Phân lập và tuyển chọn nấm mốc phân giải Cellulose: Nghiên cứu khoa học giáo viên

1   LỜI MỞ ĐẦU Các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men… có nhiều ích lợi người Trong đó, nấm mốc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: sản xuất rượu, tương, nước chấm, kháng sinh (như: penicillin)… Đặc biệt, nhiều nấm mốc có khả tạo enzyme để phân hủy chất tự nhiên, đối tượng để nghiên cứu sản xuất enzyme như: cellulase, amylase, protease… Trong tự nhiên, nấm mốc diện nhiều nơi, chúng phát triển nhanh điều kiện khí hậu nóng ẩm nước ta Trên thực vật bị mục nát như: gỗ mục, rơm mục… chứa nhiều chủng nấm mốc có khả tạo enzyme cellulase để phân hủy cellulose Đề tài nghiên cứu tiến hành phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân hủy cellulose từ mẫu gỗ mục rơm mục thu tự nhiên, nhằm ứng dụng thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc nhiều lĩnh vực khác phục vụ đời sống người   CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm nấm mốc: [1] Nấm mốc gọi nấm sợi Chúng thường diện thực phẩm, quần áo, giày dép, sách vở… Nấm mốc phát triển nhanh nguồn chất hữu gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Nấm mốc phát triển thiết bị làm vật liệu vô như: thấu kính ống nhịm, máy ảnh, kính hiển vi… Một số nấm mốc có khả sống ký sinh người, động vật thực vật gây bệnh nấm nguy hiểm Ngoài ra, số nấm sợi sản sinh độc tố nấm có khả gây bệnh ung thư bệnh khác Trong tự nhiên, nấm mốc phân bố rộng rãi Chúng tham gia tích cực vào vịng tuần hồn vật chất, q trình phân hủy chất hữu hình thành chất mùn 1.1.1 Hình thái cấu trúc sợi nấm: Đỉnh sợi nấm bao gồm chóp hình nón, khơng tăng trưởng có tác dụng che chở bảo vệ cho phần sợi nấm Trong sợi nấm chứa chất nguyên sinh, nhân, bào quan, enzyme… Sợi nấm gọi khuẩn ty Khuẩn ty có vách ngăn hay khơng có vách ngăn Ở số lồi nấm mốc, khuẩn ty khơng có vách ngăn, tế bào sợi nấm thường chứa nhiều nhân, gọi tế bào đa nhân Đối với nấm mốc có vách ngăn khuẩn ty, người ta thường thấy tế bào sợi nấm chứa nhân, nhân, nhiều nhân chẳng có nhân di chuyển nhân khuẩn ty   Khi bào tử nấm mốc rơi vào điều kiện mơi trường thích hợp, chúng nảy mầm thành hệ sợi nấm Trong hệ sợi nấm có loại khuẩn ty: khuẩn ty dinh dưỡng (khuẩn ty chất) khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty dinh dưỡng cắm sâu vào mơi trường dinh dưỡng, cịn khuẩn ty khí sinh phát triển tự khơng khí Hệ sợi nấm biến hóa để thích nghi với điều kiện sống khác thành dạng đặc biệt sau: ƒ Rễ giả: giống chùm rễ phân nhánh, có tác dụng giúp nấm bám chặt vào chất hấp thụ chất dinh dưỡng từ chất ƒ Sợi hút: có nấm mốc sống ký sinh bắt buộc, chúng mọc từ khuẩn ty, phân nhánh mọc xuyên sâu vào tế bào chủ, chúng có hình cầu hình sợi Nấm mốc sử dụng sợi hút để hút chất dinh dưỡng từ thể sinh vật chủ ƒ Sợi áp: diện nấm mốc ký sinh thực vật Phần sợi nấm tiếp xúc với sinh vật chủ phồng to lên để tăng diện tích tiếp xúc với sinh vật chủ Phần thường có hình đĩa, có nhiều nhân tế bào, áp chặt vào sinh vật chủ Các mô sinh vật chủ tác dụng enzyme nấm tiết bị phá hủy phần hay bị phân hủy hoàn toàn Qua mô bị phá hủy này, sợi nấm lấn sâu vào bên sinh vật chủ tiếp tục sinh enzyme để phân hủy sinh vật chủ Khác với sợi hút, sợi áp không phát triển thành nhánh đâm sâu vào tế bào sống sinh vật chủ ƒ Sợi bò (thân bò): đoạn sợi nấm khí sinh khơng phân nhánh, phát