LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công N[.]
LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn khoa học ThS Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp.Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn đồ án tốt nghiệp TP.HCM, ngày 31 tháng năm 2014 Sinh viên thực Võ Phương Huỳnh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy ThS Huỳnh Văn Thành tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường tận tình truyền đạt kiến thức thời gian dài học tập Với kiến thức mà em tiếp thu không giúp em thực tốt đồ án tốt nghiệp mà cịn tảng kiến thức cho cơng việc sau Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, Ba Mẹ ln động viên, chăm sóc chỗ dựa vững cho em suốt năm qua Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Lê Trần Ánh Tuyết, bạn lớp 10DSH, người động viên giúp đỡ để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án TP.HCM, ngày 31 tháng năm 2014 Sinh viên thực Võ Phương Huỳnh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn phản nitrate A xylosoxidans 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa 1.1.5 Nguồn phân lập vi khuẩn A xylosoxidans 1.1.6 Định danh giải mã trình tự gene rRNA 16S 1.1.7 Một số ứng dụng vi khuẩn A xylosoxidans 11 1.1.7.1 Xử lý hợp chất khó phân hủy 11 1.1.7.2 Khả khử màu malachite green 11 1.1.8 Khả phản nitrate vi khuẩn A xylosoxidans 12 1.1.8.1 Cơ chế trình phản nitrate 12 1.1.8.2 Các điều kiện thích hợp cho q trình phản nitrate vi khuẩn A xylosoxidans .15 1.2 Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản .17 1.2.1 Nước thải chế biến thủy sản 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản 19 1.3 Phƣơng pháp xử lý sinh học 21 1.4 Tổng quan mơ hình xử lý nƣớc thải MBBR .22 1.4.1 Nguyên tắc hoạt động .22 1.4.2 Hoạt động giá thể .23 1.4.3 Ưu điểm trình xử lý nước thải phương pháp MBBR 24 CHƢƠNG II:VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất .25 2.1.1 Vật liệu .25 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .25 2.1.2.1 Thiết bị 25 2.1.2.2 Dụng cụ 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.3.1 Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát 26 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng 27 2.2 Bố trí thí nghiệm 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 29 2.3.1 Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate A xylosoxidans 29 2.3.2 Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate A xylosoxidans 29 2.3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn KIT API 20 NE 29 2.3.4 Khảo sát thích ứng vi khuẩn A xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn nước thải môi trường Giltay cải tiến .29 2.3.5 Khảo sát mật độ vi khuẩn A xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate 30 2.3.6 Khảo sát thời gian xử lý nitrate vi khuẩn A xylosoxidans nước thải giàu nitrate 31 2.3.7 Tiến hành thực mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm 32 ii Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phƣơng pháp phân tích .34 2.4.1 Phương pháp dựng đường chuẩn .34 2.4.1.1 Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate 34 2.4.1.2 Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite 36 2.4.1.3 Phương pháp dựng đường chuẩn amoni 37 2.4.2 Phương pháp định lượng N-NO3-, N-NO2-, N-NH4+ 38 2.4.2.1 Phương pháp định lượng N-NO3- 38 2.4.2.2 Phương pháp định lượng N-NO2- 39 2.4.2.3 Phương pháp định lượng N-NH4+ 39 2.4.3 Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn A xylosoxidans KIT API 20 NE 40 2.4.3.1 Chuẩn bị 40 2.4.3.2 Phương pháp 41 2.4.3.3 Cách đọc kết 43 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn A xylosoxidans KIT API 20 NE 46 3.2 Kết dựng đƣờng chuẩn .49 3.2.1 Kết dựng đường chuẩn nitrate 49 3.2.2 Kết dựng đường chuẩn nitrite .50 3.2.3 Kết dựng đường chuẩn amoni 52 3.3 Sự thích ứng vi khuẩn A xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn nƣớc thải môi trƣờng Giltay cải tiến 53 3.4 Mật độ vi khuẩn A xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate 56 3.5 Thời gian xử lý nitrate vi khuẩn A xylosoxidans nƣớc thải giàu nitrate 58 iii Đồ án tốt nghiệp 3.6 Khảo sát mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm 62 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1 Kết luận 65 4.