Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả năng phân giải lân, cố định đạm từ đất trồng cà phê tại tỉnh đắk lắk

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 2 TH¸NG 10/2020 67 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LÂN, CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ ĐẤT TRỒNG CÀ PHÊ TẠI TỈNH ĐẮK LẮK Nguyễn[.]

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LÂN, CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ ĐẤT TRỒNG CÀ PHÊ TẠI TỈNH ĐẮK LẮK Nguyễn Khoa Trưởng1, Lê Ngọc Triệu1, Nguyễn Văn Bình1, Nguyễn Thị Bích Liên1, Phan Trung Trực1, Lê Thị Hồng1, Trần Văn Tiến1 , Nguyễn Hắc Hiển2 TÓM TẮT Nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả phân giải lân, cố định đạm cao từ đất trồng cà phê Đắk Lắk, nhằm thay phân bón hố học, từ sản xuất phân vi sinh giúp nâng cao suất trồng, đồng thời làm giảm tác hại lên môi trường Kết từ 73 mẫu đất trồng cà phê thu huyện Cư Kuin Cư M’gar, tỉnh Đắk Lắk tuyển chọn dòng vi sinh vật có khả phân giải lân khó tan cao, QT05B1 thuộc loài Burkholderia ambifaria đạt 790,93 mg/L, ER1 F1 thuộc loài Aspergillus niger đạt 667,00 mg/L EBD1.1 thuộc loài Klebsiella aerogenes đạt 641,13 mg/L sau 96 ni cấy Và dịng vi khuẩn có khả cố định đạm tốt CF01 K3.1 thuộc loài Rhizobium leguminosarum với hàm lượng nitơ tổng số đạt 86,2 mg/L đạm amoni đạt 1,1 mg/L; CF01 K3.2 thuộc lồi Sphingobium yanoikuyae có hàm lượng nitơ tổng số đạt 69,7 mg/L đạm amoni đạt 1,3 mg/L QT03 K2 thuộc lồi Klebsiella pneumoniae có hàm lượng nitơ tổng số đạt 57,4 mg/L đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau 72 nuôi cấy Đây chủng vi sinh vật tiềm sử dụng sản xuất cà phê Đắk Lắk Từ khoá: Cố định đạm, Đắk Lắk, phân giải lân, vi sinh vật ĐẶT VẤN ĐỀ Trong xu hướng phát triển nông nghiệp hướng đến sử dụng giải pháp hữu cơ, hạn chế tối đa loại phân bón thuốc trừ sâu, bệnh hóa học Việc sử dụng chế phẩm sinh học nói chung vi sinh vật hữu ích nói riêng nhằm phịng, chống sâu, bệnh sử dụng hiệu nguồn đạm, lân sản sinh chất điều hòa sinh trưởng canh tác nông nghiệp trở nên ngày phổ biến Trong số vi sinh vật hữu ích sử dụng, có nhóm vi sinh vật vùng rễ quan tâm Vì q trình sinh trưởng nhóm vi sinh vật tiết chất trao đổi thứ cấp kháng vi sinh vật có hại, tăng khả hấp thu dinh dưỡng trồng, kích thích sinh trưởng cây, hịa tan dinh dưỡng đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để trồng hấp thụ (Weller, 1988) Việc sử dụng vi sinh vật vùng rễ để đưa vào chế phẩm vi sinh hỗ trợ nông nghiệp sở khoa học thực thực nhiều nơi giới (Vatsyayan Ghosh, 2013; Olle Williams, 2013) Trường Đại học Đà Lạt Email: truongnk@dlu.edu.vn Chi cục Trồng trọt Bảo vệ thực vật Đắk Lắk Đối với cà phê, nghiên cứu tính đa dạng khu hệ vi khuẩn cho thấy cà phê lâu năm có che bóng thành phần hệ vi khuẩn đa dạng non, khơng che bóng; mức độ đa dạng khu hệ có xu hướng tỷ lệ thuận với suất cà phê (Evizal et al., 2012) Do đó, vi khuẩn phân giải lân vùng rễ có khả thúc đẩy sinh trưởng cà phê đối tượng tiềm cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh bổ sung vào phân bón (Muleta et al., 2013) Trong năm gần đây, có nhiều nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật tiềm để ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học