Đồ án tốt nghiệp góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GÓP PHẦN XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP LACTASE Ngành[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MƠI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GÓP PHẦN XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP LACTASE Ngành : Công nghệ Sinh học Mã ngành : 111 GVHD : PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : PHẠM NGUYÊN HIẾU MSSV : 0851110082 Lớp : 08DSH2 -Tp.HCM, tháng năm 2012- Chương MỞ ĐẦU Xu hướng người ngày quay sử dụng sản phẩm mang tính thiên nhiên, khai thác kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật đại hạn chế tối đa việc đưa hoá chất vào thể Đặc biệt sản phẩm thực phẩm có bổ sung chủng vi sinh vật giúp người tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá giúp chống lại nhiều bệnh tật phát sinh từ bên thể Tuy nhiên sản phẩm thực phẩm thuốc, mà xếp vào nhóm thực phẩm chức Chính lợi ích theo quan điểm phòng bệnh chữa bệnh, nước phát triển có xu hướng sử dụng loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiều sử dụng thuốc điều trị Sữa thực phẩm trẻ em người già, thói quen khơng sử dụng sữa nên enzyme lactase bị dần, dẫn đến bệnh không dung nạp lactose Sự thiếu hụt lactase phổ biến rộng rãi toàn giới Trong thể người, lactase hoạt động khoảng năm năm Ở Bắc Châu Âu người sống phía Tây Bắc tiểu lục địa Ấn Độ, lactase có xu hướng bảo tồn người lớn, việc sử dụng sản phẩm từ sữa mát suốt mùa đông nguồn cung cấp lương thực bị hạn chế Chúng ta kết luận việc thiếu hụt lactase (được gọi không dung nạp lactose alactasia) bệnh, tồn lưu lactase vào tuổi trưởng thành thích ứng sinh học với việc sử dụng sản phẩm từ sữa Lactase enzyme tìm thấy mép ruột non Nó phân hủy lactose thành đường glucose galactose Tần số thiếu hụt lactase toàn giới khác Mức độ lactase ruột triệu chứng khơng có hịa hợp Hình ảnh điển hình khó chịu sau dùng sữa sản phẩm từ sữa Điều thấy từ việc bị đau bụng, buồn nôn, cảm giác đầy ngắn, nhanh, chảy nước mắt tiêu chảy [57] Khi bị tiêu chảy, tác nhân gây bệnh độc tố chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị đi, hậu đường lactose khơng tiêu hố tích luỹ lịng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy [57] Ngồi ra, trình trạng hấp thu lactose bệnh đường tiêu hóa số quốc gia xác, gây hấp thu lactose - hội chứng ruột ngắn, hấp thu đường galactose bẩm sinh Trong thực tế, trạng thái bất thường sai lệch việc trì hoạt động lactase suốt giai đoạn trưởng thành Có nguyên nhân dẫn đến bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứ phát, (C) bẩm sinh [58] (A) Nguyên phát: Đây nguyên nhân thường gặp bất dung nạp lactose thiếu lactase tương đối, xuất trẻ em vào độ tuổi khác nhóm chủng tộc khác (B) Thứ phát: Do tổn thương ruột non sau viêm dày ruột siêu vi (Rotavirus), trẻ bị bất dung nạp lactose thống qua, hồi phục sau vấn đề bệnh viêm dày ruột giải trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tổn thương, men lactase không sản sinh đủ nên thể trẻ hấp thu lactose dẫn đến triệu chứng bất dung nạp Khi khiến cho tình trạng tiêu chảy kéo dài trầm trọng trẻ bị suy dinh dưỡng Khi trẻ bị suy dinh dưỡng lượng men lactase giảm, suy dinh dưỡng tiêu chảy vòng luẩn quẩn khó giải (C) Bẩm sinh: Nguyên nhân gặp, biểu sau sinh rối loạn nhiễm sắc thể, gây ngăn cản sản xuất men lactase Trong hệ tiêu hóa có hệ vi sinh vật với số lượng lớn, có 400 lồi vi sinh vật khác (Melissa peterson et al., 2002), chúng xếp vào loại: vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có ích Các lồi vi sinh vật sống chung với tạo thành hệ sinh thái ổn định, cân hàng rào bảo vệ, giúp thể chống lại tác nhân gây bệnh đường ruột trì số hoạt động chuyển hóa thể Vi sinh vật có ích nhiều thể khỏe mạnh Để tăng dung nạp lactose sữa, lý tưởng tăng sinh tổng hợp enzyme thể người Tuy nhiên đường khó khăn Enzyme từ nguồn vi sinh vật nhu cầu trước mắt Do lựa chọn nguồn enzyme vi sinh hiệu