Khóa luận tốt nghiệp đánh giá dòng cà chua được chỉnh sửa gen mã hóa protein g alpha

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ĐÁNH GIÁ DÒNG CÀ CHUA ĐƯỢC CHỈNH SỬA GEN MÃ HÓA PROTEIN G ALPHA (Gα)” Sinh viên thực : TRẦN QUỐC VIỆT Lớp : K62-CNSHB Mã SV : 620559 Người hướng dẫn : TS NINH THỊ THẢO Bộ môn : Công nghệ sinh học thực vật HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Trần Quốc Việt i  LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn tận tình thầy Bộ môn cố gắng thân, em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Lời em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô TS Ninh Thị Thảo, người trực tiếp giúp đỡ, hướng dẫn sát để em hồn thành khóa luận Cơ giúp em tích lũy nhiều kiến thức khơng để làm khóa luận mà cịn lời khun bổ ích trường Em xin bày tỏ lịng cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Sinh học Thực vật tồn thể thầy Khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa luận Em xin cảm ơn gia đình bạn bè sát cánh bên em suốt quãng thời gian sinh viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Trần Quốc Việt ii  MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined TÓM TẮT iv MỤC LỤC iii PHẦN I MỞ ĐẦU i 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2.1 Giới thiệu chung G protein 2.1.1 Cấu tạo chế hoạt động G protein 2.1.2 Các tiểu đơn vị G protein 2.1.3 Chức G protein 2.1.4 Chức tiểu đơn vị Gα thực vật 2.2 Kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thực vật 2.2.1 Giới thiệu chung kỹ thuật CRISPR/cas9 2.2.2 Ứng dụng CRISPR/Cas9 2.2.3 Thành tựu kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 cà chua Error! Bookmark not defined PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.2 Nội dung nghiên cứu 12 3.2.1 Nội dung Đánh giá khả nảy mầm cà chua tga1 12 3.2.1 Nội dung Đánh giá phản ứng cà chua tga1 với chất điều tiết sinh trưởng auxin 13 iii  3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 14 3.4 Chỉ tiêu theo dõi 14 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 4.1 Khả nảy mầm hạt cà chua tga1 15 4.1.1 Khảo sát khả nảy mầm hạt cà chua tga1 điều kiện in vitro 15 4.1.2 Ảnh hưởng ABA đến khả nảy mầm hạt cà chua tga1 17 4.2 Đánh giá phản ứng với auxin ngoại sinh cà chua tga1 20 4.2.1 Ảnh hưởng α-NAA đến khả tạo rễ callus từ đoạn thân mô cà chua tga1 cà chua dại 21 4.2.2 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ callus từ đoạn thân mô cà chua tga1 cà chua dại 24 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Kiến nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 30 iv  DANH MỤC BẢNG Bảng 4.3 Tỷ lệ hạt nảy mầm môi trường bổ sung ABA giảm so với môi trường đối chứng 20 Bảng 4.4 Ảnh hưởng α-NAA đến tỷ lệ mẫu tạo rễ callus từ vật liệu đoạn thân mô cà chua 22 Bảng 4.5 Ảnh hưởng IAA đến tỷ lệ mẫu tạo rễ callus từ vật liệu đoạn thân mô cà chua 25 i  DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế hoạt động G protein Hình 4.1 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nảy mầm hạt cà chua tga1 hạt cà chua dại (WT) 16 Hình 4.2 Hạt cà chua nảy mầm môi trường MS sau ngày 17 Hình 4.3 Ảnh hưởng ABA đến khả nảy mầm hạt cà chua dại (trái) hạt cà chua tga1 (phải) 19 Hình 4.4 Đoạn thân cà chua WT (trái) đoạn thân cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường chứa 0,25 mg/l αNAA sau 10 ngày nuôi cấy 23 Hình 4.5 Mơ cà chua WT (trái) mô cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường bổ sung 1,0 mg/l α-NAA sau 10 ngày nuôi cấy 23 Hình 4.6 Đoạn thân cà chua WT (trái) đoạn thân cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường bổ sung 0,25 mg/l IAA sau 10 ngày nuôi cấy 26 Hình 4.7 Mơ cà chua WT (trái) mô cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường bổ sung 0,1 mg/l IAA sau 10 ngày nuôi cấy 26 ii  DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ GPCR G protein-coupled receptor Cs Cộng CRISPR/Cas Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein GTP guanosine triphosphate GDP guanosine diphosphate ABA Abscisic acid TALENs Transcription activator-like effector nucleases ZFNZ zinc finger nucleases DNA deoxyribonucleic acid RNA ribonucleic acid gRNA guide RNA MS Murashige and Skoog medium α-NAA α-Naphthylacetic axit IAA Indole acetic acid sgRNA Single-guide RNA iii  TÓM TẮT G protein gọi protein gắn kết nucleotide guanine, họ protein hoạt động "công tắc" phân tử bên tế bào tham gia vào việc truyền tín hiệu từ nhiều kích thích khác bên tế bào vào bên Các nghiên cứu thực vật cho thấy G protein có vai trị quan trọng phản ứng thích nghi với điều kiện bất lợi sinh học phi sinh học Các nghiên cứu chức G protein tiểu đơn vị alpha (Gα) thực vật chủ yếu thực mơ hình Arabidopsis thaliana số loài trồng khác lúa, ngô chưa tiến hành nghiên cứu cà chua Đề tài tiến hành nhằm đánh giá số đặc điểm sinh trưởng phát triển dòng cà chua chỉnh sửa gen mã hóa tiểu đơn vị Gα kỹ thuật CRISPR/Cas9 nhằm tìm hiểu chức gen Gα cà chua Kết thu cho thấy gen G tham gia vào đường tín hiệu ABA điều khiển trình nảy mầm hạt cà chua tham gia điều khiển đường tín hiệu hormone auxin cà chua iv  PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề G protein gọi protein gắn kết nucleotide guanine, họ protein hoạt động "công tắc" phân tử bên tế bào tham gia vào việc truyền tín hiệu từ nhiều kích thích khác bên ngồi tế bào vào bên Các G protein nằm tế bào hoạt hóa thụ thể ghép cặp G protein (G protein-coupled receptor-GPCR) nằm khắp màng tế bào Khi phân tử tín hiệu ngoại bào liên kết với miền GPCR nằm bên tế bào, GPCR chuyển từ trạng thái “không hoạt động” sang trạng thái “hoạt động” Sau miền GPCR nội bào hoạt hóa G protein đặc hiệu G protein kích hoạt loạt kiện truyền tín hiệu mà cuối dẫn đến thay đổi chức tế bào, “trả lời” tế bào với tín hiệu ngoại bào Thụ thể ghép cặp G protein G protein hoạt động để truyền tín hiệu từ chất kích thích sinh trưởng, chất dẫn truyền thần kinh yếu tố báo hiệu khác Các G protein điều hịa enzyme chuyển hóa, kênh ion, protein vận chuyển phần khác máy tế bào, kiểm soát phiên mã, vận động tế bào, q trình tiết chất, từ điều chỉnh hàng loạt chức khác thể (Neves cs., 2002) Các nghiên cứu thực vật cho thấy G protein có vai trị quan trọng phản ứng thích nghi với điều kiện bất lợi sinh học phi sinh học bệnh thực vật gây nấm, vi khuẩn, virus; ánh sáng cao, xạ UV, hạn hán, lạnh Chức G protein điều hòa thông qua thông tin thứ cấp axit salicylic, ethylene phân tử tín hiệu khác G protein cấu tạo tiểu đơn vị bao gồm đơn vị alpha (α), beta (β) gamma (γ) Trong đó, tiểu đơn vị β γ tạo thành phức