nhằm nâng cao chất lượng cà phê Đắk Lắk Nguyễn Thị Thanh Mai cộng (2018) phân lập tuyển chọn 16 chủng vi sinh vật vùng rễ, chủng CF19 có hoạt tính phân giải lân kali mạnh Tuy nhiên, nghiên cứu này, tác giả dựa vào đặc điểm hình thái nên chưa định danh tên chủng vi sinh vật phân giải lân kali, chưa nghiên cứu phân lập vi sinh vật cố định đạm Nhằm làm rõ tính đa dạng nhóm vi sinh vật có ích vùng rễ, việc phân lập tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả phân giải lân cố định đạm từ đất trồng cà phê tái canh Đắk Lắk thực Trong nghiên cứu này, bên cạnh đặc điểm hình N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 67 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ thái thị sinh học phân tử ứng dụng để định danh vi sinh vật tiềm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu đất thu theo đường kính tán cà phê, độ sâu - 20 cm huyện Cư Kuin huyện Cư M’gar tỉnh Đắk Lắk Mẫu ghi thông tin (địa chỉ, ngày thu mẫu), đựng túi nilon buộc kín, bảo quản thùng trữ lạnh chuyển Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Đà Lạt 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật Nghiền nhỏ, trộn mẫu đất thu Cân 10 g đất cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước muối sinh lý 0,85% vô trùng đồng mẫu Tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10-5 Hút 0,1 mL dung dịch mẫu sau pha loãng nồng độ từ 10-3 đến 10-5 cấy trang bề mặt đĩa petri chứa môi trường thạch NBRIP (Sadiq et al., 2013) để phân lập vi sinh vật phân giải lân môi trường Ashby để phân lập vi sinh vật cố định đạm Nuôi cấy mẫu 300C, thời gian từ 24 - 48 Sau thời gian nuôi cấy, chủng vi sinh vật có khả phân giải lân xác định cách quan sát vòng phân giải (vòng sáng quanh khuẩn lạc), đường kính vịng phân giải tính cơng thức D = D2 - D1 D2 đường kính vịng phân giải, D1 đường kính khuẩn lạc; chủng vi sinh vật có khả cố định đạm xác định theo khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc trịn, lồi, nhẵn bóng, nhầy gần suốt) môi trường Ashby lượng qua thời gian từ 24, 48, 72, 96 120 giờ; dịch nuôi cấy ly tâm 4.000 rpm 20 phút, hút mL dịch sau ly tâm, bổ sung mL dung dịch Amonium molybdate 2,5% SnCl2 2,5%, xử lý so màu bước sóng λ = 720 nm Hàm lượng nitơ tổng số dung dịch nuôi cấy định lượng theo TCVN 8557: 2010 hàm lượng đạm amoni (NH4+) theo TCVN 5988: 1995 2.2.3 Định danh dòng vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử Tách chiết DNA theo phương pháp CTAB có cải tiến cách bổ sung 7% thể tích SDS 10% vào đệm chiết, phá mẫu máy nghiền sử dụng chày tefflon Đối với vi khuẩn, DNA sau tách chiết được, tiến hành thực phản ứng PCR vùng 16S-rRNA cặp mồi 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’); 1492R (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’) (Gardes et al., 1993) Đối với vi nấm, sử dụng mồi ITS1F (5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A3′); ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3′) (White et al., 1990) vùng ITS1 –5.8S – ITS2 Sản phẩm PCR tinh kit tinh HI–412 PCR Purification ABT giải trình tự Cơng ty PHUSA BIOCHEMICAL (Việt Nam) Định danh vi khuẩn cách sử dụng công cụ BLAST để so sánh trình tự DNA dịng vi khuẩn với liệu ngân hàng gen NCBI 2.2.4 Xử lý thống kê Số liệu xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel kiểm định ý nghĩa thống kê theo phép thử Tukey HSD R 4.0.2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.2.2 Phương pháp định lượng khả phân giải lân khó tan định lượng nitơ tổng số, nitơ dễ tiêu (amoni) 3.