Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm 21 (2) (2021) 100 113 100 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG SINH VI KHUẨN Propionibacterium acnes CỦA GEL MỒNG TƠI (Basella alba L ) VÀ DIẾP CÁ (Houttuynia cordat[.]
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 21 (2) (2021) 100-113 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG SINH VI KHUẨN Propionibacterium acnes CỦA GEL MỒNG TƠI (Basella alba L.) VÀ DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.) Phạm Thị Kiều Oanh*, Phan Nữ Hoàng Oanh, Hoàng Xuân Thế Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: phamoanh283@gmail.com Ngày nhận bài: 12/10/2020; Ngày chấp nhận đăng: 22/12/2020 TÓM TẮT Mụn trứng cá chứng rối loạn mãn tính phổ biến đơn vị tiết chất nhờn Vi khuẩn Propionibacterium acnes xem thủ phạm gây mụn trứng cá Hai vấn đề thường gặp điều trị mụn trứng cá tình trạng kháng thuốc tác dụng phụ chỗ Vì thế, sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật xem lựa chọn phù hợp để điều trị mụn trứng cá Cây mồng tơi (Basella alba L.) diếp cá (Houttuynia cordata Thunb) sử dụng rộng rãi thuốc dân gian để chữa bệnh mụn nhọt, viêm nhiễm da Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng ức chế Propionibacterium acnes hai loại cịn hạn chế Mục đích nghiên cứu khảo sát khả ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi - diếp cá Kết nghiên cứu cho thấy, giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) cao mồng tơi cao diếp cá 125 mg/mL 62,5 mg/mL Gel từ hỗn hợp cao mồng tơi - diếp cá ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes với đường kính vịng vơ khuẩn 15,3 ± 0,58 mm Từ khóa: Mồng tơi, diếp cá, Propionibacterium acnes, mụn trứng cá GIỚI THIỆU Mụn trứng cá chứng rối loạn mãn tính phổ biến đơn vị tiết chất nhờn Propionibacterium acnes (P acnes), loại vi khuẩn kỵ khí, gram dương, xem nguyên nhân gây mụn trứng cá Hai vấn đề phương pháp điều trị mụn trứng cá thơng thường tình trạng kháng thuốc kháng sinh tác dụng phụ chỗ Có nhiều phương pháp điều trị mụn hiệu Liệu pháp chỗ coi phương pháp điều trị tiêu chuẩn cho mụn trứng cá nhẹ trung bình Một số loại thuốc phổ biến bao gồm benzoyl peroxide, kháng sinh, retinoid axit salicylic Thuốc kháng sinh uống thích hợp để điều trị mụn trứng cá vừa nặng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh trị mụn khiến vi khuẩn kháng thuốc Tỷ lệ P acnes kháng với clindamycin, tetracycline, doxycycline erythromycin xảy nhiều nước giới Isotretinoin, nhóm retinoid, phương pháp điều trị hiệu cho mụn trứng cá nặng; nhiên, phải tránh áp dụng phương pháp điều trị có thai gây sẩy thai dị tật bẩm sinh [1] Về vấn đề này, dược liệu xem lựa chọn thay để phát triển sản phẩm với tác dụng phụ Cây mồng tơi có tên khoa học Basella alba L.thuộc họ Basellaceae [2] Theo đơng y, mồng tơi có tác dụng giải độc, nhiệt, hoạt tràng, chữa đại tiện bí kết, đại tiện xuất huyết, tiểu tiện khó, chữa kiết lỵ hiệu Ngồi ra, số nghiên cứu cịn cho biết mồng tơi cịn có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm,…[3] Đặc biệt nhiều nghiên cứu cho thấy mồng tơi chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học alkaloid, glycoside, saponin, tanin, terpenoids, 