nhiên phải chọn loại enzyme có hoạt động pH tối ưu tương tự sữa để tránh tượng đông tụ sữa Trên giới, lactase nghiên cứu đầy đủ sản phẩm lactase thương mại chủ yếu sản xuất từ nấm men Các loài nấm men Kluyverromyces lactics, Kluyverromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candida pseudotropicalis Ngồi lactase cịn sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus vi khuẩn Gram âm E.coli ), nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp)… Trong Việt Nam, việc nghiên cứu enzyme lactase chưa thật quan tâm nhiều hạn chế Đề tài: “Góp phần xây dựng sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase” - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn - Định danh chủng vi khuẩn - Kiểm tra hoạt tính enzyme lactase chủng vi sinh vật phân lập - Bước đầu bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase Chương TỔNG QUAN 2.1 Enzyme lactase 2.1.1 Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl –(1Ỉ 4)-α-D-glucopyranose) đường đơi có động vật có vú, ngoại trừ vài lồi, nồng độ khoảng – 10% Hàm lượng lactose trung bình sữa bị khoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008) Trong trình sản xuất phomai, phần lớn lactose sữa có dịch whey Khác với trước đây, whey không xem phụ phẩm Ngày nay, whey sử dụng hiệu Whey sấy khơ để sản xuất loại bột whey khác phân đoạn kỹ thuật lọc màng để sản xuất sản phẩm whey protein phần qua màng giàu lactose (theo Fox 2009; Lifran, 2009) Lactose loại đường có nhiều sữa Để thể hấp thu đường lactose phải phân tách thành đường glucose galactose trước Quá trình xảy phần ruột non men lactase Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật thể thiếu men lactase để chuyển lactose thành hai loại đường trình bày Nếu thiếu men lactase ruột non đường lactose khơng phân tách khơng hấp thu vào máu mà bị tồn đọng ruột, dẫn đến rối loạn tiêu hóa, gọi bất dung nạp đường lactose Đây nguyên nhân làm cho ta không uống sữa Nhiều người nhầm lẫn bất dung nạp đường lactose dị ứng sữa Bản chất dị ứng sữa hệ miễn dịch thể phản ứng với protein có sữa dẫn đến rối loạn Lactase mã hóa locus gen nhiễm sắc thể số 2, thể độc quyền ruột động vật có vú nhỏ, mức độ thấp ruột kết trình phát triển thai nhi Con người sinh với mức lactase cao Sau cai sữa gen sinh tổng hợp lactase trạng thái bất hoạt lactase ruột non giảm Việc giảm lactase đồng nghĩa với việc gây triệu chứng phổ biến không dung nạp hypolactasia không dung nạp lactose Bất dung nạp đường lactose không liên quan đến hệ miễn dịch, thể thiếu lactase để tiêu hóa lactose lactose bị tống dạng tiêu chảy Ở người, vấn đề khó khăn tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, độ tuổi thiếu niên chiếm khoảng 70% số thiếu niên giới (Paige 2005) Enzym thương mại có xu hướng phát triển mạnh, β-galactosidase cho phép sản xuất sản phẩm chứa hàm lượng lactose thấp (Gekas Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama Amach 1999; Rehman 2009) Khi đó, lactose hịa tan ngọt, thủy phân lactose làm giảm tinh thể lactose sản phẩm giàu lactose trình bảo quản làm tăng độ (Gekas Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama Amachi 1999; Rehman 2009) 2.1.2 Lactase chức Enzyme thủy phân lactose có tên lactase thuộc nhóm β-galactosidase (E.C.3.2.1.23) Enzyme có hoạt tính chủ yếu thủy phân liên kết β 1-4 glucosidic phân tử đường đôi lactose để tạo thành phân tử đường đơn có độ cao đường lactose Do vậy, enzyme lactase chủ yếu sử dụng công nghiệp sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, thành phần cacbonhydrat sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả dung nạp đặc biệt số người lớn kể trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose Hơn nữa, phân tử lactose dễ dàng bị kết tinh dạng hạt cát nhiệt độ lạnh nên gây khó khăn cho sản xuất số sản phẩm sữa lạnh kem, người ta sử dụng enzyme để giảm hàm lượng lactose đồng thời tăng độ sản phẩm nhờ đường đơn tạo thành [49] Enzyme lactase số trường hợp