Luận văn nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase củavi sinh vật mớiđược phân lập từ vỏ tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN - TRƯƠNG HOÀNG XUÂN THÙY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE CỦA VI SINH VẬT MỚI ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ VỎ TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ SÀI GỊN - TRƯƠNG HOÀNG XUÂN THÙY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE CỦA VI SINH VẬT MỚI ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ VỎ TÔM Luận văn Thạc sĩ chuyên nghành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Hoàng Kim Anh TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG XÉT DUYỆT TP Hồ Chí Minh, ngày _ _ tháng _ _ năm 201_ TM HỘI ĐỒNG XÉT DUYỆT (Ký, ghi rõ họ tên, chức vụ) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Học viên Trương Hoàng Xuân Thùy LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lời cảm ơn Luận văn thực phòng thí nghiệm Cơng Ty TNHH Khoa Học Và Cơng Nghệ Sài Gịn hướng dẫn PGS.TS Hồng Kim Anh Đầu tiên, xin chân thành cám ơn PGS.TS Hoàng Kim Anh người tạo điều kiện tốt nhất, bảo, giúp đỡ bước suốt q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy Cơng Ty TNHH Khoa Học Và Cơng Nghệ Sài Gịn tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập, nghiện cứu hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới cha mẹ, đồng nghiệp quan tạo điều kiện tốt nhất, động viên suốt trình học tập Cuối em xin cám ơn thầy cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cơ TP HỒ CHÍ MINH, ngày 03 tháng 10 năm 2018 Học viên thực Trương Hoàng Xuân Thùy LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tóm tắt Đề tài “ Nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase vi sinh vật phân lập từ vỏ tôm” thực phịng thí nghiệm Cơng Ty TNHH Khoa Học Và Cơng Nghệ Sài Gịn từ tháng đến tháng 10 năm 2018 Mục tiêu đề tài khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men chủng vi sinh vật phân lập, nhằm tìm mơi trường điều kiện thích hợp giúp vi sinh vật phát triển tổng hợp enzyme chitin deacetylase cao Đồng thời, đề tài thực việc so sánh chất lượng chitosan thu từ chitin sau xử lý enzyme thu sau q trình lên men, nhiệt hóa học chitosan thương phẩm bán thị trường Kết thí nghiệm bước đầu tìm mơi trường điều kiện thích hợp cho q trình lên men vi sinh vật tổng hợp enzyme chitin deacetylase phân lập từ vỏ tôm sau: môi trường lên men sử dụng nguồn carbon tinh bột, nguồn nito chiết xuất nấm men, nồng độ chitin bổ sung vào môi trường lên men 3.0%, pH môi trường lên men 6.0, nhiệt độ cho trình lên men 37oC thời gian lên men 48 Chitosan thu từ việc xử lý chitin enzyme CDA có đặc điểm như: độ deacetyl hóa, độ hòa tan, độ nhớt khối lượng phân tử tốt chitosan thu từ việc xử lý chitin nhiệt hóa học gần với chất lượng chitosan thương phẩm bán thị trường LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC: DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU: Đặt vấn đề: Mục tiêu nội dung nghiên cứu: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN: 1.1 Chitin: 1.3.1 Cấu tạo hóa học 1.3.2 Tính chất vật lý 10 1.3.3 Tính chất sinh học 10 1.2 Chitosan: 10 1.2.1 Tính chất hóa lý 11 1.2.2 Tính chất sinh học 11 1.2.3 Các tính chất khác chitosan 12 1.2.4 Công nghệ sản xuất chitosan: 13 1.2.5 Ứng dụng chitosan: 17 1.3 Enzyme chitin deacetylase từ vi sinh vật: 18 1.3.1 Cơ chế xúc tác: 19 1.3.2 Điều kiện hoạt động enzyme CDA: 20 1.3.3 Các nghiên cứu thu nhận enzyme CDA từ vi sinh vật 21 1.4 Tình hình nghiên cứu chitin – chitosan nước 22 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 22 1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước: 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM: 25 2.1 Thời gian địa điểm thực hiện: 25 2.2 Vật liệu: 25 2.2.1 Chủng vi sinh vật: 25 2.2.2 Hóa chất: 25 2.2.3 Thiết bị - dụng cụ: 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 27 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu: 27 2.3.2 Phương pháp định danh vi sinh vật: 28 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng yêu tố tới trình lên men 29 2.3.4 Phương pháp thu nhận chitosan từ chitin: 34 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu: 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: 39 3.1 Định danh vi