100 Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi… flavonoid,…[4] Cây diếp cá, tên khoa học Houttuynia cordata Thunb thuộc họ Lá giấp Saururaceae Trong đông y, diếp cá dùng trị mụn nhọt, trẻ lên sởi, viêm phổi phổi có mủ,… Ngồi ra, diếp cá có tác dụng quan trọng mặt y học chống bệnh bạch cầu, chống ung thư, chống oxy hóa tác dụng ức chế phản ứng phản vệ kích hoạt tế bào mast [5] Cây mồng tơi diếp cá có ý nghĩa quan trọng mặt y học nói chung tác dụng thẩm mỹ nói riêng, nhiên nghiên cứu tác dụng thẩm mỹ hai loài hạn chế Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn P acnes hỗn hợp gel làm từ cao chiết mồng tơi - diếp cá NGUYÊN/VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Ngun/vật liệu Các hóa chất mơi trường sử dụng thí nghiệm: ethanol 99,5o (Việt Nam), quercetin (QE), penicillin (Việt Nam), DMSO (dimethyl sulfoxide - Ðức) dùng để pha lỗng cao chiết mơi trường Triptic Soy Broth (Ấn Độ) sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Vi sinh vật sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Propionibacterium acnes Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Khu Cơng nghệ cao (Quận 9) cung cấp Vi khuẩn nuôi cấy kỵ khí 24 mơi trường Triptic Soy Agar (TSA) 37 °C Mồng tơi diếp cá mua nơi trồng xã Phạm Văn Hai, huyện Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp 2.2.1 Thu nhận cao chiết mồng tơi, diếp cá Lá thân mồng tơi với diếp cá sau thu hoạch rửa sạch, để nước, sấy khô nhiệt độ 55-60 °C xay thành bột Sau đó, 100 gram bột khô ngâm chiết 10 ngày nhiệt độ phòng với ethanol 99,5o theo tỷ lệ 1:10 (w/v), dịch chiết cô chân không 45-50 °C để đuổi cồn thu cao đặc Cao bảo quản °C 2.2.2 Đánh giá cao chiết mồng tơi, diếp cá 2.2.2.1 Phát nhóm chất thứ cấp dựa vào phản ứng tạo màu (Bảng 1) Bảng Định tính hợp chất cao chiết mồng tơi, diếp cá [6] Hợp chất định tính Thực phản ứng định tính Phenolic mL cao chiết + mL H2O + 2-3 giọt FeCl3 (5%) Tủa xanh đen Alkaloid mL cao chiết + 3-4 giọt thuốc thử mayer Tủa vàng Flavonoid mL + mL Pb(CH3COOH)2 (10%) Màu vàng Kết phản ứng 2.2.2.2 Định lượng flavonoid tổng theo Chang et al, 2002 [7] Flavonoid hợp chất có khả kìm hãm ngăn phân chia vi khuẩn, ức chế enzym transpeptidase ngăn chặn trình thành lập vách tế bào Diếp cá có chứa thành phần flavonoid phong phú, flavonoid đáng ý diếp cá kể đến quercetin, quercitrin, isoquercitrin 101 Phạm Thị Kiều Oanh, Phan Nữ Hoàng Oanh, Hoàng Xuân Thế Dựng đường chuẩn Quercetin: - Dung dịch cao chiết nồng độ 1mg/mL methanol - Dung dịch flavonoid chuẩn quercetin - đạt nồng độ 20; 40; 60; 80 100 µg/mL - Các dung dịch khác: AlCl3 10% CHCOOK 1M pha với nước Cách tiến hành: Lần lượt cho 0,5 mL dung dịch quercetin (nồng độ 20; 40; 60; 80 100 µg/mL) vào 1,5 mL MeOH, để phản ứng phút Sau đó, thêm tiếp 0,1 ml AlCl3 10% để phản ứng phút Cuối cùng, hỗn hợp thêm vào 0,1 mL CH3COOK 1M 2,8 mL nước cất, lắc để ổn định 45 phút nhiệt độ phòng Sau 45 phút, tiến hành đo độ hấp thụ bước sóng 415 nm máy quang phổ UV-VIS Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết đo OD (mật độ quang học dung dịch) ghi nhận tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để xác định hàm lượng flavonoid mẫu cao chiết Các