có hoạt tính transgalactosyl hóa, trước tiên enzyme phá vỡ liên kết β 1-4 glucosidic tạo thành galactosyl sau chuyển cho phân tử hợp chất chứa nhóm hydroxyl Do người ta sử dụng hoạt tính để tổng hợp galactooligosaccharide, có hoạt tính dược học [49] Lactase tìm thấy nhu động ruột non người động vật, số thực vật (dưa hấu, trái mơ…) vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm sợi) Tùy theo nguồn gốc lactase có kích thước phân tử khác nhau, chuỗi peptide (tiểu phần theo cấu trúc bậc 4) dài ngắn số lượng khác Mặc dù chuỗi peptide mang hoạt tính lactase thơng thường có trọng lượng phân tử khoảng 120kDa chứa tâm xúc tác tâm có cấu trúc tương tự lồi (được bảo tồn qua tiến hóa) vai trị khơng thể thay “tay” Glu phản ứng xúc tác axit – base cơng vào nhân [49] Hình 2.1 Enzyme lactase ruột non người [53] Hoạt tính phân hủy lactose xác định cách, thông qua chất lactose, thông qua tạo thành sản phẩm đặc trưng phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng chất đặc hiệu ONPG (onitrophenyl-β-D-glucoside) xác định lượng ONP (o-nitrophenyl) tạo thành [49] Các lactase khác có dải hoạt động pH từ axit yếu đến trung tính từ khoảng 4.0 – 6.5 tùy thuộc vào nguồn gốc Lactase nấm sợi có pH hoạt động gần axit hơn, lactase vi khuẩn nấm men ưa pH gần trung tính [49] Bảng 2.1 Một số đặc trưng chuỗi peptide đóng vai trị xúc tác enzyme lactase số loài vi sinh điển hình Nguồn gốc enzyme K.lactic E.coli E.coli A.niger Trọng lượng phân tử 117618 116351 118016 119160 Chiều dài 1025 1023 1031 1006 Nguyên tử proton Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/bazơ Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 [49] Phần lớn lactase hoạt động khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình), số khác từ 45-650 C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác nhiệt độ lạnh 40C Dưới tổng hợp số đặc tính lactase từ nguồn vi sinh vật khác (Bảng 2.2) Đặc biệt số enzyme địi hỏi ion kim loại để hoạt hóa [49] Người động vật có khả dung nạp lactose thời kỳ trẻ sinh, ruột non có khả tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose sữa mẹ, thành phần cho trẻ sinh trưởng Đến tuổi trưởng thành gen ngưng hoạt động thể tiêu hóa lactose Điều cho động vật Nghiên cứu dung nạp latose hỗ trợ hệ vi sinh niêm mạc ruột non, có vai trị vi sinh vật lên men lactose Lactococcus Bifidobacterium Đây sở việc đưa vi sinh vật vào số dịng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa [49] Bảng 2.2 Một số đặc trưng enzyme lactase số lồi vi sinh điển hình Nguồn Giá trị pH Giá trị nhiệt Tối ưu độ tối ưu Trọng lượng phân tử Hoạt hóa ion Chú Chú thích khác A.niger 3,0-4,0 55-60 124 A.oryzae 5,0 50-55 90 Mn+2 , K+ K.fragilus 6,9-7,3 37 201 Mn+2 , Na+ K.lactic 7,2 35 135 K+ , Na+ E.coli 6,2-7,1 40 540 L.thermophilus 3,4-4,3 55-57 530 C.inaegualis 6,0 30-55 Hoạt động cao B.circulans 6,8 60-65 sữa không béo Bacillus sp 6,5-7,5 65 L.bulgaricus 42-45 S.thermophilus 55 500-600 [49] 2.1.3 Cơ chế, cấu trúc q trình sinh tổng hợp Lactase thủy phân loạt chất Trong đáng ý lớp enzyme β –galactosidase, lactase có glucosidase glycosylceramidase hoat động Trong trình trao đổi chất, β-glycosidic D-lactose thủy phân để tạo thành D-galactose, D-glucose, hấp thu qua thành ruột vào máu Phản ứng xúc tác lactase tổng thể : C 12 H 22 O 11 + H O → C H 12 O + C 6H 12 O + Q Lactase xúc tác chuyển đổi phlorizin phloretin glucose Cơ chế xúc tác thuỷ phân lactose D – giữ lại cấu hình chất anomeric sản phẩm Trong chi tiết chế không chắn, để đạt phải thông qua phản ứng chuyển đổi Các nghiên cứu lactase vi khuẩn E.coli đề xuất rằng: trình thủy phân bắt đầu tác nhân nucleophin glutamate cơng enzyme từ phía bên trục carbon galactosyl β-glycosidic Vì Mg phụ thuộc vào axit xúc tác nên việc loại bỏ nhóm rời D-glucose thuận lợi, enzyme giải phóng từ phân nửa α-galactosyl công nucleophin sản xuất Dgalactose Hình 2.2 Cơ chế thủy phân lactose [54] Các nghiên cứu chất chứng minh 3’-OH 