kép ổn định gọi phức hợp beta-gamma Các nghiên cứu chức G protein tiểu đơn vị alpha (Gα) thực vật chủ yếu thực mơ hình Arabidopsis thaliana số loài trồng khác lúa, ngơ 1  Hình 4.4 Đoạn thân cà chua WT (trái) đoạn thân cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường chứa 0,25 mg/l α-NAA sau 10 ngày ni cấy Hình 4.5 Mơ cà chua WT (trái) mô cà chua tga1 (phải) cảm ứng tạo rễ callus môi trường bổ sung 1,0 mg/l α-NAA sau 10 ngày ni cấy Do vật liệu nghiên cứu thí nghiệm mô thực vật (đoạn thân mơ lá) hồn tồn khơng có chứa tế bào gốc rễ (root primordia), rễ cảm ứng tái sinh từ vật liệu rễ bất định việc hình thành rễ bất định hàm lượng auxin nội sinh có mẫu ảnh hưởng auxin ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy định Quan sát thí nghiệm chúng tơi nhận thấy xu hướng chung môi trường nuôi cấy, tỷ lệ mẫu đoạn thân mô cà chua đột biến chức gen G cảm ứng tạo rễ cho số lượng rễ/mẫu nhiều so với mẫu cà chua dại Kết khẳng định gen mã hoá tiểu đơn vị G 23  cà chua tham gia vào đường tín hiệu hormone auxin (cụ thể α-NAA thí nghiệm này) Do vậy, bất hoạt gen mã hoá protein G (1) thay đổi nồng độ auxin nội sinh (2) thay đổi mức độ nhạy cảm (nhạy cảm hơn) với auxin ngoại sinh đột biến 4.2.2 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ callus từ đoạn thân mô cà chua tga1 cà chua dại Tương tự thí nghiệm trên, thí nghiệm tiến hành với mục đích đánh giá phản ứng với auxin ngoại sinh, cụ thể IAA, từ vật liệu đoạn thân mô cà chua chuyển gen tga1 Bảng 4.5 trình bày kết tạo rễ bất định tạo callus từ đoạn thân mô cà chua chuyển gen tga1 cà chua dại nuôi cấy môi trường bổ sung IAA nồng độ từ 0-1,0 mg/l sau tuần nuôi cấy Tương tự kết ghi nhận trường hợp α-NAA, bổ sung IAA vào môi trường nuôi cấy làm tăng tỷ lệ mẫu đoạn thân tạo rễ, số rễ/mẫu tỷ lệ mẫu tạo callus Môi trường chứa 0,25 mg/l IAA môi trường cho tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt cao hai giống với 38,10% đoạn thân WT 52,10% đoạn thân cà chua đột biến tga1 tạo rễ; số rễ/mẫu đạt tương ứng 2,67 3,89; tỷ lệ mẫu tạo callus đạt tương ứng 7,68% 16,67% (Bảng 4.5) Bổ sung IAA nồng độ cao (0,5-1,0 mg/l), tỷ lệ mẫu tạo rễ hai giống giảm tương quan nghịch với nồng độ IAA, dù tỷ lệ tga1 cao WT (Bảng 4.5) Xu hướng mẫu tạo rễ callus số rễ/mẫu ghi nhận trường hợp mô môi trường bổ sung IAA tương tự môi trường bổ sung α-NAA Các mẫu mơ hồn tồn khơng tạo rễ nồng độ IAA thấp (0,1 mg/l) Tỷ lệ mô tạo rễ callus tăng tỷ lệ thuận với nồng độ IAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đạt cao môi trường chứa 1,0 mg/l IAA, tương ứng 27,78% mô WT 48,57% mô tga1 tạo rễ (Bảng 4.5) 24  Bảng 4.5 Ảnh hưởng IAA đến tỷ lệ mẫu tạo rễ callus từ vật liệu đoạn thân mô cà chua WT IAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu tga1 Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Đoạn thân 4,76a 0,33 0,00 33,33b 2,33 0,00 0,1 14,29a 1,00 5,56 38,57b 2,00 15,60 0,25 38,10a 2,67 7,68 52,10b 3,89 16,67 0,5 28,57a 2,00 0,00 36,67b 3,00 0,00 1,0 14,76a 0,33 0,00 24,60b 0,73 0,00 Mô 0,00a 0,00 0,00 0,00a 0,00 0,00 0,1 0,00a 0,00 0,00 0,00a 0,00 0,00 0,25 0,00a 0,00 0,00 9,52b 1,00 4,76 0,5 16,67a 1,00 4,76 24,29a 3,33 5,56 1,0 27,78a 1,67 5,56 48,57b 4,00 11,11 Các chữ khác hàng thể sai khác WT tga1, p 