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải lân khó tan Hàm lượng lân khó tan xác định dựa nồng độ PO43- có dung dịch nuôi cấy phương pháp so màu xanh molybdate (Vũ Thị Minh Đức, 2001) Chủng vi khuẩn vi nấm ni cấy bình tam giác chứa 50 mL môi trường NBRIP lỏng, nhiệt độ 300C, 150 rpm, mẫu lấy định Từ 73 mẫu đất phân lập 30 dòng vi sinh vật, bao gồm dòng vi nấm, dòng xạ khuẩn 22 dịng vi khuẩn Dựa vào đường kính vịng phân giải, tuyển chọn dòng vi khuẩn dịng vi nấm có đường kính vịng phân giải đạt từ 0,5 – 15,6 mm Kết thể bảng Bảng Đường kính vịng phân giải lân khó tan mơi trường NBRIP (Đơn vị tính: mm) STT 68 Dòng vi sinh vật QT05 B1 QT05 B5 CK10 B6 Ngày 4,7 ± 0,30l 0,3 ± 0,10c 0,0 ± 0,00c Ngày 10,7 ± 0,17a 0,5 ± 0,10cd 0,5 ± 0,10cd Ngày 15,6 ± 0,20b 1,5 ± 0,20efg 0,5 ± 0,87cd Ngày 15,6 ± 0,27b 2,0 ± 0,27eh 0,5 ± 0,05cd Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ CF01 B7 EBD1.1 CF12 F1 ER1 F1 ER2 B1 QT05 B3 1,2 ± 0,00fg 2,2 ± 0,17hk 1,0 ± 0,27df 4,44 ± 0,07l 0,5 ± 0,00cd 0,5 ± 0,10cd 2,1 ± 0,10eh 4,8 ± 0,27l 1,0 ± 0,00df 6,4 ± 0,13n 0,5 ± 0,10cd 1,6 ± 0,27efgh 3,0 ± 0,173ij 8,6 ± 0,10m 2,0 ± 0,17eh 13,0 ± 0,41o 1,5 ± 0,23efg 1,8 ± 0,17egh 3,5 ± 0,27i 10,8 ± 0,35a 3,0 ± 0,15ij 15,4 ± 0,30b 2,8 ± 0,27jk 2,2 ± 0,35hk Ghi chú: Trong ngày, số trung bình theo sau chữ giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD) dòng QT05 B1 đạt 15,6 mm, dòng EBD1.1 đạt 10,8 mm dòng ER1 F1 đạt 15,4 mm Dựa kết định tính khả phân giải lân khó tan, tiến hành định lượng hàm lượng PO43- Kết thể bảng Bảng Định lượng hàm lượng PO43- dòng vi sinh vật tuyển chọn (mg/L) Dòng vi sinh Thời gian vật 24 48 72 96 120 450,98 ± 3,01i 714,47 ± 1,31j 790,93 ± 0,74k 665,15 ± 0,74g 354,90 ± 0,74h QT05 B1 404,36 ± 0,74f 572,20 ± 1,02b 667,00 ± 1,59g 539,23 ± 1,31d 315,96 ± 1,31e ER1 F1 306,01 ± 1,88l 375,94 ± 1,88a 568,37 ± 1,02b 641,13 ± 1,02c 543,35 ± 1,88d EBD1.1 Bảng cho thấy dịng vi sinh vật có khả phân giải lân tăng từ ngày thứ 3, phân giải nhanh qua ngày thứ thứ Trong đó, ba dịng vi sinh vật có khả phân giải lân mạnh Ghi chú: Trong ngày, số trung bình theo sau chữ giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD) Các dịng vi sinh vật có khả phân giải lân tăng mạnh từ ngày nuôi cấy thứ cao vào ngày thứ 4, sau giảm dần vào ngày thứ trình ni cấy (Bảng 2) Việc giảm khả phân giải lân sau ngày nuôi cấy cho thấy môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng bắt đầu xuất chất độc hại ức chế sinh trưởng vi sinh vật Nguyễn Thị Thanh Mai cộng (2018) phân lập dòng vi khuẩn có khả phân giải lân với hàm lượng dao động từ 107,25 mg/L đến 145,55 mg/L Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh Nguyễn Hữu Hiệp (2019) phân lập dịng vi khuẩn có khả phân giải lân với hàm lượng từ 191,6 đến 241,3 mg/L Từ dẫn liệu trên, kết nghiên cứu tuyển chọn dòng vi sinh vật từ vùng đất trồng cà phê Đắk Lắk với hiệu phân giải lân từ 641,13 mg/L đến 790,93 mg/L sau ngày ni cấy Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào ba dòng vi sinh vật sau: dịng QT05 B1 có khuẩn lạc trịn đều, trắng mờ, nhầy nhớt, trực khuẩn gram âm (Hình 1); dịng EBD1.1 có khuẩn lạc hình trịn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, có chấm trịn giữa, viền khuẩn lạc đều, trực khuẩn gram âm (Hình 2); dịng ER1 F1 có khuẩn lạc trịn, hệ sợi màu trắng sinh bào tử màu đen, mọc nhô lên mặt thạch, viền khuẩn lạc mỏng, đều; sợi nấm phân nhánh có vách ngăn, cuống bào từ dài, thể bọng hình cầu lớn, thể bình dạng hình chai, đính bào tử hình cầu, kết thành chuỗi (Hình 3) 3.2 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả cố định đạm Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 69 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ hàm lượng nitơ dạng amoni (NH4+) từ 0,8 -1,3 mg/L (Bảng 3) Hình Định tính khả cố định đạm dòng vi khuẩn Từ 73 mẫu đất phân lập 19 dịng vi khuẩn có khả cố định đạm môi trường Ashby Kiểm tra khả bắt màu khuẩn lạc môi trường Ashby bổ sung 1% Congo đỏ (khuẩn lạc chuyển màu xám đến đen), chọn lọc dịng vi khuẩn có khả cố định đạm đất trồng cà phê tỉnh Đắk Lắk phân lập với mật độ đạt từ x 104 đến x 105 CFU/g Tiến hành định tính khả cố định đạm dịng vi khuẩn phân lập mơi trường Ashbyl lỏng với thuốc thử Nessler, kết thu nhận dịng có khả cố định đạm mạnh (dựa theo màu sắc phản ứng tạo màu) CF01 K3.1, CF01 K3.2 QT03 K2 (Hình 4) Bảng Hàm lượng nitơ tổng số nitơ dạng amoni (NH4+) cố định dòng vi sinh vật Chủng vi Nitơ (mg/L) N-NH4+ (mg/L) sinh vật c 1,1 ± 0,12d CF01 K3.1 86,2 ± 1,29 a 1,3 ± 0,02d CF01 K3.2 69,7 ± 2,52 57,4 ± 2,66b 0,8 ± 0,11e QT03 K2 Ghi chú: Trong ngày, số trung bình theo sau chữ giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD) Như vậy, dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 QT03 K2 phân lập cho thấy khả tổng hợp N-NH4+ (từ 0,8 - 1,3 mg/L NH4+) cao so với kết nghiên cứu Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh Nguyễn Hữu Hiệp (2019) 0,289 (mg/L NH4+) Kết xác định hàm lượng nitơ tổng số hàm lượng đạm amoni (NH4+) dung dịch nuôi cấy dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 QT03 K2 cho thấy, hàm lượng nitơ tổng số từ 57,4 - 86,2 mg/L Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào ba dịng vi khuẩn trên, mơ tả sau: CF01 K3.1 khuẩn lạc trịn, nhỏ, nhơ lên so với mặt thạch, màu trắng suốt, nhầy nhớt, trực khuẩn gram âm (Hình 5); dịng CF01 K3.2 có khuẩn lạc trịn, nhơ thấp so với thạch, màu vàng, trực khuẩn gram âm (Hình 6); dịng QT03 K2 có khuẩn lạc trịn đều, vàng, bề mặt bóng nhẵn, nhô thấp so với thạch, trực khuẩn gram âm (Hình 7) 3.3 Định danh dịng vi sinh vật tuyển chọn dựa liệu phân tử Giải trình tự gene vùng ITS1 - 5.8S - ITS2 vi nấm thu kích thước 575 bp, có độ tương đồng 100% với dòng vi nấm ngân hàng gene NCBI Trình tự gene vùng 16S chủng vi khuẩn với kích thước dao động từ 1.406 đến 1.456 bp có độ tương đồng cao, từ 98,95 - 99,93% so với dòng vi khuẩn ngân hàng gene NCBI (Bảng 4) Dòng vi khuẩn Burkholderia ambifaria khả phân giải lân chứng minh nghiên cứu cịn có khả phân hủy độc tố nấm mốc Fusaricacid ức chế phát triển chủng nấm Fusarium spp (Simonetti et al., 2018) Dòng nấm Aspergillus niger phân lập từ mẫu đất vùng nhiệt đới cận nhiệt đới chứng minh có khả phân giải lân qua nghiên cứu Chuang et al (2007) với nồng độ hịa tan AlPO4 dao động từ 67,5 đến 237 µg/mL Một số loài thuộc chi Klebsiella phân lập từ tầng sinh trồng Hàn Quốc chứng minh có khả phân giải lân khó tan với khả phân 70 N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ giải Ca3(PO4)2 dao động từ 107,7 đến 126,9 µg/mL Klebsiella pneumoniae, dịng vi khuẩn (Chung et al., 2005) chứng minh có khả cố định đạm tốt Dịng vi khuẩn Rhizobium leguminosarum thông qua nhiều nghiên cứu từ việc phân dịng vi sinh vật cộng sinh nốt sần lập, tuyển chọn nghiên cứu Shah et al họ đậu phổ biến, ngồi chúng cịn tìm thấy (1986), nghiên cứu thay đổi chất molybdate nhiều nơi khác chúng xâm chiếm rễ ảnh hưởng đến khả cố định nitơ Kahn et al cỏ Ba trắng (Gutiérrez et al., 2017; Iriarri et al., (1982) đến nghiên cứu phân tích, giải trình tự 2019) Dịng vi khuẩn Sphingobium yanoikuyae gen chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cố chứng minh có khả cố định nitơ định nitơ ruộng mía Colombia (Medinanghiên cứu Rodrigues et al (2018) với hai chủng Cordoba et al., 2019) có ký hiệu BU32 BU92 Đối với dòng vi khuẩn Bảng Kết so sánh trình tự tương đồng dịng vi sinh vật tuyển chọn với sở liệu NCBI Vùng bảo thủ dùng để định Kết định danh danh Dòng vi Căn định danh sinh vật Kích thước Mức độ tương Mã truy cập Tên loài Vùng (bp) đồng cao (%) Genbank Burkholderia ambifaria QT05 B1 16S-rRNA 1.456 ER1 F1 ITS1 – 5.8S – ITS2 575 EBD1.1 16S-rRNA 1.451 CF01 K3.1 16S-rRNA 1.406 (Palleroni and Holmes) Coenye et al Aspergillus niger van Tieghem Klebsiella aerogenes (Hormaeche and Edwards) Tindall et al Rhizobium leguminosarum (Frank) Frank (Approved Lists) 99,79% với dòng MC40-6 AF311972 100% với dòng SPZS49 KY607770 99,72% với dòng VITMSJ1 MH100730 99,35% với dòng CGAPGPBRS-025 KY495212 Sphingobium yanoikuyae Yabuuchi et al Klebsiella pneumonia 99,93% với dòng KM871860 CH 1-1-2 98,95% với dòng QT03 K2 16S-rRNA 1.439 KP973964 (Schroeter) Trevisan YJY5 KẾT LUẬN mg/L đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau 72 nuôi Từ 73 mẫu đất trồng cà phê tỉnh Đắk Lắk cấy Đây chủng vi sinh vật tiềm sử tuyển chọn dịng vi sinh vật có khả phân dụng sản xuất cà phê Đắk Lắk LỜI CẢM ƠN giải lân khó tan cao, QT05B1 thuộc loài Burkholderia ambifaria đạt 790.93 (mg/L), ER1 F1 Cơng trình sản phẩm đề tài “Nghiên thuộc loài Aspergillus niger đạt 667.00 mg/L cứu, ứng dụng vi sinh vật nội sinh vi sinh vật vùng EBD1.1 thuộc loài Klebsiella aerogenes đạt 641,13 rễ góp phần phát triển cà phê bền vững” Trường mg/L sau 96 ni cấy Và dịng vi khuẩn có khả Đại học Đà Lạt chủ trì Các tác giả xin chân thành cố định đạm tốt CF01 K3.1 thuộc loài cảm ơn UBND tỉnh Đắk Lắk, Sở Khoa học Công Rhizobium leguminosarum với hàm lượng nitơ tổng nghệ tỉnh Đắk Lắk cung cấp kinh phí nghiên cứu số đạt 86,2 mg/L đạm amoni đạt 1,1 mg/L; CF01 K3.2 thuộc loài Sphingobium yanoikuyae có hàm TÀI LIỆU THAM KHẢO lượng nitơ tổng số đạt 69,7 mg/L đạm amoni đạt Chuang, C C., Kuo, Y L., Chao, C C., Chao, 1,3 mg/L QT03 K2 thuộc loài Klebsiella W L., 2007 Solubilization of inorganic phosphates pneumoniae có hàm lượng nitơ tổng s t 57,4 CF01 K3.2 16S-rRNA 1.452 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 71 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ and plant growth