Phân lập và khảo sát môi trường nhân giống nấm mối(termitomyces sp )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG NẤM MỐI (Termitomyces sp.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Ngọc Nhi Bình Dương, Tháng 10 năm 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG NẤM MỐI (Termitomyces sp.) Mã số: Xác nhận đơn vị chủ trì đề tài (chữ ký, họ tên) Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ tên) Bình Dương, Tháng 10 năm 2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài .2 Nội dung nghiên cứu Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm 1.1.1 Khái quát nấm 1.1.2 Chu kì sống nấm 1.1.3 Các giai đoạn phát triển nấm 1.1.3.1 Giai đoạn tăng trưởng 1.1.3.2 Giai đoạn phát triển 1.1.3.3 Giai đoạn hình thành thể nấm 1.1.4 Đặc điểm biến dưỡng nấm .7 1.1.5 Điều kiện sinh trưởng nấm 1.1.5.1 Chất dinh dưỡng .7 1.1.5.2 Ảnh hưởng yếu tố vật lý lên sinh trưởng hệ sợi nấm 1.2 Nấm mối 1.2.1 Khái quát nấm mối 1.2.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại i 1.2.1.2 Chu trình sống nấm mối 1.2.1.3 Đặc điểm hình thái thể nấm mối 10 1.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm mối 12 1.2.1.5 Vai trò nấm mối .14 1.2.2 Tổng quan nuôi cấy chìm thu nhận sinh khối nấm mối 16 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy 17 1.2.2.2 Các điều kiện nuôi cấy 17 1.2.3 Tình hình nghiên cứu nấm mối giới và Việt Nam 19 1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu thành phần loài nấm mối giới 19 1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu nấm mối nước 24 1.2.4 Định danh nấm ăn và nấm dược liệu dựa sở sinh học phân tử 24 1.3 Phương pháp bề mặt đáp ứng .26 1.3.1 Giới thiệu 26 1.3.2 Quá trình thiết kế và bước thực .26 1.3.3 Thiết kế Box – Behnken .27 1.3.3.1 Giới thiệu 27 1.3.3.2 Thiết kế Box – Behnken với ba nhân tố .27 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30 2.1 Thời gian và địa điểm 30 2.2 Vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1 Giống 30 2.2.2 Hóa chất .30 2.2.3 Thiết bị và dụng cụ .30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp phân lập nấm mối 30 2.3.2 Phương pháp định danh nấm mối 31 2.3.2.1 Định danh dựa đặc điểm hình thái 31 ii 2.3.2.2 Định danh dựa sở phân tử 32 2.3.3 Phương pháp chuẩn bị giống chủng dạng lỏng 32 2.3.4 Nghiên cứu nhân giống nấm mối cấp dạng dịch thể 33 2.3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tác động môi trường và thời gian nuôi cấy lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .33 2.3.4.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa nồng độ chất chủ yếu ảnh hưởng tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối .34 2.3.4.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủ yếu ảnh hưởng lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 38 2.3.5 Nghiên cứu nhân giống nấm mối cấp dạng dịch thể 40 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 41 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .42 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MỐI 42 3.1.1 Kết phân lập và định danh nấm mối Termitomyces clypeatus 42 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái nấm mối T clypeatus R Heim 42 3.1.1.2 Kết phân