mẫu cao chiết tiến hành tương tự với quercetin [6] Hàm lượng flavonoid tổng tính theo cơng thức: F = (c x V)/m Trong đó: F: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g cao chiết) c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (µg/mL) V: thể tích dịch chiết (mL) m: khối lượng cao chiết có thể tích V (g) 2.2.2.3 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn P acnes cao chiết mồng tơi, diếp cá Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Cao chiết mồng tơi pha loãng DMSO theo dãy nồng độ 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 mg/mL Cao chiết diếp cá pha loãng DMSO theo dãy nồng độ 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,813; 3,906 mg/mL Cả hai mẫu cao chiết khử trùng bằng màng lọc milipore 0,22 µm Ðối chứng âm DMSO, đối chứng dương penicillin 10 µg/mL Hút 200 µL môi trường TSB lỏng cho vào tube eppendorf (1,5 mL) Bổ sung thêm 250 µL dịch huyền phù vi khuẩn đạt mật số tương đương 104 CFU/mL Cuối cùng, bơm 50 µL cao chiết nồng độ khác nhau, đối chứng âm (DMSO) đối chứng dương (penicillin 10 µg/mL) Ủ kỵ khí 24 tube mẫu 37 oC Tiến hành đếm mật số vi khuẩn nồng độ khảo sát bằng phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường đĩa thạch [6] MIC giá trị mà nồng độ cao chiết thấp có khả ức chế tăng trưởng vi khuẩn MBC giá trị mà nồng độ cao chiết thấp có khả tiêu diệt vi khuẩn Khảo sát khả ức chế vi khuẩn P acnes cao chiết mồng tơi, diếp cá phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cao chiết mồng tơi, diếp cá pha dung dịch DMSO vô trùng với nồng độ 250 mg/mL; 125 mg/mL; 62,5 mg/mL Khả ức chế dòng vi khuẩn P acnes xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch có hiệu chỉnh theo Mounyr Balouiri, 2016 [8] Trải 100 µL dịch huyền phù vi khuẩn P acnes (106 CFU/mL) đĩa mơi trường TSA, sau đục giếng (đường kính mm), bơm 50 𝜇𝐿 cao chiết mồng tơi, diếp cá nồng độ khác vào giếng Đối chứng dương kháng sinh penicillin (10 µg/mL), đối chứng âm DMSO Sau đó, ủ kỵ khí 24 37 °C 102 Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi… Mỗi nồng độ cao chiết thí nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình Đường kính vịng vơ khuẩn tính theo cơng thức ĐK (mm) = D - d với D đường kính vịng trịn vơ khuẩn (mm) d đường kính giếng (d = mm) [8] 2.2.3 Đánh giá cao chiết hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Tạo cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá: chọn nồng độ thích hợp cao diếp cá, mồng tơi dựa vào kết mục 2.2.2.3 Tạo cao hỗn hợp theo tỷ lệ khác Đánh giá khả ức chế vi khuẩn P acnes cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá thực tương tự mục 2.2.2.3 2.2.4 Tạo gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Dựa kết mục 2.2.3, tạo gel từ cao hỗn hợp có khả ức chế dịng vi khuẩn P acnes tốt nhất, theo tỷ lệ khác Bảng Bảng thành phần tạo gel Thành phần Tỷ lệ (%) M.A M.B M.C M.D Cao hỗn hợp Carbome 940 0,4 0,4 0,4 0,4 Propylene glycol 3 3 Triethanolamine 1 1 94,6 91,6 88,6 95,6 100% 100% 100% 100% Nước vô trùng Tổng Hàm lượng thành phần tạo gel: propylene glycol, carbome 940, triethanolamine theo phụ lục số 03-MP Hội đồng mỹ phẩm ASEAN [9] Quy trình tạo gel: cho nước vô trùng, cao chiết, carbome 