Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học 85 PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLYOXYETHYLENE TALLOW AMINE TẠI VIỆT NAM Châu Mỹ Quân*, Phạ[.]
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY POLYOXYETHYLENE TALLOW AMINE TẠI VIỆT NAM Châu Mỹ Quân*, Phạm Thị Thanh Trà Trường Đại học Tôn Đức Thắng * Tác giả liên hệ: myquan1224@gmail.com TÓM TẮT Polyoxyethylene tallow amine (POEA) chất hoạt động bề mặt ứng dụng rộng rãi lĩnh vực công nghiệp chất �� rửa, chất �� nhờn, chất bôi trơn, công nghệ nhuộm, chất nhũ hóa, chất tạo bọt, Lĩnh vực nông nghiệp POEA thường thêm vào sản ��ã ������ì ợc để tăng hoạt lực chất có hoạt tính thường gọi thành phần trơ sinh học Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu cho thấy POEA gây ảnh hưởng đến màng động vật thuỷ sinh cá động vật lư�ng cư có màng tiếp xúc với POEA gây phá hủy hormone động vật lư�ng cư Để hạn chế ảnh hưởng POEA đến sức khỏe người loài động vật thủy sinh phương pháp xử lý POEA cần quan tâm nghiên cứu Phương pháp xử lý sinh học, sử dụng vi sinh vật để phân hủy POEA ý không gây hại đến người giúp bảo vệ môi trường Trong nghiên cứu này, chúng em phân lập bảy chủng vi k��� gram âm có khả sử dụng POEA làm nguồn Carbon từ mẫu đất nông nghiệp ba vùng Bến Lức, Bình Phước, Long An Ba chủng vi k�� có khả phát triển mạnh lựa chọn để định danh dựa 16S rRNA gene Trình tự ba chủng vi k��� đưa lên Genbank với số truy cập là: Pantoea dispersa BL (MN153809), Klebsiella pneumoniae BP (LR588411.1), Kosakonia oryzae LA (MK530094.1) Các đánh giá khả phân hủy POEA chủng vi k������ì ợc tiến hành để làm rõ chế phân hủy POEA chủng vi k��� Từ khóa: Chất hoạt động bề mặt, Polyoxyethylene tallow amine, POEA, phân hủy sinh học ISOLATION OF BACTERIAL STRAINS ABLE TO DEGRADE POLYOXYETHYLENE TALLOW AMINE IN VIET NAM Chau My Quan*, Pham Thi Thanh Tra Ton Duc Thang University * Corresponding Author: myquan1224@gmail.com ABSTRACT Polyoxyethylene tallow amine (POEA) is a surfactant that is commonly used in industrial fields such as detergents, degreasers, lubricants, dyeing technology, emulsifiers, foaming agents, etc In agricultural fields, POEA is added to agrochemical formulation to increase active component and is commonly referred to as inert biocompatibility However, studies have shown that POEA affects membranes of aquatic animals such as fish and amphibians when exposed to POEA and destroys the hormones of amphibians Therefore, POEA treatmentconcerned and studied Bioremediation of POEA will be an enviromentally favorable method to restore enviroments In this study, seven strains gram-negative bacterial strains that are able to use POEA at sole Carbon source were isolated from agricultural soil samples of regions: Ben Luc district, Binh Phuoc province, Long An province Three bacterial strains with the high ability grow on POEA were selected for sequencing and identification The sequences of the three bacterial strains were deposited in Genbank with the accession numbers: Pantoea dispersa BL (MN153809), Klebsiella pneumoniae BP (LR588411.1), Kosakonia oryzae LA (MK530094.1) Futher study on biodegradation of POEA using these strains are investigated