lập tơ nấm 43 3.1.1.3 Kết định danh sở giải trình tự DNA 45 3.1.2 Kết phân lập và định danh nấm mối Termitomyces sp.1 46 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm mối Termitomyces sp.1 46 3.1.2.2 Kết phân lập 46 3.1.2.3 Kết định danh sở giải trình tự DNA 47 3.1.3 Kết phân lập số chủng nấm mối khác 47 3.1.4 Phân tích mối quan hệ di truyền chủng nấm mối phân lập .50 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG NẤM MỐI Termitomyces clypeatus .50 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường và thời gian ni cấy lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .50 iii 3.2.2 Tối ưu hóa nồng độ chất chủ yếu ảnh hưởng đến tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .52 3.2.2.1 Tác động nồng độ glucose lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 52 3.2.2.2 Tác động nồng độ pepton lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối .53 3.2.2.3 Tác động nồng độ KH2PO4 lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 53 3.2.2.4 Tác động tổng hợp nhân tố nồng độ glucose, nồng độ pepton và nồng độ KH2PO4 lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 54 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủ yếu ảnh hưởng tới tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 58 3.2.3.1 Tác động pH ban đầu tới tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 58 3.2.3.2 Tác động tốc độ lắc lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối 59 3.2.3.3 Tác động nhiệt độ lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối 60 3.2.3.4 Tác động đồng thời pH, tốc độ lắc và nhiệt độ tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối 61 3.2.4 Tác động tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối .64 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .66 Kết luận 66 Khuyến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dịch chiết tổ mối (Zeleke et al., 2013) .13 Bảng 1.2 Kết phát triển và hoạt độ enzyme nấm mối môi trường khác (Zeleke et al., 2013) 14 Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng nấm mối (% trọng lượng khô) 15 Bảng 1.4 Thành phần khoáng chất nấm mối (mg/100g trọng lượng khô) (Gbolagade et al., 2006) 16 Bảng 1.5 Tóm tắt hình thái đại thể sử dụng phân loại loài nấm mối (Termitomyces) (Tibuhwa et al., 2010) 20 Bảng 1.6 Thiết kế thí nghiệm Box – Behnken nhân tố (Ferreira et al., 2007) 28 Bảng 3.1 Kết phân tích ANOVA trọng lượng khô 51 Bảng 3.2 Các nồng độ glucose, nồng độ pepton và nồng độ khống KH2PO4 có tác động lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối lựa chọn 55 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ glucose, nồng độ pepton và nồng độ khoáng KH2PO4 lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối 55 Bảng 3.4 Kết phân tích hồi quy và ANOVA sản lượng sinh khối khô hệ sợi khuẩn ty nấm Termitomyces clypeatus 56 Bảng 3.5 Các pH, tốc độ lắc và nhiệt độ có tác động lên tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối lựa chọn 61 Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH, tốc độ lắc và nhiệt độ 61 Bảng 3.7 Kết phân tích hồi quy và ANOVA sản lượng sinh khối khô hệ sợi khuẩn ty nấm Termitomyces clypeatus 62 Bảng 3.8 Kết phân tích