940 vào ống flacon, vortex phút, bổ sung propylene glycol, vortex phút, sau thêm triethanolamine vào dung dịch để tạo gel [10] 2.2.5 Đánh giá mẫu gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá 2.2.5.1 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn P acnes mẫu gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Khả ức chế vi khuẩn P acnes xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, thực tương tự mục 2.2.2.3 2.2.5.2 Đánh giá tính chất hóa lý, độ an toàn cho da gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Tính chất hóa lý Các cơng thức gel có chứa chất chiết từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá kiểm tra màu sắc, mùi, độ đồng pH Kết đánh giá dựa vào cảm quan 20 tình nguyện viên Độ pH xác định bằng cách hoà tan g gel 20 mL nước cất, tiến hành đo pH bằng máy đo pH [1] 103 Phạm Thị Kiều Oanh, Phan Nữ Hoàng Oanh, Hoàng Xuân Thế Đánh giá độ an toàn cho da Đánh giá độ kích ứng da áp dụng theo quy định Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT Ðối tượng thử nghiệm: chọn 20 tình nguyện viên có da bình thường, khỏe mạnh, không bị dị ứng da, không bị bệnh da Vùng thử mặt cánh tay Thực hiện: làm vùng da thử nghiệm bằng nước thường, phết sản phẩm gel lên vùng da thử nghiệm khoảng x cm Dùng bút đánh dấu loại sản phẩm thử nghiệm Sau 30 phút thử nghiệm, mức độ kích ứng da sản phẩm tính theo thang điểm Bảng 3, khung điểm từ - 0,5 xem khơng gây kích ứng da (kích ứng khơng đáng kể) Bảng Bảng điểm phản ứng da Mức độ kích ứng Loại kích ứng Điểm đánh giá Mức độ Kích ứng khơng đáng kể Mức độ Kích ứng nhẹ Mức độ Kích ứng vừa phải Mức độ Kích ứng nghiêm trọng - 0,5 0,5 - 2,5 2,5 - 5- 2.2.5.3 Đánh giá mức độ ổn định gel từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Các công thức gel kiểm tra mức độ ổn định bằng cách sử dụng chu trình đóng băng tan băng sáu chu kỳ Đối với chu kỳ, mẫu đóng gói ống nhựa, bảo quản °C 24 giờ, sau lưu trữ 30 °C 24 Sau hoàn thành sáu chu kỳ, công thức gel đánh giá tính chất hóa lý [1] 2.2.6 Xử lý số liệu Số liệu xử lý bằng phần mềm Excel, Statgraphics XV.I phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, thí nghiệm lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận cao chiết mồng tơi, diếp cá Nồng độ cao chiết dùng để định tính: 100 mg/mL Hiệu suất chiết tính tốn trình bày Bảng Bảng Hiệu suất chiết cao tổng Loài Mồng tơi Diếp cá Lượng dược liệu khô đem chiết (g) 120 Lượng cao tổng (g) Hiệu suất chiết (%) 7,142 5,95 11,657 6,87 170 Kết Bảng cho thấy hiệu suất chiết cao tổng diếp cá (6,87%) cao so với cao tổng mồng tơi (5,95%) Kết hiệu suất chiết cao tổng diếp cá thấp so với kết nghiên cứu Hoàng Văn Tuấn cộng (2013), với hiệu suất chiết cao sử dụng dung môi ethanol 70% 19,21% hiệu suất chiết cao tổng nước 13,7% [11] Kết hiệu suất chiết cao tổng mồng tơi thấp so với kết nghiên cứu Indranath Ghosal cộng 104 Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi… (2015), với hiệu suất chiết cao sử dụng dung môi ethanol thu cao tổng 7,2% từ mồng tơi [12] 3.2 Đánh giá cao chiết mồng tơi, diếp cá 3.2.1 Định tính hợp chất tự nhiên Từ kết định tính Bảng 5, nhận thấy cao chiết mồng tơi, diếp cá có chứa hợp chất alkaloid, flavonoid, phenolic