sinh từ sợi nấm dinh dưỡng, có hình thẳng hình cung Đầu mút sợi bò chạm vào chất, phát triển thành rễ giả để   bám vào chất Sợi bò lan dần phía, kể thành thủy tinh ống nghiệm, nắp hộp petri Sợi bò rễ giả thường gặp Mucorales ƒ Vòng nấm mạng nấm: biến đổi lồi nấm có khả bẫy lồi động vật nhỏ đất Vịng nấm có dạng bọng dính, mọc từ cuống ngắn xếp thẳng góc với sợi nấm Đỉnh cuống phình to thành bọng hình cầu Bọng tiết chất dính khắp bề mặt Khi mồi chạm vào chất dính bị giữ chặt lại bị nhánh sợi nấm đâm xuyên qua vỏ Các nhánh lại phồng lên thành bọng nhỏ bên thể vật tiếp tục phân nhánh thành sợi hút Vịng nấm có dạng sợi thịng lọng có khun tròn dọc sợi nấm Mỗi khuyên cấu tạo tế bào xếp nối tiếp nối vào sợi nấm đoạn ngắn Khi mặt tế bào tiếp xúc với mồi không bào phồng to lên căng mạnh vào phía trong, thắt chặt mồi lại Sau đó, sợi nhánh mọc xuyên sâu vào thể mồi tiếp tục phát triển sợi hút Mạng nấm hay cịn gọi lưới dính, mạng sợi dính với lưới nhỏ Các côn trùng chạm vào bị giữ chặt lấy Sau đó, tế bào mạng nấm phát triển thành bọng nhỏ sợi hút để tiêu hóa thể mồi 1.1.2 Sinh sản nấm mốc: Từ khuẩn ty khí sinh nấm mốc mọc sợi sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính sau:   ƒ Đầu bào tử trần: quan sinh sản vơ tính có cấu tạo chứa bào tử vơ tính ƒ Nang bào tử kín: nang bào tử kín có nang trụ nối tiếp với cuống nang Nang bào tử kín chứa bào tử kín ƒ Đảm: quan sinh sản hữu tính tạo thành tế bào song nhân đỉnh sợi phình to Trong đảm, hai nhân phối hợp với để hình thành nhân lưỡng bội Sau đó, đảm phát triển tạo thành bào tử đảm ƒ Túi giá: có dạng hình cầu hình chai với vỏ cấu tạo lớp sợi nấm quấn chặt lại với Thành vỏ mang cuống bào tử trần Các bào tử trần sinh từ cuống ƒ Cụm giá: cấu tạo cuống bào tử trần ngắn xếp liền với tạo thành khối dày Bào tử trần sinh đỉnh cuống, tạo thành đệm gồm nhiều cuống dính với ƒ Đĩa giá: gặp nấm ký sinh thực vật Đĩa giá gồm đĩa phẳng cấu tạo sợi nấm quấn chặt lấy nhau, có cuống bào tử trần mọc thẳng đứng ƒ Bó giá: gồm nhiều cuống bào tử trần dài, xếp song song với phần gốc suốt dọc cuống, mang bào tử trần phần suốt dọc thân ƒ Hạch nấm: khối sợi nấm rắn chắc, thường có tiết diện trịn, khơng mang quan sinh sản Hạch nấm có nấm mốc có sợi nấm ngăn vách Đây dạng sống nghỉ nấm để bảo vệ nấm trải qua điều kiện bất lợi mơi trường sống Hạch nấm   thường có kích thước 100 μm đến mm, thường có cấu tạo lớp: bên lớp vỏ rắn, cấu tạo nhu mơ giả, có thành dày, phủ cutin, chứa sắc tố; lớp thường mềm hơn, cấu tạo mơ tế bào hình thoi, gồm sợi nấm bình thường gelatin hóa, khơng có màu, chứa nhiều chất dự trữ carbohydrate lipid ƒ Thể đệm: khối sợi nấm có thành tế bào dính liền theo nhiều hướng Bên bên thể đệm có mang quan sinh sản Các tế bào đệm nấm chưa tạo thành mô thật động vật thực vật, mà mơ giả Có loại mơ giả: mơ tế bào hình thoi nhu mơ giả Mơ tế bào hình thoi có cấu tạo xốp, sợi xốp song song với phân biệt sợi riêng biệt Nhu mơ giả có tế bào hình đa giác hay hình trịn, dính chặt với nhau, khơng tách rời thành sợi ƒ Quả túi: loại thể đệm gặp nấm túi Quả túi có dạng hình cầu, hình chai hình đĩa 1.1.3 Phân loại nấm mốc: Nấm mốc phân loại theo nhiều hệ thống phân loại khác Sau tóm tắt hệ thống phân loại nấm Ainsworth (1973): Giới nấm a Tồn nguyên chất đoàn (plasmodium) dạng nguyên chất đoàn giả (pseudoplasmodium) ngành nấm nhày (Myxomycota) aa Khơng có