di truyền giống dựa ma trận hệ số tương đồng (Similarity coefficient) phần mềm NTSYS pc v2.1 Sử dụng hệ số tương quan jarrad để xây dựng bảng hệ số tương quan mẫu nghệ nghiên cứu xây dựng phân loại 𝑟   ∑ ∑ 𝑥 𝑥 𝑥̅ 𝑦 𝑥̅ 16 ∑ 𝑦 𝑦 𝑦 Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Đánh giá số tiêu nông sinh học cá thể chọn 4.1.1 Đặc điểm củ Trong số đặc điểm hình thái củ tính trạng có số alen cao màu sắc củ mùi hương Hai tính trạng với tính trạng hương vị củ, góp phần quan trọng giúp phân biệt cá thể nghệ khảo sát Kết cho thấy phần lớn củ nghệ có màu vàng cam (36%); chiều dài củ < 5,69 cm (chiếm khoảng 56%); chiều rộng củ < 1,85 (chiếm tỉ lệ 64%); số lượng chia nhánh củ < nhánh (60%); có mùi đặc trưng nghệ nồng (64%); có vị cay nhẹ (68%) 4.1.2 Đặc điểm thân - Qua kết khảo sát cho thấy, số đặc điểm hình thái có tính trạng có số alen cao chiều dài lá/chiều rộng chiều dài cuống lá/chiều dài Phần lớn nghệ có màu xanh nhạt (56%); tỉ lệ chiều dài lá/chiều rộng