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A xylosoxidans Achromobacter xylosoxidans C Cacbon C/N Tỷ lệ cacbon nitơ COD Nhu cầu oxy hóa học MBBR Mơ hình xử lý nước thải giá thể lơ lửng N Nitơ v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn A xylosoxidans Bảng 1.2 Khử nitrate đồng hòa khử nitrate dị hóa chu trình nitơ vi khuẩn 13 Bảng 1.3 Thành phần nước thải chế biến thủy sản .19 Bảng 2.1 Các thông số mơ hình MBBR xây dựng từ thí nghiệm 32 Bảng 2.2 Trình tự tiến hành dựng đưởng chuẩn nitrate 35 Bảng 2.3 Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrite .37 Bảng 2.4 Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn amoni 38 Bảng 2.5 Các mức Mc Farland 40 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn A.xylosoxidans 48 Bảng 3.2 Độ hấp thụ quang dung dịch chuẩn nitrate 49 Bảng 3.3 Độ hấp thụ quang dung dịch chuẩn nitrite 51 Bảng 3.4 Độ hấp thụ quang dung dịch chuẩn amoni 52 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn A xylosoxidans Hình 1.2 Quy trình phân lập chủng vi khuẩn A xylosoxidans Hình 1.3 Kết giải trình tự gene 16S .10 Hình 1.4 Kết so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo malachite green .11 Hình 1.6 Sơ đồ cơng nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh học hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng 20 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 28 Hình 2.2 Mơ hình bioreactor có giá thể bám dính 34 Hình 2.3 Các mức Mc Farland 41 Hình 2.4 Bộ KIT API 20 NE thuốc thử 41 Hình 2.5 So sánh độ đục vi khuẩn A xylosoxidans nước muối sinh lý với mức Mc Farland 0,5 42 Hình 2.6 API AUX MEDIUM sau cho 200 µl huyền phù vào .42 Hình 2.7 Bộ KIT API 20 NE sau bơm dịch 43 Hình 2.8 Mẫu so sánh kết KIT API 20 NE .45 Hình 3.1 Kết KIT sau 24 46 Hình 3.2 Kết KIT sau 48 47 Hình 3.3 Kết so sánh API WEB 49 Hình 3.4 Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate 50 Hình 3.5 Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite .51 Hình 3.6 Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni 53 Hình 3.7 Mật độ quang vi khuẩn 54 Hình 3.8 Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 55 Hình 3.9 Động học phản nitrate hiệu xử lý vi khuẩn A.xylosoxidans theo mật độ 57 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 57 Hình 3.11 Động học phản nitrate hiệu xử lý vi khuẩn A xylosoxidans theo thời gian .59 Hình 3.12 Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 60 Hình 3.13 Động học phản nitrate hiệu xử lý vi khuẩn A xylosoxidans theo thời gian .62 Hình 3.14 Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 63 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn đầu hội nhập kinh tế quốc tế Bên cạnh thành đạt kinh tế - xã hội, ngành công nghiệp gây vấn đề môi trường đáng lo ngại gây nhiễm khơng khí, nhiễm chất thải rắn,… nghiêm trọng ô nhiễm nguồn nước Nước thải chế biến thủy sản chứa thành phần ô nhiễm hữu COD, BOD hàm lượng nitrate cao Với phương pháp xử lý nước thải phương pháp xử lý hóa lý, phương pháp xử lý hóa học,… xử lý hiệu COD BOD chưa xử lý triệt để nguồn nitrate tồn đọng nước thải Hiện nay, phương pháp xử lý nước thải ngày sâu vào áp dụng phương pháp sinh học Đối với nước thải chế biến thủy sản, việc áp dụng phương pháp xử lý sinh học thích hợp có hàm lượng chất hữu cao, dễ phân hủy sinh học vi khuẩn So với phương pháp xử lý hóa lý, hóa học phương pháp xử lý sinh học tiết kiệm quy mô giá thành đầu tư Đặc biệt phương pháp xử lý sinh học không gây tái ô nhiễm môi trường – nhược điểm mà phương pháp xử lý hóa học hay mắc phải Do đó, để xử lý nguồn nitrate tồn đọng cần áp dụng phương pháp xử lý sinh học, ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate vào quy trình xử lý để đạt hiệu xử lý cao Trước tình hình trên, cho phép khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, tác giả thực đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans xử lý nƣớc thải chế biến thủy sản giàu nitrate” Đồ án tốt nghiệp Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát điều kiện thích hợp cho q trình xử lý nitrate chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans nước thải giàu nitrate Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mơ phịng thí nghiệm Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans Khảo sát thích ứng chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo phối trộn tỷ lệ nước thải chế biến thủy sản : tỷ lệ mơi trường Giltay cải tiến Khảo sát mật độ thích hợp chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ sung vào nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate Khảo sát thời gian xử lý nitrate chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate Chạy mơ hình MBBR phản nitrate quy mơ phịng thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp tổng hợp tài liệu: - Thu thập, nghiên cứu tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan đến đề tài - Lựa chọn, tổng hợp tài liệu liên quan đến mục tiêu đề đề tài Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: - Sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate - Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate KIT API 20 NE - Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến tăng trưởng khả phản nitrate chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans nước thải Đồ án tốt nghiệp chế biến thủy sản thời gian, mật độ tế bào vi khuẩn, tỷ lệ mơi trường thích hợp để đạt hiệu xử lý nitrate cao khơng tích lũy nitrite phát sinh amoni - Dựa thơng số thí nghiệm tiến hành chạy mơ hình xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mơ phịng thí nghiệm Phương pháp thu thập xử lý số liệu: - Ghi nhận số liệu từ kết thí nghiệm khảo sát theo thời điểm - Xử lý số liệu phần mềm Microsoft Excel - Xử lý thống kê phần mềm Statgraphics Centurion XV Các số liệu sau phân tích ANOVA trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05 Các kết đạt đƣợc đề tài Tìm tỷ lệ phối trộn, mật độ thời gian xử lý thích hợp vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxindans để ứng dụng vào xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mơ phịng thí nghiệm Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn phản nitrate Achromobacter Xylosoxidans 1.1.1 Giới thiệu chung Achromobacter xylosoxidans vi khuẩn Gram (-), gần giống với chủng Alcaligenes, có khả phản nitrate theo đường dị hóa điều kiện yếm khí (anaerobic) cho sản phẩm cuối N2, tương tự Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Thiobacillus denitrificans Thiosphera pantotropha Phân loại vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans: Giới: Vi khuẩn Ngành: Proteobacteria Lớp: Beta Proteobacteria Bộ: Burkhol deriales Họ: Alcaligenaceae Chi: Achromobacter Lồi: Achromobacter xylosoxidans 1.1.2 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans là: - Vi khuẩn Gram âm (-) - Hình que - Kích thước 0.4 x 0.7 – 1.0µm - Có tiên mao Đồ án tốt nghiệp Gram (-) Tiên mao Hình 1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 1.1.3 Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn Achromobacter xylososidans là: - Vi khuẩn kỵ khí tùy nghi - Có khả di động - Khơng sinh nội bào tử 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa Các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans thể bảng 1.1 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn A xylosoxidans STT Thử nghiệm Kết Catalase (+) O/F O+/F- Oxidase (+) MR (-) VP (-) Indol (+) Tạo màng biofilm (+) 1.1.5 Nguồn phân lập vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans phân lập từ: - Nguồn nước thải giàu nitơ nước thải chế biến thủy sản, nước thải chăn nuôi,… - Nguồn nước thải nhiễm 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT) Quy trình phân lập chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans từ nguồn nước thải chế biến thủy sản thể hình 1.2 (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012) Đồ án tốt nghiệp Nước thải chế biến thủy sản Tăng sinh môi trường Giltay NO3- Quan sát MT đục, sinh khí Định tính khử NO3- Định tính NO2- tạo thành Chọn ống tăng sinh đục, sinh khí, khử nitrate Phân lập môi trường thạch Giltay NO3- Chọn chủng vi khuẩn khiết Tăng sinh môi trường Giltay NO2- Quan sát MT đục, sinh khí Định tính khử NO2- Chọn chủng khử nitrite, sinh NH4+ Định tính NH4+ tạo thành Đồ án tốt nghiệp Test O/F test sinh hóa khác Chọn chủng không lên men glucose Khảo sát khả khử N-NO2- Định tính, định lượng NO3-, NO2-, NH4+ Xác định thể tích khí sinh Xác định pH mơi trường Chọn chủng khử NO3-, sinh NH4+, sinh khí, tăng pH Khảo sát khả khử N-NO3- Chọn chủng có hiệu suất xử lý N-NO3- cao, khơng tích lũy N-NO2-, nồng độ NH4+ sinh (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012) Hình 1.2 Quy trình phân lập chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans Đồ án tốt nghiệp Mẫu nước thải pha loãng nước muối sinh lý (0,85%) Sau tăng sinh mơi trường Giltay có chứa nguồn C acid citric, N KNO3 số chất quan trọng khác Dấu hiệu nhận biết phát triển vi khuẩn khử nitrate có sinh khí ống durham, đục mơi trường pH mơi trường giảm Từ ống dương tính khử nitrate, thực cấy ria sang môi trường thạch Giltay NO3- (agar 2% - 2,5) Các khuẩn lạc riêng rẽ tiến hành cấy ria nhiều lần môi trường Giltay thạch thu chủng vi khuẩn khiết Tiến hành test sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate phân lập khảo sát khả khử nitrate, nitrite chủng vi khuẩn phân lập 1.1.6 Định danh giải mã trình tự gene rRNA 16S Kết định danh giải mã trình tự gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) tra cứu hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey cho thấy vi khuẩn phản nitrate tiềm thuộc mức độ an toàn sinh học loại (Busse, HJ cộng sự, 2006) Ngoài ra, vi khuẩn thể nhiều khả sử dụng nhiều nguồn lượng hữu khác Đây vi khuẩn nghiên cứu rộng rãi giới để phân hủy hợp chất xenobiotic endosulfan (Li W cộng sự, 2009), chrysene (Chirag M cộng sự, 2011), estradiol (Iasur-Kruh L cộng sự, 2011), hợp chất phenol (Ho YN cộng , 2012), thuốc nhuộm (Manikandan N cộng , 2012) Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Kết giải trình tự chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Hình 1.4 Kết so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank 10 ... trình xử lý nitrate chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans nước thải giàu nitrate Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate. .. quan nƣớc thải chế biến thủy sản .17 1.2.1 Nước thải chế biến thủy sản 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản 19 1.3 Phƣơng pháp xử lý sinh... hợp chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ sung vào nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate Khảo sát thời gian xử lý nitrate chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans nước thải