Đây hợp chất quan trọng có khả kháng khuẩn Trong cao diếp cá có chứa hợp chất alkaloid, flavonoid, phenolic; cao mồng tơi có chứa hợp chất alkaloid flavonoid, không thấy diện phenolic, hàm lượng chất cao chiết thấp Bảng Kết định tính hợp chất tự nhiên Loài Alkaloid Flavonoid Phenolic Mồng tơi + + - + + Diếp cá + Ghi chú: (+) có, (-) khơng 3.2.2 Định lượng flavonoid Mật độ quang Dựa vào đường chuẩn quercetin: y = 0,0028x + 0,0183 để tính hàm lượng flavonoid tổng theo công thức: F = (c x V)/m 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 y = 0.0028x + 0.0183 R² = 0.9867 20 40 60 80 100 120 Nồng độ quercetin (µg/mL) Hình 3: Đồ thị đường chuẩn quercetin Bảng Hàm lượng flavonoid tổng cao mồng tơi diếp cá Cao chiết Flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) Mồng tơi 468,7 ± 1,15 Diếp cá 306,2 ± 1,15 Kết hàm lượng flavonoid tổng cao mồng tơi diếp cá 468,7 mg QE/g cao chiết 306,2 mg QE/g cao chiết Theo kết nghiên cứu Võ Thị Kiều Ngân cộng xác định hàm lượng flavonoid thân rễ cỏ tranh, hàm lượng flavonoid tổng đạt 78,38 mg quercetin/g cao chiết, thấp so với hàm lường flavonoid cao diếp cá cao mồng tơi [13] 105 Phạm Thị Kiều Oanh, Phan Nữ Hoàng Oanh, Hoàng Xuân Thế 3.2.3 Khảo sát khả ức chế dòng vi khuẩn P acnes cao chiết mồng tơi - diếp cá 3.2.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Xác định nồng độ MIC, MBC cao mồng tơi Nồng độ cao chiết chọn để khảo sát 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 mg/mL bằng phương pháp pha lỗng mơi trường thạch Đối chứng âm DMSO Đối chứng dương penicillin 10 𝜇g/mL Bảng Khả ức chế vi khuẩn P acnes cao chiết mồng tơi STT Nồng độ (mg/mL) Khuẩn lạc vi khuẩn P acnes Lần Lần Lần 250 - - - 125 - + + 62,5 + + + 31,25 + + + 15,625 + + + DMSO + + + Penicillin (10 𝜇g/mL) - - - Ghi chú: (+) có phát triển vi khuẩn P acnes, (-) khơng có phát triển vi khuẩn P acnes Kết khảo sát cho thấy giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết mồng tơi 125 mg/mL 250 mg/mL Xác định nồng độ MIC, MBC cao diếp cá Nồng độ cao chiết chọn để khảo sát 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,813; 3,906 mg/mL bằng phương pháp pha lỗng mơi trường thạch Đối chứng âm DMSO Đối chứng dương penicillin 10 𝜇g/mL Bảng Khả ức chế vi khuẩn P acnes cao chiết diếp cá STT Nồng độ (mg/mL) Khuẩn lạc vi khuẩn P acnes Lần Lần Lần 250 - - - 125 - - - 62,5 + - + 31,25 + + + 15,625 + + + 7,813 + + + 3,906 + + + DMSO + + + Penicillin (10 𝜇g/mL) - - - Ghi chú: (+) có phát triển vi khuẩn P acnes, (-) khơng có phát triển vi khuẩn P acnes 106 ... Đánh giá mẫu gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá 2.2.5.1 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn P acnes mẫu gel chiết xuất từ cao hỗn hợp mồng tơi - diếp cá Khả ức chế vi khuẩn P acnes xác định.. .Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi? ?? flavonoid,…[4] Cây diếp cá, tên khoa học Houttuynia cordata Thunb thuộc họ L? ? giấp Saururaceae Trong đông y, diếp. .. hiệu suất chiết cao tổng mồng tơi thấp so với kết nghiên cứu Indranath Ghosal cộng 104 Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh vi khuẩn Propionibacterium acnes gel mồng tơi? ?? (201 5), với hiệu suất chiết