ANOVA sinh khối hệ sợi nấm 65 v DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Hệ thống phân loại sinh giới (Whittaker, 1969) Hình 1.2 Chu kì sống nấm đảm Hình 1.3 Hình thái thể nấm .7 Hình 1.4 Nấm mối mọc ngoài tự nhiên (Nguyễn Thị Ngọc Nhi, 2014) Hình 1.5 Sơ đồ chu kì sống nấm mối (Chen chuyun et al., 1991) 10 Hình 1.6 Mơ tả hình thái thể nấm mối (Wong, 2013) 11 Hình 1.7 Termitomyces clypeatus (Wei et al., 2006) 11 Hình 1.8 Hình ảnh số loài nấm mối (Tibuhwa et al., 2010) 12 Hình 1.9 Vùng trình tự ITS DNA ribosome 25 Hình 1.10 Thiết kế thí nghiệm dựa nghiên cứu tất biến ba mức: thiết kế nhân tố mức cho việc tối ưu (a) hai biến, (b) ba biến và (c) Box – Behnken cho tối ưu ba biến (Ferreira et al., 2007) 28 Hình 3.1 Hình dạng nấm mối T clypeatus 42 Hình 3.2 Bào tử nấm mối T clypeatus kính hiển vi quang học, độ phóng đại 400X và hình dạng khuẩn ty kính hiểu vi điện tử 43 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc T clypeatus sau 20 ngày 44 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc T clypeatus sau cấy chuyền 45 ngày 44 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR .45 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự DNA mẫu nấm mối phân lập với trình tự từ ngân hàng gene NCBI 45 Hình 3.7 Hình dạng nấm mối Termitomyces sp.1 46 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc Termitomyces sp.1 MT sau 20 ngày .46 Hình 3.9 Bào tử nấm mối Termitomyces sp.1 kính hiển vi quang học, độ phóng đại 400X và hình dạng khuẩn ty kính hiểu vi điện tử 47 Hình 3.10 Kết so sánh trình tự DNA mẫu nấm mối phân lập với trình tự từ ngân hàng gene 47 ình 3.11 Hình thái khuẩn lạc chủng BD3 sau 10 ngày 48 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc nấm mối chủng BD3 sau 30 ngày cấy chuyền qua MT YESS 48 Hình 3.13 Hình thái khuẩn lạc chủng BD5 sau 10 ngày .49 Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc chủng BD6 sau 10 ngày .49 vi Hình 3.15 Cây phát sinh loài phân tích phương pháp Maximum Likehood Mega6 dựa vào trình tự vùng ITS mẫu nấm thu Bình Dương, số bootstrap lặp lại 1000 lần 50 Hình 3.16 Tác động môi trường nuôi cấy và thời gian nuôi cấy lên trọng lượng khô hệ sợi nấm mối .51 Hình 3.17 Tác động nồng độ glucose đến trọng lượng khô hệ sợi nấm mối 52 Hình 3.18 Tác động nồng độ pepton đến trọng lượng khô hệ sợi khuẩn ty nấm Termitomyces clypeatus 53 Hình 3.19 Tác động nồng độ KH2PO4 đến trọng lượng khô 54 Hình 3.20 Tác động nhân tố nồng độ glucose và nồng độ pepton lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với nồng độ khoáng là 0,15 % .57 Hình 3.21 Tác động nhân tố nồng độ glucose và nồng độ khoáng lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với nồng độ pepton là 0,4% .57 Hình 3.22 Tác động nhân tố nồng độ khoáng và nồng độ pepton lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với nồng độ glucose là % 58 Hình 3.23 Tác động pH ban đầu tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối 59 Hình 3.24 Tác động tốc độ lắc tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối .60 Hình 3.25 Tác động nhiệt độ tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối .60 Hình 3.26 Tác động nhân tố nhiệt độ và tốc độ lắc lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với pH 5,5 63 Hình 3.27 Tác động nhân tố nhiệt độ và pH lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với tốc độ lắc 140 .63 Hình 3.28 Tác động nhân tố tốc độ lắc và pH lên sinh trưởng hệ sợi khuẩn ty nấm với nhiệt độ 280C 64 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AkP alkaline serine protease CSDL Cơ sở liệu CTAB Cetyl trimethylammoniumbromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS Internal Transcribed Spacer MT Môi trường NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction PDA Potato dextrin agar PDB Potato dextrin broth rRNA Ribosomal ribonucleic acid RSM Response surface methodology Sk Sinh khối T Termitomyces TN Nghiệm thức viii B.5.1 Bảng số liệu thô tác động tổng hợp nhân tố: Nồng độ glucose, pepton và khống KH2PO4 Chưa mã hóa Nồng độ glucose Mã hóa Pepton X1 X2 X3 0,2 Khống KH2PO4 0,15 -1 -1 Sinh khối (g/l) 4,45 0,2 0,15 -1 -1 4,42 0,2 0,15 -1 -1 4,51 0,2 0,15 -1 4,68 0,2 0,15 -1 4,90 0,2 0,15 -1 5,00 0,6 0,15 -1 4,27 0,6 0,15 -1 4,19 0,6 0,15 -1 4,21 0,6 0,15 1 5,38 0,6 0,15 1 5,29 0,6 0,15 1 5,21 0,4 0,10 -1 -1 4,32 0,4 0,10 -1 -1 4,54 0,4 0,10 -1 -1 4,48 0,4 0,10 -1 4,88 0,4 0,10 -1 4,70 0,4 0,10 -1 4,82 0,4 0,20 -1 4,37 0,4 0,20 -1 4,30 0,4 0,20 -1 4,45 0,4 0,20 1 5,25 0,4 0,20 1 5,34 P-12 0,4 0,20 1 5,46 0,2 0,10 -1 -1 5,42 0,2 0,10 -1 -1 5,37 0,2 0,10 -1 -1 5,34 0,6 0,10 -1 5,52 0,6 0,10 -1 5,77 0,6 0,10 -1 5,66 0,2 0,20 -1 5,21 0,2 0,20 -1 5,34 0,2 0,20 -1 5,27 0,6 0,20 1 5,34 0,6 0,20 1 5,11 0,6 0,20 1 5,24 0,4 0,15 0 5,85 0,4 0,15 0 5,79 0,4 0,15 0 5,72 P-13 Chưa mã hóa TT Mã hóa Nồng độ Nồng độ Nồng độ glucose Pepton KH2PO4 Sinh khối X1 X2 X3 (g/l) 0,2 0,15 -1 -1 4,46 0,2 0,15 -1 4,86 0,6 0,15 -1 4,22 0,6 0,15 1 5,29 0,4 0,10 -1 -1 4,45 0,4 0,10 -1 4,69 0,4 0,20 -1 4,37 8 0,4 0,20 1 5,35 0,2 0,10 -1 -1 5,38 10 0,6 0,10 -1 5,65 11 0,2 0,20 -1 5,27 12 0,6 0,20 1 5,23 13 0,4 0,15 0 5,85 14 0,4 0,15 0 5,79 15 0,4 0,15 0 5,72 B.5.2 Kết xử lý thống kê tác động tổng hợp nhân tố: Nồng độ glucose, Peptone và khoáng KH2PO4 Response Surface Regression: Sinh khối versus X1 X2 X3 Response Surface Regression: Sản lượng si versus Nồng độ gluc Nồng độ pept The analysis was done using coded units Estimated Regression Coefficients for Sản lượng sinh khối Term Coef SE Coef T P Constant 5,82667 0,06971 83,581 0,000 Nồng độ glucose 0,40250 0,02465 16,330 0,000 Nồng độ pepton 0,14958 0,02465 6,069 0,000 Nồng độ khoáng KH2PO4 0,19292 0,02465 7,827 0,000 Nồng độ glucose*Nồng độ glucose -0,85167 0,04611 -18,470 0,000 Nồng độ pepton *Nồng độ pepton e -0,09750 0,04611 -2,114 0,043 Nồng độ khoáng KH2PO4* -0,09083 0,04611 -1,970 0,058 Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ glucose*Nồng độ pepton e 0,19583 0,03486 5,618 0,000 Nồng độ glucose* 0,23250 0,03486 6,670 0,000 Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ pepton e *Nồng độ khoáng KH2PO4 -0,05500 0,03486 -1,578 0,125 S = 0,120746 R-Sq = 96,70% PRESS = 0,752635 R-Sq(pred) = 94,12% R-Sq(adj) = 95,67% P-14 cv= 2,3% Analysis of Variance for Sản lượng sinh khối Source Regression Linear Nồng độ glucose Nồng độ pepton Nồng độ khoáng KH2PO4 Square Nồng độ glucose*Nồng độ glucose Nồng độ pepton *Nồng độ pepton Nồng độ khoáng KH2PO4*Nồng độ khoáng KH2PO4 Interaction Nồng độ glucose*Nồng độ pepton Nồng độ glucose*Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ pepton *Nồng độ khoáng KH2PO4 Residual Error Lack-of-Fit Pure Error Total DF 1 1 1 29 26 38 Source Regression Linear Nồng độ glucose Nồng độ pepton Nồng độ khoáng KH2PO4 Square Nồng độ glucose*Nồng độ glucose Nồng độ pepton *Nồng độ pepton Nồng độ khoáng KH2PO4*Nồng độ khoáng KH2PO4 Interaction Nồng độ glucose*Nồng độ pepton Nồng độ glucose*Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ pepton *Nồng độ khoáng KH2PO4 Residual Error Lack-of-Fit Pure Error Total F P 94,39 0,000 121,59 0,000 266,68 0,000 36,83 0,000 61,26 0,000 135,39 0,000 341,14 0,000 4,47 0,043 3,88 0,058 26,18 0,000 31,57 0,000 44,49 0,000 2,49 0,125 Obs 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 StdOrder 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Sản lượng sinh khối 5,420 5,370 5,340 4,320 4,540 4,480 4,880 4,700 4,820 5,520 5,770 5,660 4,450 4,420 4,510 4,680 4,900 5,000 5,850 5,790 5,840 4,470 4,590 4,450 Fit 5,241 5,241 5,241 4,521 4,521 4,521 4,861 4,861 4,861 5,650 5,650 5,650 4,521 4,521 4,521 4,935 4,935 4,935 5,827 5,827 5,827 4,429 4,429 4,429 SE Fit 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,070 0,070 0,070 0,060 0,060 0,060 Residual 0,179 0,129 0,099 -0,201 0,019 -0,041 0,019 -0,161 -0,041 -0,130 0,120 0,010 -0,071 -0,101 -0,011 -0,255 -0,035 0,065 0,023 -0,037 0,013 0,041 0,161 0,021 P-15 Seq SS 12,3855 5,3184 3,8882 0,5370 0,8932 5,9219 5,8365 0,0288 0,0566 1,1452 0,4602 0,6487 0,0363 0,4228 0,2225 0,2003 12,8083 9,62 0,000 St Resid 1,71 1,24 0,95 -1,92 0,18 -0,39 0,18 -1,54 -0,39 -1,24 1,15 0,10 -0,68 -0,97 -0,11 -2,43 R -0,33 0,63 0,24 -0,37 0,14 0,39 1,54 0,20 Adj SS 12,3855 5,3184 3,8882 0,5370 0,8932 5,9219 4,9737 0,0652 0,0566 1,1452 0,4602 0,6487 0,0363 0,4228 0,2225 0,2003 Adj MS 1,37616 1,77279 3,88815 0,53700 0,89320 1,97397 4,97373 0,06519 0,05658 0,38173 0,46021 0,64868 0,03630 0,01458 0,07416 0,00771 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 5,580 5,790 5,690 5,710 5,740 5,760 4,470 4,590 4,450 5,800 5,700 5,860 5,740 5,810 5,820 5,625 5,625 5,625 5,737 5,737 5,737 4,442 4,442 4,442 5,712 5,712 5,712 5,926 5,926 5,926 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 0,060 -0,045 0,165 0,065 -0,027 0,003 0,023 0,028 0,148 0,008 0,088 -0,012 0,148 -0,186 -0,116 -0,106 -0,43 1,57 0,62 -0,26 0,03 0,22 0,27 1,41 0,08 0,84 -0,12 1,41 -1,78 -1,11 -1,01 R denotes an observation with a large standardized residual Estimated Regression Coefficients for Sản lượng sinh khối using data in uncoded units Term Constant Nồng độ glucose Nồng độ pepton Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ glucose*Nồng độ Nồng độ pepton *Nồng độ Nồng độ khoáng KH2PO4* Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ glucose*Nồng độ Nồng độ glucose* Nồng độ khoáng KH2PO4 Nồng độ pepton *Nồng độ Coef -2,19375 2,21167 0,585417 3,00833 -0,212917 -2,43750 -36,3333 glucose pepton pepton 0,489583 2,32500 khoáng KH2PO4 -5,50000 Residual Plots for Sản lượng sinh khối Response