Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng biocellulose trên môi trường dịch dưa chuột (cucumis sativus l 1753)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== KHUẤT THỊ MAI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRÊN MƠI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT (CUCUMS SATIVUS L.1753) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== KHUẤT THỊ MAI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT (CUCUMS SATIVUS L.1753) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS NGUYỄN THỊ KIM NGOAN HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN ế ạo mà ột (Cucumis sativus.L.1753)” dưa Bo e o e rê mô rường dịch S ế ế - khoa Sinh – KTNN, Trung tâm Thông tin th n ế ộ 15 Khuất Th Mai m 2019 ỜI CAM ĐOAN ế ế ế ế ế 15 ă ê Khuất Th Mai 2019 MỤC LỤC MỞ ẦU 1 Lý ch tài M u N i dung nghiên c u Ý ng ph m vi nghiên c u ĩ ĩ mm ic c ti n tài 1.1 V trí phân lo Gluconacetobacter 1.1.1 Vị trí phân loại c a Gluconacetobacter sinh giới m 12 a - o a e o a er Gluconacetobacter 1.3 Biocellulose r mà Biocellulose ộ a mà r Biocellulose a e d 1.4 Biocellulose oe o a e o a er o a e o a er a Biocellulose t (Cucumis sativus) 1.4.1 Vị trí phân loại 1.4.2 Thành phần dinh dưỡng 1.4.3 ng d ng 1.5 Tình hình nghiên c u s n xu t Biocellulose hi n 1.5.1 Trên giới 10 1.5.2 Ở Vi t Nam 10 ỨU 12 21 12 ng 12 2.1.2 Hóa ch t thiết bị 12 2.1.3 Các loạ mô rườ 22 13 g pháp nghiên c u 15 ươ 15 ươ g pháp hóa sinh 17 ươ ươ m quan 18 o c 18 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 31 ă Biocellulose 20 3.1.1 Lên men t nhiên 21 3.1.2 Thu ch ng vi khu n t màng mẫu phân l p 21 32 ă Biocellulose 24 ax 24 3.2.1 Tuy n ch n ch ng có kh 3.2.2 Tuy n ch n ch ng có kh n hóa glycerol thành dihydroxyacetone 24 3.2.3 Tuy n ch n ch ng có kh ox ae a o ax 24 3.2.4 Tuy n ch n ch ng có kh ox a a e a e 25 3.2.5 Ki m tra hoạt tính catalase 25 3.2.6 Tuy n ch n ch ng có kh 3.3 Nghiên c ă ă Gluconacetobacter M1 M2 ạo mà rê mô rường lên men 26 Biocellulose n ch n 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LI U THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT MTPL :M ng phân l p MT1 :M ng gi gi ng MT2 :M ng nhân gi ng MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8, MT9 :M ng lên men PTN : Phòng thí nghi m DANH MỤC BẢNG B ng 1.1 m sinh hóa c a vi khu n Gluconacetobacter theo Frateur B ng 3.1 m c a ch ng phân l p 22 B ng 3.2 m, th i gian hình thành màng thí nghi m l p 29 DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Vi khu n Gluconacetobacter Hình 1.2 ng chuy n hóa cacbon c a vi khu n Gluconacetobacter Hình 3.1 Lên men t nhiên 21 Hình 3.2 Vịng phân gi i c a vi khu n CaCO3 Gluconacetobacter 24 Hình 3.3 Ch ng có ho 26 Hình 3.4 Lên men t o màng 26 Hình 3.5 Kết qu hình thành màng c a ch ng M1 27 Hình 3.6 Kết qu hình thành màng c a ch ng M2 27 Hình 3.7 Kết qu hình thành màng c a ch ng M3 27 Hình 3.8 Kết qu hình thành màng c a ch ng M4 27 Hình 3.9 Thí nghi m lên men t o màng ng: MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8, MT9 28 Hình 3.10 Lên men t o màng theo quy mô PTN 32 3.1 Quy trình phân l p vi khu n Gluconacetobacter môi ng d t 20 Bi 3.1 Th i gian hình thành, thu màng Biocellulose 30 Biocellulose ng d t 30 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài ế không g ế 40 ở ế ế ế Các nhà khoa h c nghiê ĩ ế ế M t nh ng ngu n nguyên li c quan tâm g n hay Biocellulose Hi n màng Biocellulose c xem ngu n nguyên li u m i có ti ă c ng d ng r t nhi ĩ c khác nh nghi p th c ph m, công ngh gi y, công ngh s n xu t pin ĩ c bi ĩ c y h c, màng Biocellulose cm ts c gi i