BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÙNG GENE 16S DNA CHỦNG VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TỐ Ở HỒ DẦU TIẾNG Ngành Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngà[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÙNG GENE 16S DNA CHỦNG VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TỐ Ở HỒ DẦU TIẾNG Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS Hoàng Quốc Khánh HVCH Ngô Đức Duy Sinh viên thực MSSV: 1311101028 : Khưu Văn Quang Lớp: 13DSH06 TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan nội dung đồ án tốt nghiệp người thực đề tài làm Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, hướng dẫn TS.Hồng Quốc Khánh HVCH.Ngơ Đức Duy Các số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực, không chép từ báo cáo công bố trước Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí khoa học trang web theo danh mục tài liệu đồ án Nếu sai người thực đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kỷ luật khoa nhà trường đề Sinh viên thực Khưu Văn Quang LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM, hướng dẫn tận tình Thầy Cơ, anh chị bạn, em hoàn thành tốt báo cáo Em xin chân thành cảm ơn đến: Thầy Ngô Đức Duy phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Thầy Hoàng Quốc Khánh thầy Nguyễn Hồng Dũng phịng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM giúp đỡ tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp đây, nhiệt tình hướng dẫn hỗ trợ để em thực tốt đồ án tốt nghiệp Chị Lê Quỳnh Loan bên cạnh giúp đỡ, chia kiến thức, kinh nghiệm tất anh chị, bạn nghiên cứu phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM nhiệt tình giúp đỡ dạy cho em nhiều điều suốt trình nghiên cứu Tồn thể Thầy Cơ khoa CNSH-TP-MT trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh người tận tâm dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em ngày hôm Các bạn lớp 13SH06 quan tâm, giúp đỡ chia thứ với suốt quãng đường thời sinh viên Cuối cùng, xin cảm ơn Ba Mẹ ni nấng, chăm sóc, dạy dỗ cho ăn học thành người có ích cho xã hội Sinh Viên Thực Hiện Khưu Văn Quang MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU…………………………………………………… …………………1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tin sinh học 1.1.1 Sự đời tin sinh học .5 1.1.2 Khái niệm Tin sinh học .5 1.1.3 Vai trò xu hướng phát triển tin sinh học 1.1.4 Cây phát sinh loài 1.1.5 Công cụ cách tiến hành 1.1.6 Đánh giá kết 1.2 Tổng quan định danh sinh học phân tử .8 1.2.1 Các phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số 1.2.2 Phương pháp PCR ứng dụng 11 1.3 Tổng quan vi khuẩn lam 13 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn lam 13 1.3.2 Hình thái cấu trúc tế bào 14 1.3.3 Phân loại vi khuẩn lam .15 1.3.4 Hiện tượng nở hoa vi khuẩn lam 16 1.3.5 Độc tố microcystins 17 1.3.6 Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin 2-methylisoborneol 20 1.3.7 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam độc tố vi khuẩn lam 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Thời gian địa điểm 25 i 2.2 Vật liệu, thiết bị hóa chất 25 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 25 2.2.2 Nguồn mẫu 25 2.2.3 Hóa chất 25 2.3 Phương pháp thu mẫu 27 2.3.1 Phương pháp phân lập 27 2.3.2 Phương pháp nuôi tăng sinh khối thu sinh khối vi khuẩn lam .27 2.3.3 Định danh chủng vi khuẩn lam sinh học phân tử .28 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR: 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Kết ly trích thu nhận DNA gene hình thái vi khuẩn lam 35 3.2 Kết đo nồng độ DNA gene sau