promotion by Aspergillus niger Biology and Fertility of Soils, 43(5): 575-584 Fronehner) trồng tỉnh Đắk Lắk Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 55 (2): 34 - 40 Chung, H., Park, M., Madhaiyan, M., Seshadri, S., Song, J., Cho, H., Sa, T., 2005 Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea Soil Biology and Biochemistry, 37 (10): 1970 1974 11 Nguyễn Thị Thanh Mai, Chu Đức Hà, Phạm Phương Thu Nguyễn Văn Giang, 2018 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên Tạp chí Khoa học Nông nghiệp 60 (5): 34 - 38 Evizal, R., Tohari I D., Prijambada, I D., Widada J., Widianto D., 2012 Soil Bacterial Diversity and Productivity of Coffee - Shade Tree Agroecosystems Journal Tropical Soils, 17 (2): 181 - 187 Gardes, M., T D., 1993 Bruns, ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetesapplication to the identification of mycorrhizae and rusts Molecular Ecology, (2): 113 - 118 Gutiérrez, S P., 2017 Evaluación de rizobios para el desarrollo de un inoculante eficiente y competitivo de Trifolium repens Tesisde maestria Montevideo: Udelar FA Irisarri, P., Cardozo, G., Tartaglia, C., Reyno, R., Gutiérrez, P., Lattanzi, F A., Rebuffo, M., Monza, J., 2019 Selection of competitive and efficient rhizobia strains for white clover Frontiers in microbiology, 10: 768 Kahn, D., Hawkins, M., Fady, R R., 1982 Nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: nitrogenase levels and the effect of added molybdate on nitrogenase derepressed under molybdenum deprivation Microbiology, 128 (4): 779 - 787 Medina - Cordoba, L K., Chande, A T., Rishishwar, L., Mayer, L W., Valderrama-Aguirre, L C., Valderrama - Aguirre, A., Gaby, J C., Kostka, J E., Jordan, I K., 2019 Genomic characterization and computational phenotyping of nitrogen-fixing bacteria isolated from Colombian sugarcane fields BioRxiv: 780809 Muleta D., Assefa F., Borjesson E., Granhall U., 2013 Phosphate - solubilizing Rhizobacteria associated with Coffea arabica L in natural coffee forests of southwestern Ethiopia Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, 12: 73 - 84 10 Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh Nguyễn Hữu Hiệp, 2019 Tuyển chọn vi khuẩn có khả cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA nội sinh cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex A 72 12 Olle, M., Williams, I H., 2013 Effective microorganisms and their influence on vegetable production - a review Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 88 (4): 380 - 386 13 Rodrigures, A A., Arauro, M V F., Soares, R S., Oliveira, B F D., Ribeiro, I D., Sibov, S T., Vieira, J D G., 2018 Isolation and prospection of diazotrophic rhizobacteria associated with sugarcane under organic management Anais da Academia Brasileira de Ciências, 90 (4): 3813 - 3829 14 Sadiq, H M., Jahangir, G Z., Nasir, I A., Iqtidar, M., Iqbal, M., 2013 Isolation and characterization of phosphate - solubilizing bacteria from rhizosphere soil Biotechnology & Biotechnological Equipment, 27 (6): 4248 - 4255 15 Simonetti, E., Roberts, I N., Montecchia, M S., Gutierrez - Boem, F H., Gomez, F M., Ruiz, J A., 2018 A novel Burkholderia ambifaria strain able to degrade the mycotoxin fusaric acid and to inhibit Fusarium