dạng ngun chất đồn giả nguyên chất đoàn, giai đoạn dinh dưỡng hệ sợi nấm (khuẩn ty thể) điển hình ngành nấm thật (Eumycota)   b Có bào tử động, bào tử hữu tính bào tử nỗn ngành phụ Mastigomycotina bb Khơng có bào tử động .xem c c Có giai đoạn hữu tính xem d cc Khơng có giai đoạn hữu tính ngành phụ Deuteromycotina d Bào tử hữu tính bào tử tiếp hợp (zygospores) ngành phụ Zygomycotina dd Khơng có bào tử tiếp hợp xem e e Bào tử hữu tính bào tử túi .ngành phụ Ascomycotina ee Bào tử hữu tính bào tử đảm ngành phụ Basidiomycotina Ngành phụ MASTIGOMYCOTINA (Sparrow, 1960) (Bào tử hữu tính bào tử noãn) ƒ Lớp Chytridiomycetes - Bộ Chytridiales + Họ Olpidiaceae + Họ Achlyogenotaceae + Họ Synchytriaceae + Họ Phlyctidiaceae + Họ Rhizidiaceae + Họ Cladochytriaceae   + Họ Physodermataceae + Họ Megachytriaceae - Bộ Harpochytriales + Họ Harpochytriaceae - Bộ Blastocladiales + Họ Coelomomycetaceae + Họ Catenariaceae + Họ Blastocladiaceae - Bộ Monoblepharidales + Họ Monoblepharidaceae + Họ Gonapodyaceae ƒ Lớp Hyphochytridiomycetes - Bộ Hyphochytridiales + Họ Anisolpidiaceae + Họ Rhizidiomycetaceae + Họ Hyphochytriaceae ƒ Lớp Plasmodiophoromycetes - Bộ Plasmodiophorales + Họ Plasmodiophoraceae   ƒ Lớp Oomycetes - Bộ Lagenidiales + Họ Olpidiopsidaceae + Họ Sirzolpidiaceae + Họ Lagenidiaceae - Bộ Saprolegniales + Họ Ectrogellaceae + Họ Haliphthoraceae + Họ Thraustochytriaceae + Họ Saprolegniaceae + Họ Leptolegniellaceae - Bộ Leptomitales + Họ Leptomitaceae + Họ Rhipidiaceae + Họ Euglerulaceae + Họ Pseudosphaeriaceae + Họ Capnodiaceae + Họ Dothideaceae + Họ Dothioraceae 10   - Bộ Pleosporales + Họ Dimeriaceae + Họ Venturiaceae + Họ Mesnieraceae + Họ Botryosphaeriaceae + Họ Lophiostomataceae + Họ Sporormiaceae + Họ Pleosporaceae + Họ Mycoporaceae - Bộ Hysteriales + Họ Hysteriaceae + Họ Arthoniaceae + Họ Opegraphaceae + Họ Phyllipsiellaceae + Họ Patellariaceae + Họ Lecanactidaceae - Bộ Hemisphaeriales + Họ Microthyriaceae + Họ Trichopeltinaceae 30   Người ta sử dụng cellulase để chuyển hóa phế liệu giàu cellulose thành glucose, sau tiến hành lên men để tạo thành ethanol Ethanol pha trộn với xăng để làm giảm chi phí nhiên liệu cho loại phương tiện giao thông Trong chăn nuôi, thức ăn giàu celllose (như cỏ) trộn thêm cellulase để tăng thêm tiêu hóa thức ăn động vật, đặc biệt động vật non, giúp cho động vật tăng trưởng nhanh… 31   CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu: 2.1.1 Đối tượng: Đối tượng nghiên cứu chủng nấm mốc phân lập từ mẫu gỗ mục rơm mục thu thập tự nhiên theo bảng sau: Bảng 2.1 Các mẫu dùng để phân lập nấm mốc Stt Ký hiệu mẫu Loại mẫu BH1 Gỗ mục Tp Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai BH2 Gỗ mục Tp Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai DN Gỗ mục Tỉnh Đồng Nai MR1 Rơm mục Tỉnh Bình Thuận MR2 Rơm mục Tỉnh Bình Thuận 2.1.2 Dụng cụ thiết bị: • Cốc thủy tinh • Bình tam giác • Ống hút pipet • Ống đong • Ống nghiệm • Đĩa petri • Đèn cồn Địa điểm lấy mẫu 32   • Que cấy • Pipetman • Kính hiển vi • Tủ ấm • Lị viba • Máy lắc • Máy ly tâm • Tủ lạnh • Tủ cấy vô trùng • Nồi hấp khử trùng • Cân kỹ thuật… 2.1.3 Mơi trường hóa chất: ƒ Mơi trường PGA (Potato Glucose Agar): Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước cất đủ pH = 6,5 1000ml 33   ƒ Môi trường thử nghiệm phân giải cellulose: KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,2g (NH4)2SO4 0,2g Giấy lọc 10g Nước cất đủ 1000ml ƒ Thuốc thử lugol: I2 1g KI 2g Nước cất đủ 300ml 2.2 Phương pháp: 2.2.1 Phương pháp phân lập: Các mẫu gỗ mục rơm mục sau thu thập tự nhiên rải trực tiếp đĩa petri chứa môi trường PGA Q trình rải mẫu mơi trường PGA thực điều kiện vô trùng lửa đèn cồn tủ cấy vô trùng Các đĩa petri chứa mẫu giữ nhiệt độ phòng ngày để nấm mốc có điều kiện phát triển Sau đó, tiến hành quan sát tách riêng loại nấm mốc phát triển môi trường PGA, làm chủng nấm mốc phân lập cấy chủng nấm mốc vào ống nghiệm chứa môi trường PGA để bảo quản dùng cho thí nghiệm sau 34   2.2.2 Phương pháp xác định khả phân giải cellulose nấm mốc: Chuẩn bị bình tam giác chứa mơi trường thử nghiệm phân giải cellulose vô trùng với giấy lọc nguồn cellulose Tiến hành cấy chủng nấm mốc phân lập 100ml môi trường thử nghiệm phân giải cellulose, nuôi ủ 30oC lắc 200 vịng/ phút Thực mẫu đối chứng chứa mơi trường thử nghiệm phân giải cellulose không cấy nấm mốc Sau ngày, quan sát phát triển chủng nấm mốc môi trường thử nghiệm phân giải cellulose Tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy nấm mốc, thu dịch loại bỏ cặn Dịch nuôi sau ly tâm dùng để xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp khuếch tán thạch * Xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp khuếch tán thạch: Nhỏ dịch nuôi cấy nấm mốc sau ly tâm vào giếng thạch có đường kính 5mm Các giếng thạch tạo đĩa thạch chứa 1% CMC (Carboxymethyl cellulose) Thực mẫu đối chứng môi trường thử nghiệm phân giải cellulose không nuôi cấy nấm mốc Giữ đĩa petri chứa giếng thạch 30oC 24 Sau đó, tráng dịch lugol lên đĩa thạch, quan sát vòng phân giải tạo thành xung quanh giếng thạch 35   CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc: Sau tiến hành phân lập mẫu gỗ mục rơm mục, kết thu chủng nấm mốc khác theo bảng sau: Bảng 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc: Stt Ký hiệu chủng Màu khuẩn lạc Ký hiệu mẫu phân lập MG1 Xám đen BH1 MG2 Xám trắng BH1 MG3 Xanh rêu DN MG4 Xám đen BH2 MG5 Xám trắng BH2 MR1 Xám đen BT1 MR2 Xám đen BT2 Dưới hình ảnh số chủng nấm mốc phân lập được: 36   Hình 3.1 Chủng nấm mốc MG1 Hình 3.2 Chủng nấm mốc MG3 37   3.2 Khả phân giải cellulose nấm mốc: Các chủng nấm mốc phân lập từ mẫu gỗ mục rơm mục tiến hành nuôi cấy môi trường thử nghiệm phân giải celulose chứa giấy lọc nguồn cellulose, để thí nghiệm khả phân hủy giấy lọc chủng nấm mốc kích thích chủng nấm mốc tạo enzyme cellulase Kết thí nghiệm cho thấy chủng MG1 chủng MG3 có khả phân hủy làm nát giấy lọc sau ngày nuôi cấy môi trường thử nghiệm phân giải cellulose Sau hình ảnh khả phân hủy giấy lọc chủng MG1 chủng MG3 môi trường thử nghiệm phân giải cellulose, với diện mẫu đối chứng: Hình 3.3 Khả phân hủy giấy lọc chủng MG1 38   Hình 3.4 Khả phân hủy giấy lọc chủng MG3 Hình 3.5 Mẫu đối chứng thí nghiệm phân hủy giấy lọc 39   Sau đó, dịch ni cấy chủng nấm mốc môi trường thử nghiệm phân giải cellulose thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase phương pháp khuếch tán thạch Kết thu trình bày bảng sau đây: Bảng 3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase: Stt Ký hiệu chủng Khả tạo vòng phân giải cellulose MG1 (+) MG2 - MG3 (+) MG4 - MG5 - MR1 - MR2 - (+): tạo vòng phân giải cellulose, - : khơng tạo vịng phân giải cellulose Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase giải thích sau: mơi trường thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase chứa CMC nguồn cellulose Dung dịch lugol có khả tạo màu nâu với cellulose môi trường Khi dịch nuôi cấy nấm mốc chứa enzyme cellulase phân 40   hủy CMC môi trường tạo vịng phân giải khơng màu xung quanh giếng thạch tráng với dịch lugol Do đó, chủng nấm mốc có khả tạo vịng phân giải cellulose có khả tạo enzyme cellulase Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme cellulase bảng 3.2 cho thấy chủng MG1 chủng MG3 có khả tạo vịng phân giải cellulose Như vậy, chủng MG1 chủng MG3 có khả tạo lượng enzyme cellulase đáng kể có khả phân hủy cellulose chủng nấm mốc ứng dụng sau để sản xuất enzyme celulase sử dụng để phân hủy rác thải có nguồn gốc thực vật Các chủng nấm mốc lại MG2, MG4, MG5, MR1 MR2 khơng có khả phân hủy cellulose Dưới hình ảnh khả tạo vịng phân giải cellulose môi trường chứa CMC chủng nấm mốc: Hình 3.6 Khả tạo vịng phân giải cellulose chủng MG1 41   Hình 3.7 Khả tạo vịng phân giải cellulose chủng MG3 Hình 3.8 Chủng MR1 khơng tạo vịng phân giải cellulose 42   CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận: Sau tiến hành phân lập chủng nấm mốc từ mẫu gỗ mục rơm mục thu thập tự nhiên, kết thu chủng nấm mốc sử dụng cho thí nghiệm khả phân giải cellulose là: MG1, MG2, MG3, MG4, MG5, MR1 MR2 Sau đó, tiến hành thử nghiệm khả phân giải cellulose chủng nấm mốc phân lập môi trường chứa giấy lọc nguồn cellulose, để kích thích chủng nấm mốc tạo enzyme cellulase Từ kết đạt đưa kết luận sau: ƒ chủng nấm mốc MG1 MG3 có khả tạo enzyme cellulase phân hủy nguồn cellulose CMC giấy lọc chủng nấm mốc MG1 MG3 ứng dụng để sản xuất enzyme celulase sử dụng để phân hủy rác thải có nguồn gốc thực vật ƒ chủng nấm mốc MG2, MG4, MG5, MR1 MR2 khơng có khả tạo vịng phân giải cellulose nên khơng có khả phân hủy cellulose 4.2 Đề nghị: Đề tài nghiên cứu tiến hành phân lập chủng nấm mốc từ mẫu gỗ mục, rơm mục tự nhiên thử nghiệm khả phân giải cellulose chủng nấm mốc phân lập được, kết tuyển chọn chủng nấm mốc MG1 MG3 có khả phân hủy cellulose Để có 43   thể phát huy tiềm hữu ích chủng nấm mốc này, sau số đề nghị: ƒ Tiến hành định danh chủng nấm mốc MG1 MG3 đến mức loài ƒ Nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase từ chủng nấm mốc MG1 MG3 nguồn chất khác nhau, để thu nhận enzyme cellulase ứng dụng nhiều lĩnh vực ƒ Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm mốc MG1 MG3 để phân hủy rác thải có nguồn gốc thực vật 44   TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nxb Giáo Dục, 2003 [2] Đồng Thị Thanh Thu Sinh hóa ứng dụng Nxb Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, 2003 [3] Hồ Sĩ Tráng Cơ sở hóa học gỗ cellulose, tập Nxb Khoa Học Kỹ Thuật, 2003 ... Dưới hình ảnh số chủng nấm mốc phân lập được: 36   Hình 3.1 Chủng nấm mốc MG1 Hình 3.2 Chủng nấm mốc MG3 37   3.2 Khả phân giải cellulose nấm mốc: Các chủng nấm mốc phân lập từ mẫu gỗ mục rơm... cứu tiến hành phân lập chủng nấm mốc từ mẫu gỗ mục, rơm mục tự nhiên thử nghiệm khả phân giải cellulose chủng nấm mốc phân lập được, kết tuyển chọn chủng nấm mốc MG1 MG3 có khả phân hủy cellulose... lập chủng nấm mốc: Sau tiến hành phân lập mẫu gỗ mục rơm mục, kết thu chủng nấm mốc khác theo bảng sau: Bảng 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc: Stt Ký hiệu chủng Màu khuẩn lạc Ký hiệu mẫu phân lập