2’-OH vòng galactopyranose cần thiết để thủy phân enzyme Nhóm 3'- hydroxy tham gia từ ban đầu nhóm 2’ khơng cần thiết, cần thiết bước Điều chứng minh thực tế 2-deoxy chất ức chế cạnh tranh hiệu (K i= 10mM), loại bỏ nhóm hydroxyl phân nửa glucopyranose, khơng hồn tồn loại bỏ chất xúc tác Pre-pro-lactase có cấu trúc polypeptide bao gồm 1927 axit amin chia thành nhánh: (1) 19 amino axit chia tín hiệu theo thứ tự, (2) chuỗi miền lớn không diện lactase giai đoạn trưởng thành, (3) phân khúc lactase giai đoạn trưởng thành, (4) mảng trải dài kị nước, (5) đoạn ngắn ưa nước cacboxyl cuối Chuỗi tín hiệu phân tách lưới nội chất, pro-LHP đạt chiều dài 215kDa chuyển sang máy Golgi, nơi có nhiều glycoxyl hóa protein thủy phân Các prodomain hiển thị để hoạt động chaperone intramolecular ER, ngăn ngừa phân tách trypsin cho phép LPH áp dụng cấu trúc 3-D cần thiết để vận chuyển đến máy Golgi Hình 2.3 Quá trình sản sinh lactase người [54] 2.1.4 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase sinh tổng hợp số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulautilis sp, Torulopsis spherica, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis) Ngồi ra, cịn có vi khuẩn Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, nhóm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917 Bên cạnh nấm sợi quan tâm nhiều (Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp) loài Aspergillus sp nghiên cứu nhiều Tuy nhiên q trình tổng hợp lactase quy mơ nghiên cứu quy mô sản xuất chủ yếu từ nấm men Kluyveromyces vi khuẩn lactic Các enzyme lactase sinh tổng hợp bao gồm ngoại bào nội bào, loại chịu nhiệt không chịu nhiệt, đặc biệt loại lactase chịu lạnh để ứng dụng làm kem Sử dụng lactase (cố định tự do) chủ yếu để sản xuất sữa tươi sữa bột khơng chứa (hoặc chứa ít) lactose sinh tổng hợp hợp chất galacto-ooligosaccharides Bảng 2.3 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Nấm men Vi khuẩn Nấm sợi Kluyverromyces lactic Lactobacillus acidophilus Aspergillus sp Kluyveromyces maxianu Lactobacillus sp Aspergillus niger Kluyveromyces sp Lactococcus lactic Aspergillus oryzea Torulopsis spherical Bacillus subtilis Aspergillus candidus Torulopsis Bacillus curculans Fusarium sp pseudotropicalis Streptococcus salivarius Fusarium moniliforme Torulautilis sp Streptococcus Trichoderma sp Saccharomyces fragilis thermophilus Trichoderma reesei Rut-C30 Candida pseudotropicalis E.coli Zygosaccharomyces lactic [49] Những tế bào niêm mạc phần ruột non (là tế bào sản xuất men lactase) bị tổn thương Hiện tượng hay gặp trẻ em thường xảy sau bị tiêu chảy, viêm dày ruột hóa trị liệu Khi trẻ bị tiêu chảy, tác nhân gây bệnh độc tố chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị đi, hậu đường lactose khơng tiêu hố tích luỹ lịng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy bệnh ngày trầm trọng Thống kê cho thấy 50% -70% trẻ em nhập viện tiêu chảy nặng có biểu bất dung nạp lactose Lactose đường chủ yếu có sữa mẹ sữa công thức Lactose nguồn cung cấp đường glucose cho hoạt động não thể, làm phân mềm, tạo vượt trội Bifidus Lactobacillus vi khuẩn 10 có lợi giúp cho phát triển hệ miễn dịch tiêu hoá thể trẻ Men lactase màng ruột men tiêu hoá biến đường lactose trở thành đường glucose Khi trẻ bị tiêu chảy cấp, màng ruột bị tổn thương vi khuẩn, virút độc tố chúng làm thiếu men lactase Do thiếu men lactase làm đường lactose khơng tiêu hố ruột gây bất dung nạp lactose Đường lactose không tiêu hoá ứ đọng lại ruột, hút nước làm tiêu chảy tăng thêm kéo dài Trường hợp gọi thiếu lactase thứ phát, khác với thiếu men lactase tiên phát thường xuất sau trẻ sinh gặp (chỉ số 1000 trẻ) Bất dung nạp lactose thứ phát thường kéo dài 1-2 tuần trẻ tiêu chảy kéo dài Hậu trẻ bị suy dinh dưỡng nặng, ăn cộng thêm tập quán kiêng ăn làm chậm hồi phục niêm mạc ruột Bất dung nạp lactose gặp trường hợp tiêu chảy nhiễm vi khuẩn, virút, đặc biệt tiêu chảy Rota virút, dị ứng sữa bò… bệnh lý