Optimization Parameters Sản lượng si Goal Maximum Lower 4,32 Target 5,85 Upper 5,85 Weight Import Global Solution Nồng độ gluc Nồng độ pept Nồng độ khoá = = = 6,98990 0,595960 0,2 Predicted Responses Sản lượng si = 6,12845 , desirability = Composite Desirability = 1,000000 P-16 1,000000 Optimal High D Cur 1,0000 Low Nồng độ 8,0 [6,9899] 4,0 Nồng độ 0,60 [0,5960] 0,20 Nồng độ 0,20 [0,20] 0,10 Composite Desirability 1,0000 Sản lượn Maximum y = 6,1284 d = 1,0000 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủ yếu ảnh hưởng tới sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Thí nghiệm sơ bộ: Thí nghiệm 3a: Tác động pH ban đầu tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Kết thí nghiệm tác động pH ban đầu tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối pH Sinh khối (g/l) 3,5 3,5 3,5 4 4,5 4,5 4,5 5 5,5 5,5 5,5 3,947 3,738 3,992 4,598 4,892 4,761 5,621 5,591 5,743 5,329 5,232 5,123 4,178 3,871 3,917 P-17 Thí nghiệm 3b: Tác động tốc độ lắc lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Kết thí nghiệm tác động tốc độ lắc lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Tốc độ lắc (rpm) 80 80 80 100 100 100 120 120 120 140 140 140 160 160 160 180 180 180 Sinh khối (g/l) 4,147 4,238 4,192 4,439 4,412 4,393 4,792 4,782 4,921 5,722 5,862 5,923 5,732 5,891 5,793 4,578 4,681 4,717 Thí nghiệm 3c: Tác động nhiệt độ lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Kết thí nghiệm tác động nhiệt độ lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Nhiệt độ ( 0C) 24 24 24 26 26 26 28 28 28 30 30 30 32 32 32 Sinh khối (g/l) 4,847 4,468 4,582 5,692 5,992 5,862 5,921 6,071 6,143 5,425 5,602 5,329 4,678 4,471 4,517 Thí nghiệm tổng hợp:Tác động đồng thời pH, tốc độ lắc và nhiệt độ tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Kết thí nghiệm tác động đồng thời pH, tốc độ lắc và nhiệt độ tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối P-18 TT pH Tốc độ lắc Nhiệt độ Sinh khối g/l 4,0 120 28 5,51 4,0 120 28 5,45 4,0 120 28 5,53 5,5 120 28 5,28 5,5 120 28 5,25 5,5 120 28 5,30 4,0 160 28 4,74 4,0 160 28 4,82 4,0 160 28 4,72 10 5,5 160 28 5,60 11 5,5 160 28 5,58 12 5,5 160 28 5,52 13 4,0 140 26 4,84 14 4,0 140 26 4,96 15 4,0 140 26 4,86 16 5,5 140 26 4,65 17 5,5 140 26 4.71 18 5,5 140 26 4,62 19 4,0 140 30 4,71 20 4,0 140 30 4,74 21 4,0 140 30 4,76 22 5,5 140 30 5,16 23 5,5 140 30 5,31 24 5,5 140 30 5,09 25 4,5 120 26 5,97 26 4,5 120 26 6,12 27 4,5 120 26 5,83 28 4,5 160 26 5,19 29 4,5 160 26 5,24 30 4,5 160 26 5,18 31 4,5 120 30 5,73 32 4,5 120 30 5,68 33 4,5 120 30 5,82 34 4,5 160 30 5,82 P-19 35 4,5 160 30 5,78 36 4,5 160 30 5,79 37 4,5 140 28 6,36 38 4,5 140 28 6,38 39 4,5 140 28 6,37 40 4,5 140 28 6,32 41 4,5 140 28 6,35 42 4,5 140 28 6,29 43 4,5 140 28 6,26 44 4,5 140 28 6,38 45 4,5 140 28 6,32 Thí nghiệm 4: Tác động tỷ lệ cấp giống chế độ sục khí tới sự phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Kết thí nghiệm tác động tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Lượng khí cấp (v/v/m) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Tỷ lệ giống cấp (% v/v) 4 6 8 10 10 10 4 6 8 10 10 10 P-20 Sinh khối (g/l) 4,489 4,671 4,318 4,581 4,621 