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,60 Adj R² 0,44 CV 41,85 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 53,73 13,43 3,73 0,0415 Nong 53,73 13,43 3,73 0,0415 Error 36,00 10 3,60 Total 89,73 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=3,45182 Error: 3,6000 df: 10 Nong Means n S.E 0,00 1,67 1,10 A 0,10 3,00 1,10 A B 1,00 5,33 1,10 B 0,25 6,00 1,10 B 0,50 6,67 1,10 C C C Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 30  WT Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,37 Adj R² 0,12 CV 132,64 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 15,07 3,77 1,49 0,2777 Nong 15,07 3,77 1,49 0,2777 Error 25,33 10 2,53 Total 40,40 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=2,89563 Error: 2,5333 df: 10 Nong Means n S.E 1,00 0,00 0,92 A 0,50 0,33 0,92 A 0,00 1,00 0,92 A 0,10 2,00 0,92 A 0,25 2,67 0,92 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,31 Adj R² 0,04 CV 106,14 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 28,00 7,00 1,14 0,3916 Nong 28,00 7,00 1,14 0,3916 Error 61,33 10 6,13 Total 89,33 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=4,50552 Error: 6,1333 df: 10 Nong Means n S.E 1,00 0,00 1,43 A 0,50 2,00 1,43 A 0,10 2,33 1,43 A 0,00 3,33 1,43 A 0,25 4,00 1,43 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 31  Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ α-NAA đến khả tạo rễ từ mô Tga1 Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,26 Adj R² 0,00 CV 54,13 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 21,60 5,40 0,87 0,5142 Nong 21,60 5,40 0,87 0,5142 Error 62,00 10 6,20 Total 83,60 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=4,52994 Error: 6,2000 df: 10 Nong Means n S.E 0,10 3,00 1,44 A 0,00 4,00 1,44 A 0,50 4,00 1,44 A 1,00 6,00 1,44 A 0,25 6,00 1,44 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,55 Adj R² 0,36 CV 223,61 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 2,40 0,60 3,00 0,0723 Nong 2,40 0,60 3,00 0,0723 Error 2,00 10 0,20 Total 4,40 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=0,81360 Error: 0,2000 df: 10 Nong Means n S.E 1,00 0,00 0,26 A 0,50 0,00 0,26 A 0,25 0,00 0,26 A 0,00 0,00 0,26 A 0,10 1,00 0,26 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 32  WT Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,77 Adj R² 0,68 CV 96,82 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F Model 81,60 20,40 8,50 Nong 81,60 20,40 8,50 Error 24,00 10 2,40 Total 105,60 14 p-value 0,0029 0,0029 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=2,81840 Error: 2,4000 df: 10 Nong Means n S.E 1,00 0,00 0,89 A 0,50 0,00 0,89 A 0,00 0,00 0,89 A 0,10 2,00 0,89 A 0,25 6,00 0,89 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² nd Adj R² nd CV nd Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 0,00 0,00 nd nd Nong 0,00 0,00 nd nd Error 0,00 10 0,00 Total 0,00 14 33  Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả tạo rễ từ đoạn thân Tga1 Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,61 Adj R² 0,46 CV 77,58 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 54,93 13,73 3,96 0,0352 Nong 54,93 13,73 3,96 0,0352 Error 34,67 10 3,47 Total 89,60 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=3,38729 Error: 3,4667 df: 10 