thường xảy trẻ nhỏ tuổi [57] 2.2 Tổng quan vi khuẩn lactic (LAB) 2.2.1 Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) nhóm vi khuẩn Gram dương có thống hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa trao đổi chất Chẳng hạn chúng trực khuẩn ngắn hay que (rod) cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử Chúng thường tìm thấy chất bị phân hủy sản phẩm chứa lactic, axit lactic tạo sản phẩm chủ yếu trao đổi chất kết thúc trình lên men carbohydrate Vì LAB dùng thực phẩm lên men, axit hóa ức chế tăng trưởng tác nhân gây hư hỏng Một số chủng LAB sinh bacteriocin ức chế sinh vật gây bệnh (Klnhammer, 1987) Hơn nữa, axit lactic sản phẩm trao đổi chất khác góp phần làm tăng giá trị cảm quan cấu trúc thực phẩm Vi khuẩn lên men lactic Pasteur tìm từ sữa bị chua chúng công nhận an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), sử dụng thường xuyên thực phẩm có đóng góp hệ vi sinh vật có ích người 11 Theo phân loại sửa đổi nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) hình que, giống sau chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus Weissella Trước giống Bifidobacterium xếp vào nhóm vi khuẩn lactic khóa phân loại Bergey 1957, chúng xem Lb bifidum Bifidobacterium không phù hợp với mô tả chung vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều đến nhóm Actinomycetaceae, nhóm vi khuẩn Gram dương có đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic Hình 2.4 Cây phát sinh loài vi khuẩn lactic [26] Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần - Trong nhóm đóng khung xem nhóm vi khuẩn an toàn Việc phân loại vi khuẩn axit lactic khác phần lớn dựa hình thái học, chế độ đường lên men khác nhau, tăng trưởng nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất axit lactic, khả phát triển nồng độ muối cao, chịu axit kiềm Phân loại theo đường hóa học thành phần axit béo thành phần thành tế bào, phương pháp sinh học di truyền đại sử dụng phân loại 12 2.2.2 Đặc tính chung Vi khuẩn lactic vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu đường lên men không hô hấp khơng có cytochromes, trừ giống Bifidobacterium kỵ khí bắt buộc Vi khuẩn lactic lên men đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton axit Phần lớn chúng không lên men tinh bột polisaccharid khác Đường kính dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hình chuỗi có chiều dài khác Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ kết thành chuỗi Các lồi vi khuẩn lactic có khả khác tạo thành axit lactic môi trường, sức chịu axit (hay độ bền axit) khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao (khoảng 2-3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn phát triển pH 3,8-4 (cầu khuẩn phát triển môi trường này), hoạt lực lên men tốt trực khuẩn vùng pH 5,5-6 Nhiệt độ sinh trưởng tối thích vi khuẩn lactic ưa ấm 25-350C, ưa nhiệt 40-450C ưa lạnh thấp 50C Khi gia nhiệt khoảng 6-800C hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp đất, nước, không khí, chủ yếu thực vật sản phẩm thực phẩm lên men (trên loại rau, quả, sữa, thịt…) Mặc dù chế chưa làm sáng tỏ nhiên LAB cho có số hiệu ứng có lợi cho chức miễn dịch LAB bảo vệ chống lại mầm bệnh phương tiện ức chế cạnh tranh, đẩy mạnh báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr Martha, 2003) tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA – kháng thể chất nhầy thể, hoạt hóa đại thực bào tăng tỷ lệ T lympho (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặc dù chưa có chế cụ thể) (O'Toole Cooney, 2008) 13 Cụ thể Lacticin 3147 Lactococcus lactis sinh có tác dụng diệt khuẩn tế bào nhạy cảm tương tác với thành tế bào Đó nguyên nhân mà màng tế bào tạo kênh cho K + phốt phát vô khỏi tế bào Trong nỗ lực để tái tích lũy lại ion này, hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên Khi ATP yêu cầu cho trì chức quan trọng tế bào gradient pH màng tế bào, chức tế bào bị phá vỡ tế bào lượng chết Trong bacteriocin có chất