4,592 4,801 4,921 4,931 5,901 5,924 6,172 4,561 4,634 4,571 4,656 4,689 4,701 4,723 4,726 4,698 5,789 5,983 5,978 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 1 1 1 1 1 1 4 6 8 10 10 10 4 6 8 10 10 10 4,621 4,672 4,598 4,789 4,891 4,98 4,945 5,032 5,093 5,731 5,807 5,901 4,576 4,601 4,596 4,698 4,681 4,692 5,01 5,285 5,236 5,816 5,779 5,876 Kết thống kê thí nghieemk 3, 4: Thí nghiệm: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủ yếu ảnh hưởng tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Thí nghiệm sơ bộ: Thí nghiệm 3a: Tác động pH ban đầu tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối One-way ANOVA: Sinh khối (g/l) versus pH Source pH Error Total DF 10 14 S = 0,1301 SS 7,0358 0,1692 7,2050 MS 1,7590 0,0169 R-Sq = 97,65% F 103,98 P 0,000 R-Sq(adj) = 96,71% Cv =2,7% Grouping Information Using Tukey Method pH 4,5 5,5 3,5 N 3 3 Mean 5,6517 5,2280 4,7503 3,9887 3,8923 Grouping A B C D D Thí nghiệm 3b: Tác động tốc độ lắc lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối One-way ANOVA: Sinh khối (g/l) versus Tốc độ lắc (rpm) P-21 Source Tốc độ lắc (rpm) Error Total S = 0,07173 DF 12 17 SS 7,42582 0,06175 7,48757 R-Sq = 99,18% MS 1,48516 0,00515 F 288,62 P 0,000 R-Sq(adj) = 98,83% Cv= 0,34% Grouping Information Using Tukey Method Tốc độ lắc(rpm) 140 160 120 180 100 80 N 3 3 3 Mean 5,8357 5,8053 4,8317 4,6587 4,4147 4,1923 Grouping A A B B C D Thí nghiệm 3c: Tác động nhiệt độ lên phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối One-way ANOVA: Sinh khối (g/l) versus Nhiệt độ (0C) Source Nhiệt độ ( oC) Error Total S = 0,1444 DF 10 14 SS 5,6377 0,2085 5,8463 R-Sq = 96,43% MS 1,4094 0,0209 F 67,59 P 0,000 R-Sq(adj) = 95,01% Cv=2,7% Grouping Information Using Tukey Method Nhiệt độ (oC) 28 26 30 24 32 N 3 3 Mean 6,0450 5,8487 5,4520 4,6323 4,5553 Grouping A A B C C Thí nghiệm tổng hợp: Khảo sát tác động đồng thời pH, tốc độ lắc và nhiệt độ tới phát triển sinh khối hệ sợi nấm mối Response Surface Regression: Sinh khối (g/l) versus pH Tốc độ lắc Nhiệt độ The analysis was done using coded units Estimated Regression Coefficients for Sinh khối (g/l) Term Constant pH Tốc độ lắc Nhiệt độ pH*pH Tốc độ lắc*Tốc độ lắc Nhiệt độ*Nhiệt độ pH*Tốc độ lắc pH*Nhiệt độ Tốc độ lắc*Nhiệt độ S = 0,0942933 R-Sq = 99,11% Cv = 1,71% Coef 6,47901 0,10250 -0,09671 0,12934 -1,09359 -0,10042 -0,54542 0,26724 0,13855 0,17750 SE Coef 0,05940 0,03334 0,03420 0,03420 0,05660 0,04907 0,04907 0,04589 0,04589 0,04715 PRESS = 0,770072 R-Sq(pred) = 84,50% T 109,078 3,075 -2,827 3,782 -19,320 -2,046 -11,115 5,824 3,019 3,765 P 0,000 0,028 0,037 0,013 0,000 0,096 0,000 0,002 0,029 0,013 R-Sq(adj) = 97,49% Analysis of Variance for Sinh khối (g/l) P-22 Source Regression Linear pH Tốc độ lắc Nhiệt độ Square pH*pH Tốc độ lắc*Tốc độ lắc Nhiệt độ*Nhiệt độ Interaction pH*Tốc độ lắc pH*Nhiệt độ Tốc độ lắc*Nhiệt độ Residual Error Lack-of-Fit Pure Error Total Obs 10 11 12 13 14 15 StdOrder 10 11 12 13 14 15 Sinh khối (g/l) 5,520 5,290 4,730 5,600 4,850 4,640 4,740 5,130 5,900 5,220 5,780 5,810 6,370 6,310 6,290 DF 1 1 1 14 Seq SS 4,92272 0,25990 0,00998 0,15961 0,09031 4,15420 3,04312 0,01269 1,09839 0,50861 0,30153 