ly trích thu nhận 36 3.3 Kết khuếch đại đoạn gen 16S DNA kỹ thuật PCR 37 3.3.1 PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 37 3.3.2 PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R .38 3.4 Kết tinh sản phẩm PCR chủng vi khuẩn lam .39 3.5 Kết giải trình tự vùng gen 16S DNA chủng vi khuẩn lam 39 3.5.1 Mẫu (chủng Microsystis) 39 3.5.2 Mẫu 10 (chủng Anabaena) 40 3.5.3 Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) 40 3.5.4 Mẫu 31(chủng plantothrix) 41 3.6 Kết so sánh trình tự gen ngân hàng NCBI xây dựng phát sinh loài 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribo Nucleic Axit RNA Ribonucleic Acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction UV Ultraviolet TAE Tris acetate ethylenediaminetetraacetic acid MCs Microcystins MIB Methylisoborneol ITB Institute of Tropical Biology CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide Cs Cộng SDS Sodium dodecyl sulfate Bp Base pairs UV Ultra violet iii DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn lam nở hoa Hồ Dầu Tiếng 17 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học loại độc tố microcystins thường gặp 18 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Geosmin 2-methylisoborneol MIB 21 Hình 2.1 Sinh khối vi khuẩn lam 28 Hình 2.2 Quy trình phản ứng PCR 31 Hình 3.1 Kết thu nhận DNA gene vi khuẩn lam gồm chủng gel agarose 1,5 35 Hình 3.2 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 37 Hình 3.3 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R 38 Hình 3.4 Kết điện di gel agarose chủng vi khuẩn lam sau tinh 39 Hình 3.5 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gene 16S DNA chủng Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis với vi khuẩn lam ngân hàng NCBI…………… ………………………………………….……42 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chu trình nhiệt cặp mồi CYA371F 373R 32 Bảng 2.2.Chu trình nhiệt cặp mồi CYA-F CYA-R .33 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ DNA gene sau thu nhận 36 v Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việc gia tăng dân số, phát triển ngành công nghiệp, nông nghiệp làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu ni tơ phốt pho) đáng kể vào thủy vực Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ngày quan trọng thủy vực sông, hồ, đầm nuôi trồng thủy sản kèm với tượng nở hoa nước mà thực chất phát triển mạnh mẽ quần xã thực vật chủ yếu vi khuẩn lam (VKL) Vi khuẩn lam sinh vật xuất trái đất cách hàng tỷ năm tồn ngày Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam đóng vai trị quan trọng sinh thái thủy vực cung cấp nguồn lượng sơ cấp cho chuỗi thức ăn thủy vực, đồng thời giải phóng lượng oxy vào khơng khí thơng qua q trình quang hợp Tuy nhiên, bên cạnh đóng góp tích cực tượng tăng trưởng bùng phát hay gọi nở hoa vi khuẩn lam gây nhiều ảnh hưởng xấu lên chất lượng môi trường nước, tài nguyên thủy sản cân hệ sinh thái Trong số lồi nhóm vi sinh có khả sản sinh độc tố Ở nước ta, vi khuẩn lam sinh độc độc tố chúng thường xuất thủy vực nước Chúng có khả sản sinh loại độc tố neurotoxin (độc tố thần kinh) hepatotoxin (độc tố gan) Độc tố nhóm vi sinh tác động nguy hiểm tới sinh vật thủy sinh sức khỏe người Do Tổ chức Y tế giới (WHO) quy định nồng độ giới hạn nước uống không vượt µg/L Ngồi số chủng cịn sinh hợp chất gây mùi hôi nước Ở Việt Nam ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu ô nhiễm chất hữu cơ, chất dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, có tảo độc diễn phổ biến tác động hoạt động người lưu vực sông, hồ Tại hồ hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc Đồ Án Tốt Nghiệp quan sát thấy diện vi khuẩn lam độc chủ yếu loài thuộc Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis Hồ Dầu Tiếng hồ chứa nước nhân tạo có chức ngăn lũ, cấp nước sinh hoạt, tưới tiêu, rửa mặn, cải thiện chất lượng nước nuôi trồng thủy sản Là nguồn cung cấp trực tiếp gián tiếp nước sinh hoạt tưới tiêu cho hàng triệu dân Tây Ninh, Bình Dương TP.Hồ Chí Minh Hiện nay, nghiên cứu cho thấy thành phần vi khuẩn lam hồ Dầu Tiếng đa dạng tượng nở hoa vấn đề quan trọng mang tính cấp bách Vi khuẩn lam nở hoa độc tố chúng sinh gây ảnh hưởng lớn tới sinh vật thủy sinh, động vật sống xung quanh hồ sức khỏe người Phần lớn nghiên cứu nước ta tập trung vào đánh giá đa dạng nhóm vi sinh thủy vực, đặc điểm hình thái nghiên cứu độc tính thực vật động vật thủy sinh Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam Và đề tài khảo sát diện chủng vi khuẩn lam có khả gây độc tố hồ Dầu Tiếng Mục đích nghiên cứu Mục đích đề tài định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả gây độc tố Hồ Dầu Tiếng Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập số loài vi khuẩn lam hồ Dầu Tiếng Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa theo hình thái học sinh học phân tử Khảo sát diện có mặt chủ yếu loài vi khuẩn lam hồ Dầu Tiếng Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu, phân lập mẫu nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối vi khuẩn lam Đồ Án Tốt Nghiệp Phương pháp tách chiết thu nhận gene DNA (theo phương pháp CTAB) Phương pháp PCR dựa đoạn mồi 16S DNA Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene 16S DNA lồi vi khuẩn lam Đề tài có sử dụng phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 Ngân hàng gene https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu tham khảo từ nghiên cứu, báo khoa học, luận văn khoa học sưu tầm internet Các kết đạt đƣợc Sau trình nghiên cứu đề tài tách chiết chủng vi khuẩn lam dựa vào bước định danh sinh học phân tử, dựa nghiên cứu nước lồi vi khuẩn lam có khả gây bệnh nguy hiểm thực vật, động vật nguyên sinh người Và chọn lọc đoạn mồi thích hợp để định danh chủng vi khuẩn lam Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis Kết cấu đề tài Đề tài gồm chương Chương 1: Tổng quan Trình bày đời, khái niệm, vai trò xu hướng phát triển tin sinh học để dựng phát sinh loài Giới thiệu kỹ thuật PCR ứng dụng chủ yếu PCR để sử dụng định danh vi khuẩn lam Giới thiệu tổng quan vi khuẩn lam, hình thái, cấu trúc tế bào, phân loại tượng nở hoa lồi vi khuẩn lam, tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam nước Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Đồ Án Tốt Nghiệp Trình bày thời gian địa điểm thu mẫu, hóa chất, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu tồn quy trình, thao tác thực phương pháp nghiên cứu thu mẫu, phân lập, nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối, định danh, phương pháp ly trích DNA, đo OD, điện di, tinh DNA giải trình tự gene Chương 3: Kết biện luận Trình bày biện luận kết chi tiết toàn trình thực nghiên cứu Chương 4: Kết luận đề nghị Tổng kết lại kết nghiên cứu đạt đưa đề nghị liên quan nhằm hoàn thiện đề tài Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tin sinh học 1.1.1 Sự đời tin sinh học Do xuất thông tin cấu trúc, chức trình tự protein, DNA từ dẫn tới nhu cầu quản lý, so sánh dự đốn cấu trúc chức chúng Ngồi ra, phát triển ngành khoa học khác cơng nghệ thơng tin, máy tính hình thành mơn khoa học Tin sinh học (bioinformatics) 1.1.2 Khái niệm Tin sinh học Tin sinh học (bioinformatics) mơn học cách sử dụng máy tính để giải vấn đề khoa học sống, chủ yếu vấn đề sở liệu phong phú gen, trình tự protein… Tin sinh học (bioinformatics) lĩnh vực khoa học sử dụng cơng nghệ ngành tốn học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học hóa sinh (biochemistry) để giải vấn đề sinh học Một thuật ngữ thường dùng thay cho tin sinh học sinh học tính tốn (computational biology) Tuy nhiên, tin sinh học thiên việc phát triển giải thuật, lý thuyết kĩ thuật thống kê tính tốn để giải toán bắt nguồn từ nhu cầu quản lý phân tích liệu sinh học Trong đó, sinh học tính tốn thiên kiểm định giả thuyết (hypothesis) đặt vấn đề sinh học nhờ máy tính thực nghiệm liệu mơ phỏng, với mục đích phát nâng cao tri thức sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ tương tác protein, dự đoán cấu trúc bậc phân tử protein, v.v.) Ngồi cịn giải vấn đề kỹ thuật mơ hình cấu trúc ba chiều phân tử hệ thống sinh học Đồ Án Tốt Nghiệp Các ngành Tin sinh học bao gồm: tin sinh học genome, tin sinh học protein, tin sinh học tiến hóa, tin sinh học nơng nghiệp, tin sinh học y học, phát triển công cụ sở Thuật ngữ bioinformatics định nghĩa cách ngắn gọn kết hợp công nghệ sinh học công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết khám phá nguyên lý sinh học (National Center for Biotechnology Information) 1.1.3 Vai trò xu hướng phát triển tin sinh học 1.1.3.1 Vai trò Tin sinh học - Tập hợp, lưu trữ, xếp, truy xuất sở liệu - Hỗ trợ cho việc tìm kiếm, phân tích, xử lý dự đoán kết nghiên cứu - Hỗ trợ nghiêm cứu cấu trúc không gian phân tử - Hỗ trợ nghiên cứu đa dạng tiến hóa sinh vật 1.1.3.2 Xu hướng phát triển Tin sinh học Những lĩnh vực Tin sinh học tập trung nghiên cứu: + Quản lí sở liệu + Phân tích, biên dịch liệu + Phát triển thuật toán + Các cấu trúc sở liệu + Thiết kế giao diện hiển thị 1.1.4 Cây phát sinh loài Cây phát sinh loài (tiếng Anh: phylogenic tree) miêu tả lịch sử tiến hóa nhóm lồi (species) với đặc tính khác có mối quan hệ họ hàng với hình thành từ tổ tiên chung khứ Có nhiều hướng nghiên cứu khác để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại Trước hết, người ta so sánh trình tự đoạn DNA (thuộc sinh học phân Đồ Án Tốt Nghiệp tử hay hệ gene học (genomics); so sánh hóa thạch (fossil) di (record) cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học - paleontology) Các nhà sinh học tổ chức phân tích mối quan hệ tiến hóa thơng qua phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loài học (phylogenetics), ngoại hình học (phenetics) miêu tả theo nhánh học (cladistics) Các kiện xảy q trình tiến hóa sống xây dựng thành biểu đồ thời gian tiến hóa (evolutionary timeline) dựa hiểu biết khoa học Chúng ta tạo phát sinh lồi từ trình tự đoạn gene có so sánh với trình tự ngân hàng liệu gene cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết lồi có số trình tự tương đồng cao với chủng khảo sát Sau sử dụng phần mềm tin sinh học ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 để xây dựng phát sinh lồi, tập hợp thơng tin có liên quan đến tiến hóa Một phát sinh lồi gồm thành phần sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) nhóm vi sinh vật hay nhóm gene bắt nguồn từ tổ tiên chung Trong phân tích phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa lồi - Nút giao điểm nhánh - Hệ thống phát sinh loài dựa phân tử mà đặc biệt trình tự gene sử dụng phổ biến định danh phân loại 1.1.5 Công cụ cách tiến hành Seaview phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA protein Nó mô tả kết hệ thống màu sắc làm bậc nét đặc trưng đoạn tương đồng MEGA5 5.0.1.120 phần mềm dùng để vẽ phát sinh loài Phần mềm thực đọc kết so sánh từ tập tin dạng PHYLIP MEGA chương trình seaview 4.32.0.0 Đồ Án Tốt Nghiệp Mở chương trình seaview desktop Lựa chọn chức Multiple Alignment Mode Từ menu File, chọn Load Sequences Trong hộp Open, chọn tập tin chứa trình tự cần so sánh Nhấn nút Open Chọn Do Complete Alignment Menu Alignment Xác định vị trí cho tập tin xuất nhấn nút Align 1.1.6 Đánh giá kết Kết xuất trình tự so sánh tương đồng Các vị trí trình tự giống thể màu sắc (mỗi loại nucleotide màu) đánh dấu * Vị trí giống Ta nhận xét mức độ tương đồng trình tự thông qua tương đồng màu sắc dạng đồ thị bên Để tạo phát sinh loài dạng PHYLIP cần thực bước: + Trong menu Trees, chọn chức Draw N-J Trees + Trong hộp DRAW TREE ta chọn nút OK để lưu tập tin dạng *.ph + Mở chương trình Tree View desktop Từ menu File, chọn Open + Trong hộp Open chọn tập tin *.ph File of type All tree files Một trang kết phát sinh loài cách nhấn vào nút Phylogram, Rectanglar Cladogram, Cladogram, Radial tree 1.2 Tổng quan định danh sinh học phân tử Có nhiều cách để định danh sinh học phân tử như: PCR, southern blotting, northern blotting, western blotting, immunohistochemistry, microarray… phương pháp chủ yếu định danh loài vi khuẩn lam PCR Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.1 Các phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số 1.2.1.1 Nguyên tắc yêu cầu Ly trích thu nhận DNA tổng số nhu cầu cần thiết thực nghiệm công nghệ gene tiến hành với DNA (hay RNA) Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng nucleic acid đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm DNA phân tử có kích thước lớn, mối quan tâm hàng đầu kĩ thuật tách chiết nucleic acid thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy tác nhân học (phân tử bị gãy nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase ribonuclease RNase) 1.2.1.2 Một số phương pháp ly trích thu nhận DNA tổng số Vi sinh vật tự nhiên đa dạng, mức độ đa dạng vi sinh vật thay đổi theo môi trường Những vi sinh vật tìm thấy thường tế bào đơn quần thể vi sinh vật Sự phức tạp tính di truyền cộng đồng vi sinh vật đánh giá thông qua việc xác định tổ hợp DNA, chưa kể có mặt gene vi sinh vật chưa khám phá Sự đời kỹ thuật dựa phân tử acid nucleic dẫn tới thay đổi lớn việc phát vi sinh vật môi trường tự nhiên Với kỹ thuật phát số thay đổi lớn việc tìm hiểu cấu trúc vận động vi sinh vật cộng đồng môi trường tự nhiên Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng yếu tố khơng ly trích hồn tồn tế bào vi khuẩn DNA bị hư hỏng Rõ ràng việc áp dụng quy trình ly trích DNA phù hợp với mẫu cụ thể cần thiết cho việc đánh giá đa dạng vi sinh vật Phương pháp ly trích DNA cần Đồ Án Tốt Nghiệp phải đơn giản, nhanh chóng hiệu Chất lượng DNA quan trọng ảnh hưởng đến hiệu khuếch đại DNA sau Do ly trích DNA coi bước phân tích độc lập phân tích đa dạng vi sinh vật Việc ly trích thường kết hợp với chất tẩy, tác nhân vật lý, dung môi enzyme để thu nucleic acid (Haruta cộng (2002); Tomoyukihori cộng (2006) Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng cần thiết Q trình ly trích DNA cần phải đảm bảo độ tinh khiết độ nguyên vẹn cấu trúc để thực khâu nghiên cứu Có nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ mơi trường tự nhiên thường sử dụng: - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Được xem phương pháp thích hợp nhất, đơn giản nhanh chóng thu nhận DNA vi sinh vật với hiệu cao, phục vụ cho trình PCR J Zhou cộng (1996) sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) ủ mẫu - diện SDS, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, proteinase K - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây phương pháp dùng chiết xuất acid nucleic có hiệu cao, CTAB dung mơi có khả hịa tan cao acid nucleic, mà CTAB dùng với vai trị chất tách chiết acid nucleic Ly trích DNA vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB mô tả Ausubel cộng (1992) Ly trích DNA cần phải có hai yếu tố hiệu suất độ tinh khiết Trong nghiên cứu Jara C (2008), phương pháp ly trích tốt phương pháp CTAB - Phương pháp Benzyl chloride: Đây phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu Nó phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia 10 Đồ Án Tốt Nghiệp nhiệt đến 650C Ưu điểm phương pháp đơn giản, nhanh chóng mang lại kết cao Phương pháp Zhu cộng (1993) sử dụng để ly trích DNA thực vật, nấm vi khuẩn - Phương pháp đóng băng tan băng: Là phương pháp Ellingsue cộng (2002) Phương pháp sử dụng kỹ thuật đóng băng tan băng - 65oC ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng thành phần bên tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên 1.2.2 Phương pháp PCR ứng dụng 1.2.2.1 Kỹ thuật PCR Phương pháp PCR Kary Mullis cộng phát minh (1985) tạo nên bước tiến nhảy vọt sinh học phân tử kỹ thuật gene Đây kĩ thuật sinh hóa sinh học phân tử đại cho khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua đường chép enzyme bên sinh vật sống Hiện nay, PCR trở thành kĩ thuật thông dụng sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm sinh học y dược để phát bệnh di truyền, tạo đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene PCR (polymerase chain reaction) phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu mà khơng qua tạo dịng, nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt, mồi gồm mồi xuôi mồi ngược 11 Đồ Án Tốt Nghiệp Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Mồi xi (forward primer): Bắt cặp với mạch khuôn DNA kéo dài theo chiều phiên mã Mồi ngược (reverse primer): Bắt cặp mạch mã DNA kéo dài ngược chiều phiên mã Thành phần phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, MgCl2, Taq polymerase 1.2.2.2 Các ứng dụng chủ yếu PCR Có thể nói sinh học đại nói chung, sinh học phân tử nói riêng khơng thể thiếu ứng dụng kỹ thuật PCR Trong kỹ thuật gene, PCR sử dụng thường xuyên tách dòng gene, xây dựng ngân hàng gene, lập đồ gene giải trình tự gene PCR dùng chẩn đoán bệnh virus, vi khuẩn đột biến di truyền PCR dùng để tạo đột biến invitro, công nghệ protein tái tổ hợp, tạo nhiều protein có tính vượt trội mà tự nhiên chưa có Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh lồi phân loại phân tử 1.2.2.3 Đoạn gene 16S rDNA Gene rDNA (ribosomal DNA) nhóm gene mã hóa RNA ribosome, đóng vai trị quan trọng nghiên cứu quan hệ phát rDNA quan tâm nghiên cứu gene có nhiều đặc biệt khơng mã hóa cho protein Các gene nằm liên tiếp locus liên quan mật thiết tới trình tiến hóa Hơn nữa, ribosome tồn sinh vật có nguồn gốc tiến hóa Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên xem 12 ... Mục đích đề tài định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả gây độc tố Hồ Dầu Tiếng Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập số loài vi khuẩn lam hồ Dầu Tiếng Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa... cứu độc tính thực vật động vật thủy sinh Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam Và đề tài khảo sát diện chủng vi khuẩn lam có khả gây độc tố hồ Dầu Tiếng. .. nổi, có tảo độc diễn phổ biến tác động hoạt động người lưu vực sông, hồ Tại hồ hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc Đồ Án Tốt Nghiệp quan sát thấy diện vi khuẩn lam