Nong Means n S.E 0,00 0,00 1,07 A 1,00 0,67 1,07 A 0,10 2,67 1,07 A B 0,25 3,33 1,07 A B 0,50 5,33 1,07 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,22 Adj R² 0,00 CV 143,75 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 4,93 1,23 0,69 0,6183 Nong 4,93 1,23 0,69 0,6183 Error 18,00 10 1,80 Total 22,93 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=2,44080 Error: 1,8000 df: 10 Nong Means n S.E 0,00 0,00 0,77 A 0,50 0,67 0,77 A 0,25 1,00 0,77 A 1,00 1,33 0,77 A 0,10 1,67 0,77 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 34  WT Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,47 Adj R² 0,25 CV 116,96 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 33,33 8,33 2,19 0,1431 Nong 33,33 8,33 2,19 0,1431 Error 38,00 10 3,80 Total 71,33 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=3,54641 Error: 3,8000 df: 10 Nong Means n S.E 0,50 0,00 1,13 A 1,00 0,00 1,13 A 0,00 1,67 1,13 A 0,25 3,33 1,13 A 0,10 3,33 1,13 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,33 Adj R² 0,06 CV 157,65 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 9,07 2,27 1,21 0,3639 Nong 9,07 2,27 1,21 0,3639 Error 18,67 10 1,87 Total 27,73 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=2,48559 Error: 1,8667 df: 10 Nong Means n S.E 0,50 0,00 0,79 A 1,00 0,00 0,79 A 0,10 1,00 0,79 A 0,25 1,33 0,79 A 0,00 2,00 0,79 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 35  Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả tạo rễ từ mô Tga1 Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,59 Adj R² 0,42 CV 73,72 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F Model 63,07 15,77 3,53 Nong 63,07 15,77 3,53 Error 44,67 10 4,47 Total 107,73 14 p-value 0,0481 0,0481 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=3,84493 Error: 4,4667 df: 10 Nong Means n S.E 0,00 0,33 1,22 A 0,50 1,00 1,22 A 0,25 3,00 1,22 A B 0,10 4,00 1,22 A B 1,00 6,00 1,22 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,25 Adj R² 0,00 CV 306,19 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 2,27 0,57 0,85 0,5251 Nong 2,27 0,57 0,85 0,5251 Error 6,67 10 0,67 Total 8,93 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=1,48543 Error: 0,6667 df: 10 Nong Means n S.E 1,00 0,00 0,47 A 0,10 0,00 0,47 A 0,00 0,00 0,47 A 0,25 0,33 0,47 A 0,50 1,00 0,47 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 36  WT Analysis of variance So re Variable So re N 15 R² 0,24 Adj R² 0,00 CV 282,29 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 7,07 1,77 0,78 0,5634 Nong 7,07 1,77 0,78 0,5634 Error 22,67 10 2,27 Total 29,73 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=2,73899 Error: 2,2667 df: 10 Nong Means n S.E 0,10 0,00 0,87 A 0,50 0,00 0,87 A 1,00 0,00 0,87 A 0,00 1,00 0,87 A 0,25 1,67 0,87 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) So callus Variable So callus N 15 R² 0,23 Adj R² 0,00 CV 273,86 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 0,40 0,10 0,75 0,5801 Nong 0,40 0,10 0,75 0,5801 Error 1,33 10 0,13 Total 1,73 14 Test:Fisher LSD Alpha:=0,05 LSD:=0,66430 Error: 0,1333 df: 10 Nong Means n S.E 0,50 0,00 0,21 A 0,10 0,00 0,21 A 1,00 0,00 0,21 A 0,25 0,33 0,21 A 0,00 0,33 0,21 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0,05) 37