nghiên c u ng d ng làm màng tr b ng, m t n ng da, m ch máu nhân t o [1] Trên gi i vi c nghiên c u Gluconacetobacter trình sinh t ng h p Biocellulose ng d ng c a Biocellulose b u t r t s m Nh ng nghiên c u tiên c a Brown A.J c ng s (1886) Tr kỷ ến Gluconacetobacter màng Biocellulose v n c s ý c a r t nhi u nhà khoa h c gi i Ở Vi t Nam, nghiên c u v Gluconacetobacter, màng Biocellulose ng d ng c a cịn v m i m Các nghiên c u công b v v r t khiêm t n, m i d ng nghiên c u trình t o màng Biocellulose ng d ng s n xu t th ch d a, làm giá th g n kết tế bào vi khu n làm màng tr b ng Trong nh ă m Vi sinh khoa Sinh KTNN, Tr ih m Hà N i phân l p, n ch c ch ng Gluconacetobacter xylinus (G xylinus) có kh ă o màng Biocellulose v i ă t ch ng t t ngu n nguyên li : ch t o, c M4 ẵ ẳ ế hình que, vi Quan sát v t kính 10 - 40 t tiêu b i v t kính d u có i 1000 l n Kết qu , c ch ng tế bào vi khu n u có d ng hình que, vi khu n b t màu h ng c a thu c nhu m Gram âm (b ng 3.1) D m hình thái c a ch ng Gluconacetobacter nghiên c u c a Kim Nhung (2012) [2], tế bào c a ch ng thu c h Acetobacteriaceae có hình d ng: que, thẳng ho ng riêng l Kết qu nhu m tế bào cho ch M1 M2 M3 M4 m hình thái gi ng v i ch ng thu c h Acetobacteriaceae Nh n th y nhóm vi khu n acetic có kh ă ng d ch th t m u màng r a b cc i b ph n l n vi sinh v t không mong mu n M phân l c axit hóa b ng axit n c chế s phát tri n c a ch ng vi sinh v t khác Tuy nhiên, ch ng thu c chi Gluconacetobacter cịn có r t nhi u ch ng vi khu s pH th p Vì v y, tiế nl n b ng cách l a ch n ch ng có kh ă y, t ng d t b sung glucose: 20(g), pepton: 5(g), (NH4)2SO4: 3(g), MgSO4.7H2O: 2(g), KH2PO4: 2(g), pH -6 phân l c ch ng Gluconacetobacter (kí hi u M1, M2, M3, M4) 23 3.2 Tuyển chọn chủng c khả n ng tạo trƣờng d ch dƣa chuột àng Biocellulose 3.2.1 Tuy n ch n ch ng có kh ax i Chúng tơi s d 2222 tiế c ki m tra ch n ch m c a Gluconacetobacter Kết qu , ng th ĩ a CaCO3 xu t hi n vòng sáng quanh khu n l ng kính 2,5÷3 mm (hình 3.2) Do vi khu n có kh ă axit phân gi i CaCO3 ng chuy n màu tr ng s a sang màu sáng trong, làm xung quanh khu n l c xu t hi n vòng sáng su t theo : H+ + CaCO3 → 2+ + H2O + CO2 Hình 3.2 Vòng ph n giải vi khuẩn CaCO3 Gluconacetobacter 3.2.2 Tuy n ch n ch ng có kh dihydroxyacetone S d n hóa glycerol thành 2.2.3 Kết qu , c ch u xu t hi n kết t có s t o thành dihydroxyaceton g ch c a Cu2O, ch ng t Kết qu phù h p v m phân lo i c a Frateur (1950) nghiên c u c Kim Nhung công s (2013) [3] ox 3.2.3 Tuy n ch n ch ng có kh ae a o ax Theo Bergey (2005) vi khu n acetic thu c h Acetobacteriaceae g m chi Gluconacetobacter Gluconobacter H có kh ă ethanol thành axit acetic Axit ng có ch a Blue 24 Bromophenol 0.04% chuy n t màu xanh l c sang màu vàng (hình 3.4) Các ch ng thu c chi Gluconacetobacter có kh ă i tiếp t c acid acetic thành CO2 H2O ph c h i màu xanh c ng c l i, ch ng thu c chi Gluconobacter khơng có kh ă i axit acetic nên môi ng v n gi màu vàng Kết qu c ch ng n ch ng u có kh ox 3.2.4 Tuy n ch n ch ng có kh ă c h i màu xanh c a aa eae Theo Bergey (2005), chi Gluconacetobacter chi Glucobacter có kh ă có vi khu n thu c chi Gluconacetobacter m i có kh ă T ng có ch a calcium acetate, ch ng vi khu n thu c chi Gluconacetobacter có kh ă d ng mu i acetate làm ngu n cacbon oxy hóa axit acetic thành CO2 H2O; gi ng th i gi i phóng Ca2+ t o vịng phân gi i xung quanh khu n l c Kết qu , ch ng phân l u t o thành vòng phân gi i xung quanh khu n l c, có kh ă C ch ng M1, M2, M3, M4 m phù h p v m phân lo i c a Frateur (1950) nghiên c u khác: có kh ă chuy n hóa glycerol thành dihydroxyacetone, oxy hóa ethanol thành axit, oxy hóa acetate y, chúng tơi n ch c ch ng M1, M2, M3, M4 u thu c chi Gluconacetobacter, h Acetobacteriaceae 3.2.5 Ki m tra hoạt tính catalase Nh H2O2 3% lên khu n l c theo 2221 ( ki m tra ho t tính catalase) Kết qu , ch u xu t hi n s i b t khí ch ng t ch ng vi khu t tính castalase (+) (hình 3.3) 25 Hình 3.3 Chủng c hoạt tính casta ase dƣơng tính 3.2.6 Tuyển chọn chủng có khả tạo màng môi trường lên men Kh o sát kh ă o màng Biocellulose c a ch p ng lên men (MT3), ni c y nhi phịng thí nghi m, u ki ĩ ết qu cho th y có hình thành màng, nhiên th i dày, nhẵn khác (hình 3.4) Hình 3.4 ên en tạo àng Màng hình thành t hai ch ng M1 M2: dai, nhẵn, màng hình thành t ngày th dày 0,2-0,4mm (hình 3.5), (hình 3.6) Màng hình thành t ch ng M3: m ng, m n, tách màng s m, d chìm, màng hình thành t ngày th (hình 3.7) Màng hình thành t ch ng M4: m ng, m d ng rõ ràng (hình 3.8) 26 ng, khơng có hình Hình 3.5 Kết hình thành màng chủng M1 Hình 3.6 Kết hình thành màng chủng M2 Hình 3.7 Kết hình thành màng chủng M3 Hình 3.8 Kết hình thành màng chủng M4 Kết qu ch ng M1, M2 cho màng dai, nhẵn, có hình d ng nh nh, th i gian hình thành màng s m, chúng tơi quyế nh l y ch tiến hành ki m tra b n ch t cellulose c 2.2.2.4 Kết qu màng chuy n sang màu xanh lam y có th t m khẳ nh hai ch 27 M1 M2 u G xylinus 3.3 Nghiên cứu khả n ng tạo àng Biocellulose hai chủng Gluconacetobacter M1, M2 tuyển chọn Nh n th y ch ng M1, M2 cho màng dai, nhẵn, có hình d ng nh t nh, màng hình thành s m, chúng tơi quyế nh l y ch tiến hành l p l i thí nghi ng lên men (hình 3.9) Hình 3.9 Thí nghiệm lên men tạo màng c c i trƣờng: MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8, MT9 Kết qu (b 2) ng d ≥ 60% m, gi c tính dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh nh, màng hình thành t ngày th 4, thu màng sau t t l thu n v i th i gian lên màng, thu màng (bi 3.1) ng d t b ng 0% v c màng Biocellulose m ng, dai, có hình d ng nh nh Tuy v y, th i gian hình thành màng ngày th thu màng ngày th 10, ch t nhi u so v ng d ≥ 60% y, d t m ng t t cho trình lên men, m b o màng Biocellulose t o thành có c tính dai, nhẵn, gi c ph m ch t t t: m n, m ng ho c dày, gi Biocellulose c c d a c nghiên c ng c vo g o c Kim Nhung c ng s (2013) [3] t ngu n nguyên li u có sẵn, ph biến t t c vùng mi n c, ngu nh t u ki n cho trình nghiên c u D t m ng m i, ti ă p, 28 d mua d b o qu n d dàng, ch ng vi khu n Gluconacetobacter phát tri n t t, màng Biocellulose t o ch ng Bảng 3.2 Đ c điểm, thời gian hình thành màng thí nghiệm l p M ng lên men c Th i gian hình thành màng Th i gian thu màng MT3 Màng dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT4 Màng dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT5 Màng dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT7 Màng dày, dai, có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT7 Màng m ng, dai,có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT8 Màng m ng, dai,có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th MT9 Màng m ng, dai,có hình d ng nh nh Ngày th Ngày th 10 29 12 10 Ngày 100 80 Hà 60 50 40 20 ƣợng d ch dƣa chuột (%) Biểu đồ 3.1 Thời gian hình thành, thu màng Biocellulose T thí nghi m, chúng tơi xây d ng quy trình lên men t o màng Biocellulose ng d t theo quy mơ phịng thí nghi m ( 3.2) Thu màng Lên men Sơ đồ 3.2 Quy trình lên men tạo màng Biocellulose i trƣờng d ch dƣa chuột 30 c 1: T o d nhuy n l c l y d ch c 2: B sung ch thành dung d ch hòa tan (có th u h p nh a ng d t, l a ch ng vào d a s ch, xay t, khu hóa ch ut o u) c 3: H p trùng, s d ng n i h p Tommy, trùng môi t 1120C 15 phút c 4: Làm ngu ngu i d ki n phịng thí nghiêm, box c y vơ trùng 10-15 lo i b bào t s ng ng c 5: B sung gi ng, b sung 10 – 20% gi ng p trùng u ế c tím t t o thành d ch lên men c 6: T o d ch lên men, b sung 2% axit acetic vào d ă n s nhi m khu n, phát tri n c a vi sinh v t gây th i tở c 7: Tiến hành lên men t o màng (hình 3.10) Ph l p v i m ng vô trùng lên mi ng h p nh nhi phịng thí nghi m, u ki ĩ c 8: Thu màng, sau ngày d ch lên men b màng tr ng, dai nhẵn, n i b m tiến hành thu màng kết thúc trình lên men 31 u xu t hi n l p ngày Hình 3.10 ên en tạo 32 àng theo quy PTN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ng d t b sung glucose: 20(g), pepton: 5(g), (NH4)2SO4: 3(g), MgSO4 7H2O: 2(g),KH2PO4: 2(g), pH -6 phân l c4 ch ng Gluconacetobacter (kí hi u M1, M2, M3, M4) Tuy n ch c2 ch ng M1 M2 cho màng Biocellulose dai, dày, nhẵn, có hình d ng nh t nh màng hình thành t ngày th 4, thu màng sau ngày ng d t ≥ 60% m, gi c tính dày, dai, nhẵn, có hình d ng nh nh, màng hình thành t ngày th 4, thu màng sau ngày lên màng T ng quy trình lên men t o màng Biocellulose ng d t Kiến ngh 2.1 Tiếp t c nghiên c u ki n ến trình t d ởng c a yếu t ng d 2.2 Nghiên c u ng d ng c a màng Biocellulose t o t t 33 u t ng TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] ươ (1996) Acetobacter d m ê mộ ro m ê me a da e ề r m a eo (2012) [2] Acetobacter, Bộ ( - 2012) M [3] ế ” Gluconacetobacter [4] ỳ 361 [5] M [6] dư (2013) ”M K oa , ă (2006) Acetobacter xylinum (2011) (1976) ộ ươ ê 1- 2- [7] Nguy n Th Nguy t (2008), Nghiên c u vi khu n Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm m t n ng da Lu n án thạ ĩ h ội B TÀI LIỆU TIẾNG ANH [8] Barbara Surma – (2008) ’ z O f f TEXTILES in Eastem Europe, vol.16, No.4, pp.108-111 [9] Brown J (1886) ” f w f Soc., 49, 432-439 34 w z f ” FIBRES ” J Chem [10] zj W J w M w R M (2007) ” f f ” Biomacromolecules, Vol 8, pp 1-12 [11] M R O (2007) ” f ” International symposium on natural polymers and composites [12] J w M R (2005) ” w ronic paper displays made f ” 66 Apply microbiol Biotechnol, 2005, pp 352-355 [13] J R (1998) ” f ” Polym, Gegrad Stab, 59: 101-106 [14] J w (2007) Effect of culture conditions on bacterial cellulosee (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 and physical properties of BC parchment paper” Vol 14, N o 4, Suranaree J.Sci Technol, 2007, p 357- 365 [15] Wojciech K Czaja, David J.Young, Marek Kawecki, Malcolm Brown R J ( 2007) f f ” Biomacromolecules, 2007, pp.1-12 [16] M J (2000) ” ification ò ” Cellulose 7: 213-225 [17] http://thuocnam.edu.vn/cac-mon-an-bai-thuoc-che-bien-tu-dua-chuot [18] http://camnangcaytrong.com/cay-dua-chuot-dua-leo-cd29.html [19] https://ppp.com.vn/bai-viet/mat-na-giay-truyen-thong-va-mat-na-biocellulose 35 PHỤ LỤC H nh Màng BC i trƣờng ên H nh Kích thƣớc àng thu đƣợc 36 en H nh Bảo quản giống H nh Kiể i trƣờng thạch nghiêng tra chất ce u ose 37 àng BC ... màu lam + 1.3 Biocellulose r mà Biocellulose Màng sinh h c (Bacterial cellulose; Biocellulose; ) c t o vi khu n Gluconacetobacter, có c ng nh t v i cellulose c a th c v t Tuy nhiên, Biocellulose. .. HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== KHUẤT THỊ MAI PHÂN L? ??P, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRÊN MƠI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT (CUCUMS SATIVUS L. 1753) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP... d ng l? ?m màng tr b ng, m t n ng da, m ch máu nhân t o… Trong ngành m ph m, màng Biocellulose c s d ng l? ?m m t n ng da vi sinh Biocellulose mask Biocellulose mask c s n xu t t ngu n nguyên li cd