spp growth Microbiological Research, 206: 50 - 59 16 Shah, V K., 1986 Isolation and characterization of nitrogenase from Klebsiella pneumoniae Methods in enzymology Elsevier: 511 – 519 17 TCVN 5988: 1995 (ISO 5664: 1984) chất lượng nước - xác định amoni - phương pháp chưng cất chuẩn độ 18 TCVN 8557: 2010 phân bón - Phương pháp xác định nitơ tổng số 19 Vatsyayan, N., Ghosh, A K., 2013 Isolation and Characterization of Microbes with Biofertilizer Potential IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology, (4): - 20.Vũ Thị Minh Đức., 2001 Thực tập vi sinh vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội 21 Weller, D M., 1988 Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria Ann Rev Phytopathology, 26: 379 - 407 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 22 White, T J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR protocols: a guide to methods and applications, 18 (1): 315 - 322 ISOLATION, SELECTION OF PHOSPHATE AND NITROGEN FIXING SOLUBILISING RHIZOSPHERE MICROORGANISMS FROM COFFEE CULTIVATED IN DAK LAK PROVINCE Nguyen Khoa Truong1 , Le Ngoc Trieu1, Nguyen Van Binh1, Nguyen Thi Bich Lien1, Phan Trung Truc1, Le Thi Hong1, Tran Van Tien1, Nguyen Hac Hien2 Dalat University Department of Cultivation and Plant Protection, Dak Lak province Email: truongnk@dlu.edu.vn Summary The isolation and selection of phosphate and nitrogen-fixing solubilizing rhizosphere microorganism from coffee cultivated are necessary, which is the application of biofertilizer to replace inorganic fertilizer It could support high yield and keep a healthy environment In this study, 30 phosphates and N2-fixing were isolated from the rhizosphere of coffee cultivated in Cư Kuin and Cư M’gar district from Dak Lak province Among them, QT05B1 (Burkholderia ambifaria), ER1 F1 (Aspergillus niger) and EBD1.1 (Klebsiella aerogenes) were determined to exhibited the highest phosphate solubilization (790.93 (mg/L), 790.93 (mg/L), 641.13 mg/L; CF01 K3.1 (Rhizobium leguminosarum), CF01 K3.2 (Sphingobium yanoikuyae), QT03 K2 (Klebsiella pneumoniae) were determined to exhibited the highest ability of N2-fixing with 86.2 mg/L of 1.1 mg/L NH +, 69.7 mg/L of 1.3 mg/L NH4 + and 57.4 mg/L of 0.8 mg/L NH4 + after 72 hours of culture These are potential strains of microorganisms to be used for coffee production in Dak Lak province Keywords: N2 -fixing, Dak Lak, phosphate solubilization, microorganisms Người phản biện: PGS.TS Lê Như Kiểu Ngày nhận bài: 9/9/2020 Ngày thông qua phản bin: 9/10/2020 Ngy duyt ng: 16/10/2020 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 73 ... đến đen), chọn lọc dịng vi khuẩn có khả cố định đạm đất trồng cà phê tỉnh Đắk Lắk phân lập với mật độ đạt từ x 104 đến x 105 CFU/g Tiến hành định tính khả cố định đạm dịng vi khuẩn phân lập môi... Trevisan YJY5 KẾT LUẬN mg/L đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau 72 nuôi Từ 73 mẫu đất trồng cà phê tỉnh Đắk Lắk cấy Đây chủng vi sinh vật tiềm sử tuyển chọn dịng vi sinh vật có khả phân dụng sản xuất cà. .. dạng amoni (NH4+) từ 0,8 -1,3 mg/L (Bảng 3) Hình Định tính khả cố định đạm dịng vi khuẩn Từ 73 mẫu đất phân lập 19 dịng vi khuẩn có khả cố định đạm môi trường Ashby Kiểm tra khả bắt màu khuẩn