0,08105 0,12602 0,04446 0,04099 0,00347 4,96717 Fit 5,546 5,217 4,819 5,558 4,747 4,675 4,728 5,210 5,958 5,231 5,769 5,752 6,323 6,323 6,323 SE Fit 0,077 0,086 0,077 0,086 0,077 0,086 0,077 0,086 0,082 0,082 0,082 0,082 0,054 0,054 0,054 Adj SS 4,92272 0,28228 0,08405 0,07108 0,12714 4,15420 3,31883 0,03723 1,09839 0,50861 0,30153 0,08105 0,12602 0,04446 0,04099 0,00347 Adj MS 0,54697 0,09409 0,08405 0,07108 0,12714 1,38473 3,31883 0,03723 1,09839 0,16954 0,30153 0,08105 0,12602 0,00889 0,01366 0,00173 Residual -0,026 0,073 -0,089 0,042 0,103 -0,035 0,012 -0,080 -0,058 -0,011 0,011 0,058 0,047 -0,013 -0,033 F 61,52 10,58 9,45 7,99 14,30 155,74 373,27 4,19 123,54 19,07 33,91 9,12 14,17 P 0,000 0,013 0,028 0,037 0,013 0,000 0,000 0,096 0,000 0,004 0,002 0,029 0,013 7,88 0,115 St Resid -0,48 1,84 -1,62 1,06 1,89 -0,87 0,21 -2,02 R -1,26 -0,24 0,24 1,26 0,61 -0,17 -0,43 R denotes an observation with a large standardized residual Estimated Regression Coefficients for Sinh khối (g/l) using data in uncoded units Term Constant pH Tốc độ lắc Nhiệt độ pH*pH Tốc độ lắc*Tốc độ lắc Nhiệt độ*Nhiệt độ pH*Tốc độ lắc pH*Nhiệt độ Tốc độ lắc*Nhiệt độ Coef -109,464 13,5257 -0,143419 6,64050 -1,94417 -2,51042E-04 -0,136354 0,0178158 0,0923684 0,00443750 P-23 Residual Plots for Sinh khối (g/l) Normal Probability Plot Versus Fits 99 0,10 50 0,00 -0,05 10 0,05 Residual Percent 90 -0,10 -0,10 -0,05 0,00 Residual 0,05 0,10 4,5 5,0 0,10 0,05 6,5 0,00 -0,05 6,0 Versus Order Residual Frequency Histogram 5,5 Fitted Value -0,10 -0,10 -0,05 0,00 Residual 0,05 0,10 Response Optimization Parameters Sinh khối (g Goal Maximum Lower 4,64 Target 6,37 Upper 6,37 Weight Import Global Solution pH Tốc độ lắc Nhiệt độ = = = 4,75 131,313 28,1010 Predicted Responses Sinh khối (g = 6,50332 , 10 11 12 13 14 15 Observation Order desirability = Composite Desirability = 1,000000 P-24 1,000000 pH 5,50 [4,750] 4,0 Optimal High D Cur 1,0000 Low Tốc độ l 160,0 [131,3131] 120,0 Nhiệt độ 30,0 [28,1010] 26,0 Composite Desirability 1,0000 Sinh khố Maximum y = 6,5033 d = 1,0000 Thí nghiệm 4: Tác động tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí tới tích lũy sinh khối hệ sợi nấm mối General Linear Model: Sinh khối (g versus Lượ+B1:G32ng Tỷ lệ giống Factor Lượ+B1:G32ng khí cấp (v/v/m) Tỷ lệ giống cấp (% v/v) Type fixed fixed Levels 4 Values 0,4 0,6 0,8 1,0 10 Analysis of Variance for Sinh khối (g/l), using Adjusted SS for Tests Source Lượ+B1:G32ng khí cấp (v/v/m) Tỷ lệ giống cấp (% v/v) Lượ+B1:G32ng khí cấp (v/v/m)* Tỷ lệ giống cấp (% v/v) Error Total S = 0,0871397 R-Sq = 98,19% DF 3 Seq SS 0,11162 12,58553 0,47089 Adj SS 0,11162 12,58553 0,47089 Adj MS 0,03721 4,19518 0,05232 32 47 0,24299 13,41103 0,24299 0,00759 R-Sq(adj) = 97,34% Cv = 1,72% Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence Lượ+B1:G32ng khí cấp (v/v/m) 0,4 0,6 1,0 0,8 1,0 0,8 0,8 0,4 0,6 Tỷ lệ giống cấp (% v/v) 10 10 10 10 8 8 N 3 3 3 3 Mean 5,999 5,917 5,824 5,813 5,177 5,023 4,887 4,884 4,716 Grouping A A A A B B C C D C D D E P-25 F 4,90 552,48 6,89 P 0,006 0,000 0,000 1,0 0,6 0,8 0,4 1,0 0,6 0,4 6 4 3 3 3 4,690 4,682 4,630 4,598 4,591 4,589 4,493 D E D E D E E E E E P-26