peptid kháng khuẩn sinh vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo loại bacteriocin có khả kháng lại bacteriocin Ngồi khơng gây phản ứng dị ứng cho người vấn đề sức khỏe, bị phân hủy nhanh enzym protease, lipase Chúng có khả tiêu diệt vi khuẩn khác tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacteriocin cịn có khả phân giải ADN, ARN công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Bacteriocin vi khuẩn lactic phân loại dựa cấu trúc cịn dựa kiểu hoạt động chúng Bacteriocin class I (đại diện: nisin Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn vận chuyển tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo ngăn tổng hợp vách tế bào bám vào lớp lipid II, phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin Lactobacillus sake) peptide lưỡng tính có khả xun màng tế bào tạo kênh/lỗ màng Lớp III (còn gọi bacteriolysin lysostaphin) – protein khơng bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích (Riley Chavan, 2007), (Cotter et al., 2005) Điều chỉnh thành phần cấu tạo vi khuẩn đường ruột Ở phần khác hệ tiêu hóa tồn vi khuẩn khác Khi tập trung khoang ruột, chúng tạo nên cân tạm thời hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, thay đổi nhận thấy vài ngày sau bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có VSV chứa lactase, phụ thuộc vào cơng dụng liều lượng giống vi khuẩn Giảm thiểu tiêu chảy kháng sinh: Nguyên nhân kháng sinh làm cân hệ vi sinh đường ruột Clotridium difficle Klebsiela oxytoca tăng lên nhanh chóng giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy viêm ruột Có nhiều nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy kháng sinh, kết cho thấy chủng S bolardii, 14 S boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi mắc bệnh sử dụng L acidophilus để trị bệnh tiêu chảy sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin mang lại hiệu (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006) Tính hiệu phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV sử dụng liều lượng, giảm đến 50% mức độ bệnh Các loại thực phẩm bổ sung LAB dùng điều trị phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp trẻ em tiêu người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002) Những lợi ích chủng LAB ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, biến chứng thường gặp dùng kháng sinh Thuốc kháng sinh cho làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" LAB lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch nhiều nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm 2.2.3 Đặc điểm hình thái số chủng LAB Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu hình que Kích thước chúng thay đổi tùy loài 2.2.3.1 Giống Lactobacillus Phân loại khoa học: (Beijerinck, 1901) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus 15 Chi Lactobacillus bao gồm 125 loài : L acidophilus, L brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus … Hình 2.5 Lactobacillus sp [52] Đặc điểm: Tế bào có dạng hình que thường dài thon, không di động, Gram dương, tạo sắc tố (màu gỉ sắt màu đỏ gạch) glucose, aldehydic hexose tương tự, cacrbohydrate đường đơn rượu đa chức chuyển hóa đường lên men lactic đồng hình dị hình tạo axit lactic, axit acetic, rượu CO2 Khơng có khả chuyển hóa nitrate, trừ lồi L plantarum điều kiện định Một số loài phát triển mơi trường nghèo chất dinh dưỡng, chịu nhiệt độ cao Kỵ khí khơng bắt buộc, khơng tạo catalase, khơng hóa lỏng gelatin, khơng phân hủy casein vài chủng tạo lượng nhỏ đạm hịa tan Khơng tạo indole H2S Tế bào non cho kết Gram dương trở thành Gram âm già Khơng có khả di động Được tìm thấy sản phẩm lên men từ động vật thực vật, đặc biệt sản phẩm sữa Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men đồng hình: Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus, L plantarum, L casei… Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic khơng đồng hình: Lactobacillus brevis, L pentoaceticus, L