to get a better understanding of POEA biodegration pathway Keywords: Surfactant, Polyoxyethylene tallow amine, POEA, biodegrading 85 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học mặt không chứa ion, thuộc nhóm Alkylamine ethoxylates (ANEOs), sử dụng rộng rãi loại thuốc bảo vệ thực vật TỔNG QUAN Polyoxyethylene tallow amine (POEA), (Số CAS 61791-26-2): chất hoạt động bề Hình Cơng thức cấu tạo POEA POEA tổng hợp từ acid béo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN chuyển đổi thành amine béo sau CỨU phản ứng với ethylene oxide Phân tử POEA Vật liệu bao gồm amine bậc làm trung tâm, POEA từ công ty Sino Japan Chemicalnhánh bao gồm nhóm tallow hai nhánh Taiwan với độ tinh khiết 99% sử dụng đơn vị ethoxylate lặp lại (Hình 1) Nhóm chức dùng để đánh giá phân hủy vi khuẩn tallow amine hỗn hợp amine bắt Các thí nghiệm nghiên cứu sử dụng nguồn từ acid palmitic, acid oleic, acid stearic môi trường nuôi cấy: thành phần phụ khác Độ dài chuỗi Môi trường M9, thành phần lít mơi trường ethoxylate thay đổi theo hỗn hợp kỹ thuật M9 stock 5X bao gồm: 30 g Na2HPO4.2H2O, khác cung cấp tính chất vật 15 g KH2PO4, g NH4Cl, 2.5 g NaCl Bổ sung lý khác Mặc dù POEA chất hoạt thêm POEA để làm nguồn Carbon cho vi động bề mặt không ion, amine bậc ba khuẩn hoạt động base trở thành proton Môi trường LB Agar, thành phần lít mơi điều kiện acid trung tính; số phân trường LB Agar: 10 g Peptone, g Cao nấm men, 10 g NaCl, 20 g Agar ly acid (pKa) khoảng 6.5 -7.0 Hiện nay, giới có nghiên cứu Mơi trường ni cấy với mơi trường hoạt tính, độc tính phương pháp xử pha loãng đươc hấp khử trùng 121˚C lý POEA Hiện có nhóm 1atm 30 phút nghiên cứu khả phân hủy POEA, Phương pháp nhóm tác giả Rokade Mali (2012) Phân lập quan sát đặc điểm hình thái vi phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas k�� desmolyticum NCIM 2112 có khả phân Các chủng vi khuẩn nghiên hủy tallow amine ethoxylate thành phân lập từ đất nông nghiệp có sử dụng thuốc diệt cỏ vùng: Bình Phước (BP), Long ethylenmine acetamid Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu An (LA), Bến Lức (BL) nơi có mức độ sử phương pháp xử lý, phân hủy POEA mặt dù dụng thuốc trừ cỏ cao nhiều năm Chọn lượng tiêu thụ chất bảo vệ thực vật lọc chủng vi khuẩn có khả phát lớn Hiện tác động triển mạnh có hình thái khuẩn lạc khác chất hóa học lên sức khỏe người môi để tiến hành nghiên cứu Quan sát đặc trường ngày quan tâm nên hướng điểm hình thái khuẩn lạc nhuộm Gram để xử lý môi trường với biện pháp sinh học quan sát đặc điểm vi khuẩn thân thiện với mơi trường ý Phương pháp phân tích Trong nghiên cứu này, phương pháp xủ lý Môi trường M9 chứa 0.1% POEA sử POEA sử dụng chủng vi khuẩn phân lập dụng để nuôi cấy vi khuẩn, tăng trưởng chủng vi khuẩn xác định cách Việt Nam tiến hành Trong chủng vi khuẩn phân lấy 0.5 ml mẫu môi trường nuôi cấy đo quang lập, định danh đánh giá khả xử lý phổ hấp thụ OD 600 nm máy đo quang phổ GENESYS 10S UV-Vis POEA 86 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 khuẩn điều kiện khác chọn điều kiện tối ưu để vi khuẩn tăng trưởng Giải trình tự định danh chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn giải trình tự chủng phát triển tốt môi trường M9 với 0.1% POEA.Vi khuẩn giải trình tự 16S rRNA theo phương pháp Sanger công ty Phù Sa Biochem Sau giải trình tự, chủng vi khuẩn định danh dựa trình tự 16S rRNA cách dùng cơng cụ BLAST ngân hàng liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) Trình tự 16S rRNA chỉnh phần mềm BioEdit, Clustal X phiên 2.0.3 tiến hành xây dựng phân lồi với trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn công bố giới khả phân huỷ thuốc trừ cỏ Khảo sát điều kiện tối ưu cho tăng trưởng chủng v���� Nồng độ POEA: Sử dụng mơi trường M9 có chứa POEA nồng độ: 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, Nguồn Nitơ: thay nguồn nitơ môi trường M9 nguồn: Urea, NH4Cl, (NH4)2SO4 bổ sung 0.5% POEA Nuôi cấy 72 giờ, tăng trưởng chủng vi xác định cách lấy 0.5 ml mẫu môi trường nuôi cấy đo quang phổ đo độ hấp thụ OD 600 nm máy đo quang phổ GENESYS 10S UV-Vis Mỗi nghiệm thức lập lại lần, lấy giá trị trung bình Xây dựng đồ thị để so sánh tăng trưởng chủng vi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn Ban đầu mẫu đất có khoảng 108 đến 1010 vi sinh vật, trải qua lần ủ phân lập môi trường M9 số lượng vi sinh vật giảm xuống khoảng 102 đến 105, đồng thời việc bổ sung thêm 0.1% POEA giúp phân lập số vi sinh vật có khả sử dụng POEA nguồn Carbon Sau cấy trang ủ 24 nhiệt độ phịng, có chủng vi sinh vật khác bao gồm nấm mốc vi khuẩn môi trường, khuẩn lạc quan sát đa số có dạng hình trịn, nhỏ, lồi màu trắng đục màu vàng Lựa chọn 48 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc khác để cấy vạch nhằm mục đích sàng lọc làm chủng vi khuẩn khác Xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn Xây dựng đường cong sinh trưởng 48 chủng vi khuẩn sau làm ghi nhận lại qua 48 Dựa vào phát triển 48 chủng vi khuẩn ta chọn lọc chủng vi khuẩn phát triển tốt môi trường nuôi cấy M9 bổ sung 0.1% POEA: BL10-3 tube tube 4, BP10-3 tube tube 4, LA10-3 tube 1, LA10-5 tube tube OD(600nm) 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 -0.200 12h 24h Kỷ yếu khoa học 36h Time (hours) 48h BL 10-3 tube1 BL 10-3 tube4 BP 10-3 tube1 BP 10-3 tube4 LA 10-3 tube1 LA 10-5 tube1 LA 10-5 tube4 Bacillus Pseudomonas Hình Đồ thị thể phát triển chủng vi khuẩn sàng lọc từ 48 chủng vi khuẩn sau 48 ni cấy Theo đồ thị (hình 2) chủng chọn lọc có diễn có xu hướng lên để giải trình tự định thể thấy tăng trưởng mạnh mẽ danh Và Trong nghiên cứu hai chủng vi chủng vi khuẩn: BL10-3 tube 1, BP10-3 tube 1, khuẩn Bacillus subtilis, Pseudomonas LA10-3 tube Phát triển cao mẫu aeruginosa dùng làm đối chứng, theo đồ thị BL10-3 tube đạt khoảng 0.6 OD thấy hai chủng vi khuẩn làm mẫu đối 600nm mẫu LA10-3 tube mẫu chứng khơng có khả phát triển môi BP10-3 tube Dựa đồ thị hình thái trường chứa POEA nguồn Carbon khuẩn lạc chọn lọc chủng vi khuẩn Đặc điểm hình thái vi khuẩn có khả phát triển mạnh đường biểu 87 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kết chủng vi khuẩn sau nhuộm Gram quan sát kính hiển vi độ phóng Kỷ yếu khoa học đại 100X có thêm dầu soi chủng vi khuẩn thuộc Gram âm Hình Kết nhuộm Gram chủng vi khuẩn tương ứng từ trái sang phải là: Bến Lức, Bình Phước, Long An Đặc điểm khuẩn lạc quan sát khuẩn BP10-3 tube 1, LA10-3 tube có màu trắng lạc mẫu BL10-3 tube có màu vàng, cịn lại đục Hình dạng trịn Bề mặt nhẵn, bóng Hình Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tương ứng từ trái sang phải là: Bến Lức, Bình Phước, Long An liệu ngân hàng Genebank NCBI với kết Kết định danh bảng Trình tự gen 16S rRNA chủng vi nghiên cứu giải gửi vào sở Bảng Kết định danh chủng vi khuẩn có khả sử dụng POEA STT Ký hiệu BL10-3 tube BP10-3 tube LA10-3 tube Nguồn gốc Bến Lức Độ tương đồng 99.41% Bình Phước 99.78% Long An 99.93% Các dòng vi khuẩn sở liệu Pantoea dispersa RIBBSCM12 (MK905711.1) Klebsiella pneumoniae NCTC9170 (LR588411.1) Kosakonia oryzae VKA4 (MK530094.1) Định danh Pantoea dispersa BL (MN153809) Klebsiella pneumoniae BP (MN156286) Kosakonia oryzae LA (MN156288) (LR588411.1), K.oryzae LA (MK530094.1) Các chủng vi khuẩn phân lập có khả phân hủy POEA phát triển điều kiện bình thường, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng nghiên cứu vào thực tiễn để xử lý vấn đề môi trường tương lai Việc sử dụng vi khuẩn trình phân hủy sinh học POEA khơng hiệu mặt chi phí mà cịn đảm bảo an toàn mặt sinh thái KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Ba chủng vi khuẩn phân lập vi khuẩn Gram âm, sàng lọc từ mẫu đất nông nghiệp ba vùng Bến Lức, Bình Phước, Long An nơi có mức độ sử dụng thuốc diệt cỏ cao Trong nghiên cứu này, từ 48 chủng vi khuẩn ban đầu phân lập chủng vi khuẩn phát triển mạnh Trình tự 16S rRNA gen giải dùng để định danh, ba chủng xác định là: P.dispersa BL (MN153809), K.pneumoniae BP 88 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Cần tiến hành thêm nghiên cứu để khảo sát tương tác yếu tố ảnh hưởng đến phát triển chủng vi khuẩn sau khảo sát yếu tố riêng lẻ để môi Kỷ yếu khoa học trường có điều kiện phát triển tối ưu Nghiên cứu thêm khả phân hủy POEA tỷ lệ POEA vi khuẩn phân giải phương pháp HPLC TÀI LIỆU THAM KHẢO TUSH, D., M.T.J.E.S MEYER, AND TECHNOLOGY, Polyoxyethylene tallow amine, a glyphosate formulation adjuvant: soil adsorption characteristics, degradation profile, and occurrence on selected soils from agricultural fields in Iowa, Illinois, Indiana, Kansas, Mississippi, and Missouri 2016 50(11): p 5781-5789 TUSH, D., K.A LOFTIN, AND M.T.J.J.O.C.A MEYer, Characterization of polyoxyethylene tallow amine surfactants in technical mixtures and glyphosate formulations using ultrahigh performance liquid chromatography and triple quadrupole mass spectrometry 2013 1319: p 80-87 KEDAR, B AND V.J.I.R.J.O.B.S GAJANAn, Biodegradation of tallowamine ethoxylate by Pseudomonas desmolyticum NCIM 2112 2012 1(4): p 56-60 89 ... (2012) Phân lập quan sát đặc điểm hình thái vi phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas k�� desmolyticum NCIM 2112 có khả phân Các chủng vi khuẩn nghiên hủy tallow amine ethoxylate thành phân lập từ... dụng chủng vi khuẩn phân lập dụng để nuôi cấy vi khuẩn, tăng trưởng chủng vi khuẩn xác định cách Vi? ??t Nam tiến hành Trong chủng vi khuẩn phân lấy 0.5 ml mẫu môi trường nuôi cấy đo quang lập, ... thời vi? ??c bổ sung thêm 0.1% POEA giúp phân lập số vi sinh vật có khả sử dụng POEA nguồn Carbon Sau cấy trang ủ 24 nhiệt độ phịng, có chủng vi sinh vật khác bao gồm nấm mốc vi khuẩn môi trường, khuẩn