sinh vật: 39 3.1.1 Định danh sơ bộ: 39 3.1.2 Định danh vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử: 43 3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố tới trình lên men thu nhận enzyme CDA: 45 3.2.1 Lựa chọn nguồn Carbon: 45 3.2.2 Lựa chọn nguồn Nitơ: 49 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ chitin: 51 3.2.4 Ảnh hưởng pH 53 3.2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ: 54 3.2.6 Ảnh hưởng thời gian lên men: 56 3.3 Ứng dụng enzyme CDA thu sau lên men để chuyển hóa chitin thành chitosan 58 3.3.1 Định tính có mặt chitosan 58 3.3.2 Độ deacetyl hóa 59 3.3.3 Độ hòa tan 60 3.3.4 Hiệu suất thu hồi chitosan: 61 3.3.5 Độ nhớt & khối lượng phân tử: 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị: 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 64 Tài liệu Tiếng Việt: 64 Tài liệu Tiếng Anh: 64 PHỤ LỤC: 67 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2-1 Môi trường lên men .31 Bảng 3-1 Kết thử nghiệm sinh hóa vi sinh vật phân lập từ vỏ tôm 40 Bảng 3-2 Hoạt độ enzyme CDA thu môi trường lên men sử dụng nguồn carbon gồm đường đơn đường đôi 45 Bảng 3-3 Hoạt độ enzyme CDA thu môi trường lên men sử dụng nguồn carbon polysaccharide 46 Bảng 3-4 Hoạt độ enzyme CDA thu môi trường lên men sử dụng nguồn nitơ nhóm hữu 49 Bảng 3-5 Hoạt độ enzyme CDA thu môi trường lên men sử dụng nguồn nitơ nhóm vơ 49 Bảng 3-6 Hoạt độ enzyme CDA tạo môi trường lên men bổ sung chất cảm ứng chitin 51 Bảng 3-7 Hoạt độ enzyme CDA tạo môi trường lên men sinh giá trị pH 53 Bảng 3-8 Hoạt độ enzyme CDA thu môi trường lên men nhiệt độ khảo sát 54 Bảng 3-9 Hoạt độ enzyme CDA tạo môi trường lên men khỏang thời gian đươc khảo sát 56 Bảng 3-10 Mức độ deacetyl hóa sản phẩm chitosan thu .59 Bảng 3-11 Độ hòa tan loại chitosan 60 Bảng 3-12 Hiệu suất thu hồi chitosan 61 Bảng 3-13 Độ nhớt khối lượng phân tử sản phẩm chitosan thu .61 Bảng PL-1 Kết đo quang phổ nồng độ chuẩn p-nitroaniline: .73 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 72 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Phụ lục C: Kết dựng đường chuẩn p-nitroaniline để xác định hoạt tính enzyme chitin deacetylase: Từ kết đo quang phổ chất chuẩn p-nitroaniline với nồng độ: 0, 10, 20, 30, 40, 50 % bước sóng λmax= 395nm, phương trình đường chuẩn p-nitroaniline sau: Bảng PL-1 Kết đo quang phổ nồng độ chuẩn p-nitroaniline: Nồng độ pnitroaniline 10 20 30 40 50 OD 0.150 0.258 0.393 0.540 0.675 0.8 0.7 y = 0.0134x + 0.0017 R² = 0.998 0.6 OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 Nồng độ p - nitroaniline Hình PL-1 Đường chuẩn p-nitroaniline Phương trình đường chuẩn p-nitroaniline: Y = 0.0134X + 0.0017 Trong đó: X: Nồng độ p-nitroaniline Y: Độ hấp thu quang phổ OD bước sóng 395nm 73 50 60 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Phụ lục D: Kết dựng đường chuẩn GlcN để xác định độ deacetyl hóa sản phẩm chitosan: Từ kết đo quang phổ chất chuẩn GlcN sau bổ sung thuốc thử ninhydrin với nồng độ chất chuẩn: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 bước sóng 570 nm, phương trình đường chuẩn GlcN sau: 1.4 y = 2.4877x + 0.0112 R² = 0.9952 1.2 OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ GlcN Hình PL-2 Đường chuẩn GlcN Phương trình đường chuẩn GlcN: Y = 2.4877X + 0.0112 Trong đó: X: Nồng độ GlcN Y: Độ hấp thu quang phổ OD bước sóng 570 nm 74 0.5 0.6 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Phụ lục E: Xử lý số liệu thống kê:  Khảo sát nguồn Carbon sử dụng cho môi trường lên men: 75 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 76 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Nguồn Nito sử dụng cho môi trường lên men: 77 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 78 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Nồng độ chitin bổ sung vào môi trường lên men: 79 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 80 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Giá trị pH môi trường lên men: 81 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 82 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Nhiệt độ trì trình lên men: 83 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 84 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP  Thời gian lên men: 85 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 86