lycopersici, L fermenti… 16 2.2.3.2 Giống Streptococcus Phân loại khoa học: (Rosenbach, 1884) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Streptococcaceae Giống : Streptococcus Gồm loài: S agalactiae, S anginosus, S bovis, S canis, S equi, S iniae, S mitis, S mutans, S oralis, S parasanguinis, S peroris, S pneumoniae, S pyogenes, S ratti, S salivarius, S salivarius ssp thermophilus, S sanguinis… Hình 2.6 Streptococcus [52] Đặc điểm: Có dạng hình trịn hình trứng (ovan), kéo dài thành dạng que Sau phân chia theo phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi chuỗi ngắn, loại vi khuẩn không nha bào, Gram dương, không di động, thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào số lồi nhận thấy điều kiện định, đường kính tế bào 0.5-1µm 17 Trong mơi trường lỏng, sinh khối có dạng nhám có dạng hạt mặt nước dạng mịn gây đục môi trường Trên môi trường agar, khuẩn lạc thường nhỏ 1mm, loài chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi Sau lên men đường, sinh khơng sinh CO2 tạo lượng đáng kể ethanol, axit acetic, axit formic…khi lên men glucose môi trường có tính kiềm (Gunsalus Niven, 1942) Khơng có khả chuyển nitrate thành nitrite, kị khí khơng bắt buộc, không sống môi trường với 10% muối mật, chủng phân hủy protein có nhóm enterococcus Tất chủng Streptococcus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, số lồi có nhu cầu vitamin B amino axit số khác có nhu cầu axit béo khơng no gia tăng lượng CO2 Vì nhu cầu dinh dưỡng giúp ích việc xác định loài (Dubos, 1948) Sự phân loại loài thuộc Streptococcus đề nghị (Sherman, 1937) Theo đó, chúng chia thành nhóm: nhóm sinh mủ (pyogenic), viridans, Enterococcus nhóm lactic Sự phân chia dựa đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với nhóm, đặc biệt khoảng nhiệt độ phát triển Tuy nhiên với lồi cơng nhận làm cho đặc điểm nhóm trở nên khác biệt chúng lúc mang nhiều đặc điểm nhóm Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, lại mang đặc điểm mà ta đặt vào nhóm Enterococcus Trong Streptococcus acidominimus Ayers Mudge thuộc nhóm viridans xem thuộc nhóm pyogenic Các lồi thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophillus, Streptococcus salivarius sub sp thermophilus… Các lồi thuộc giống Streptococcus lên men lactic khơng đồng hình: Streptobacterium brassicae fermentati… 2.2.3.3 Giống Leuconostoc Phân loại khoa học: (Van Tieghem, 1878) emend (Hucker Pederson, 1930).(Orla-Jensen, 1919) 18 Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Leuconostocaceae Giống : Leuconostoc Gồm loài như: L carnosum, L citreum, L durionis, L fallax, L ficulneum, L fructosum, L garlicum, L gasicomitatum, L gelidum, L inhae, L kimchii, L lactis… Hình 2.7 Leuconostoc [50] Đặc điểm: Leuconostoc có tế bào thường có dạng hình cầu hay oval đơn lẻ, cặp đơi hay dạng chuỗi ngắn Trong môi trường định nước trái rau có tính axit, tế bào kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng sống mơi trường chứa sucrose Đối với mơi trường bình thường, tăng trưởng kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua rau củ Leuconostoc lồi ky khí khơng bắt buộc Khi lên men tạo lượng hạn chế axit lactic L-lactic axit tạo xuất D-lactic axit Axit acetic rượu tạo thành khoảng ¼ lượng glucose lên men chuyển thành CO2 19 ... Nam, vi? ??c nghiên cứu enzyme lactase chưa thật quan tâm cịn nhiều hạn chế Đề tài: ? ?Góp phần xây dựng sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase? ?? - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp. .. hóa có hệ vi sinh vật với số lượng lớn, có 400 lồi vi sinh vật khác (Melissa peterson et al., 2002), chúng xếp vào loại: vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có ích Các lồi vi sinh vật sống chung... thiết để vận chuyển đến máy Golgi Hình 2.3 Quá trình sản sinh lactase người [54] 2.1.4 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase sinh tổng hợp số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces