Xác định sựhiện diện của gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch trong nấm hoàng chi (ganoderma colossumdonk) ởviệt n m

TÓM TẮT Đề tài “Xác định diện gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk) Việt Nam” bao gồm việc đánh giá s điều kiện nhiệt độ p thu nhận sinh kh i nấm nh hƣởng đến tr nh nu i cấy dịch th oàng chi Ganoderma colossum diện củ gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch chi; xác định kh i lƣ ng củ protein onk ; xác định P gene c nấm oàng P th nghiệm ho t t nh kh máu củ n ết qu cho thấy r ng điều kiện t i ƣu cho việc nu i cấy dịch th đ thu nhận sinh kh i nấm nhiệt độ 28oC p b n đầu v i lƣ ng sinh kh i đ t đƣ c sau ngày 14 ngày nuôi cấy lần lƣ t 450 ± 2,45 mg 630 ± 2,62 mg Kết qu PCR gi i trình tự DNA cho thấy có diện củ đo n gen quy định nấm oàng chi c k ch thƣ c thấy protein P nấm kh i lƣ ng củ k Pở bp Các ph n t ch protein nghi n cứu cho oàng chi c kh i lƣ ng 13,114 kD ph h p v i P đ đƣ c nghi n cứu trƣ c đ y n m kho ng t – 15 protein FIP củ nấm oàng chi c ho t t nh làm t n đ i v i máu ngƣ i c nh m máu O nhƣng g y ngƣng kết đ i v i máu c u Kết qu thu đƣ c t đề tài đƣ c thực báo cáo nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk), làm t ng cho thí nghiệm nh m xác định đầy đủ trình tự gen lo i nấm quý Việt Nam, phát tri n công nghệ s n xuất protein FIP ứng dụng y học i ABSTRACT Our project n med s “ etermining the presence of the gene that codes for an immunomodulatory protein in Ganoderma colossum Donk in Việt N m” w s carried out from July-2014 to July-2015, at Laboratory of Biology of Thu Dau Mot university, Binh Duong province We studied the liquid culture condition of G colossum’s myceli to get living mass of fungus by estimating the influence of temperature and pH degree on culture environment; determined the presence of fungal immunomodulatory protein (FIP) in G colossum by PCR method and gene sequencing Otherwise, we isolated FIP, measured its mass and also tested the ability of hemaglutination of FIP Our results showed that at the optimal temperature of myceli ’s culture w s 28oC, with beginning culture environment pH degree was 5, the living mass of fungus could get high rate of 450 ± 2,45 mg and 630 ± 2,62 mg at day and day 14 post-culture, simultaneouly The results of PCR and gene sequencing showed that the isolated fragment of FIP gene in G colossum was 312 bp Protein analysis demonstr ted th t P’s molecul r weight w s 13,114 kD, definitely appropriated in range of 11 - 15 kD of FIPs found in orther Ganodermataceace Especially, aggregation was observed from sheep red blood cells in the presence of purified FIP of G colossum However, no aggregation was seen for any type of human red blood cells Here, we firstly studied the sequence of FIP gene and protein, as well as its property in hemaglutination in Ganoderma colossum Donk This research served as a foundation for further experiments of sequencing this fungal DNA genome and manufacturing immunomodulatory protein for medical use ii MỤC LỤC Tóm tắt i Abstract .ii Mục lục iiiii Danh mục chữ viết tắt vi Danh sách b ng viii Danh sách hình viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔN QU N T U Tổng qu n nấm oàng chi 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nấm ồng chi 1.1.2 Gi i thiệu chung nấm oàng chi 1.1.3 Vai trò nấm oàng chi 111 ọ protein điều chỉnh miễn dịch Chƣơng NỘ Ps 144 UN V P ƢƠN P ÁP N ÊN CỨU 210 2.1 Nội dung nghiên cứu 210 2.2 Vật liệu h 2.2 chất th nghiệm 210 Chủng nấm nghi n cứu 210 2.2.2 Hóa chất 210 2.3 Phƣơng pháp nghi n cứu 253 2.3.1 Nghiên cứu nh hƣởng điều kiện nhiệt độ độ pH lên sinh trƣởng củ hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng dịch th 253 2.3.2 Xác định gen quy định protein 2.3.3 Thu nhận protein P t nấm oàng Chi 264 P t nấm oàng chi th nghiệm ho t t nh P 286 2.4 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 351 iii 2.5 Phƣơng pháp x lý s liệu 352 Chƣơng ẾT QU VÀ TH O LUẬN 363 3.1 nh hƣởng củ điều kiện nhiệt độ p l n sinh trƣởng củ hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng nu i cấy dịch th 363 Nu i cấy hệ s i nấm oàng chi thu nhận sinh kh i 363 nh hƣởng củ điều kiện nhiệt độ p l n sinh trƣởng củ hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng nu i cấy dịch th 374 3.2 Xác định gen quy định protein P t nấm oàng Chi 39 3.2.1 Hiệu qu ly trích DNA 39 3.2.2 Khuếch đ i đo n gen FIP 39 3.3 Thu nhận protein FIP t nấm hoàng chi th nghiệm ho t t nh FIP 472 Xác định Protein P t nấm oàng chi 472 Th nghiệm ho t t nh protein P t nấm oàng chi 494 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 Kết luận 5247 Đề nghị 47 TÀI LI U THAM KH O 48 PHỤ LỤC 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa Amino acid bp Base pair cs Cộng kD kilo Dalton DNA Deoxyribonucleic Acid ĐC Đ i chứng EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid FIP Fungal immunomodulatory protein GMI G microsporum immunomodulatory protein GS iáo sƣ IL Interleukin INF Interferon LZ Lingzhi PCR Polymerase Chain Reaction TERT Telomerase reverse transcriptase TNF Tumor necrosis factor v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc t nh b n củ s protein Ps 165 Bảng 2.1 Các môi trƣ ng dùng nu i cấy hệ s i nấm oàng chi 210 Bảng 2.2 Hóa chất dùng ly tr ch DNA nấm ồng chi 221 Bảng 2.3 Hóa chất dùng phân tích PCR 221 ản Thành phần protein chu n s dụng làm th ng chu n S S-PAGE 243 Bảng 2.5 Các nghiệm thức kh o sát điều kiện ni cấy s i nấm Hồng chi 24 Bảng 3.1 Sự tăng trƣởng sinh kh i theo th i gian hệ s i nấm Hoàng chi m i trƣ ng dịch th t i nhiệt độ 200C, 240C, 280C C đơn vị mg) .2436 Bảng 3.2 T lệ tăng sinh kh i hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng dịch th s u ngày so v i ngày nu i cấy 38 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH n Chu kỳ sinh trƣởng phát tri n củ nấm Đ m n Th qu T colossus tự nhiên t i Q.1- Tp Hồ Chí Minh 99 Hình 1.3 Ganoderma colossum mọc tr n m n cƣ Hình 1.4 Th qu Ganoderma colossum tự nhiên Cát Tiên 10 Hình 1.5 Trình tự amino acid s FIP 15 Hình 1.6 Trình tự cấu trúc amino acid cấu trúc bậc hai FIP-gts 176 Hình 1.7 ƣ c đồ minh họ chế điều hoà củ P theo đƣ ng cytokines 187 Hình 2.1 ệ th ng sắc ký lọc gel 29 n ệ th ng điện di protein SDS-PAGE .341 n ệ s i nấm s u n ệ s i nấm ngày nu i cấy m i trƣ ng P tr n đ petri 364 oàng chi G colosum đƣ c nu i cấy tr n m i trƣ ng dịch th máy lắc ổn nhiệt .375 n nh hƣởng củ nhiệt độ p m i trƣ ng lên sinh trƣởng hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng lỏng s u n ngày ngày nu i cấy 36 T lệ tăng sinh kh i hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng dịch th s u ngày so v i ngày nu i cấy 38 Hình 3.5 Kết qu điện di đo n gen nấm oàng chi đƣ c khuếch đ i cặp mồi LZ8 41 Hình 3.6 Kết qu gi i trình tự đo n gen đƣ c xác định quy định protein FIP t nấm oàng chi đƣ c khuếch đ i cặp mồi Z 41 vii Hình 3.7 Kết qu tra cứu so sánh b ng công cụ BLAST SEARCH nucleotide trình tự đo n gen xác định đƣ c v i ngân hàng Genbank 42 Hình 3.8 Kết qu tra cứu so sánh b ng cơng cụ BLAST SEARCH trình tự acid amin protein FIP t nấm Hoàng chi 42 n Sắc k đồ thu nhận protein P 484 Hình 3.10 Kết qu điện di protein nấm oàng chi .495 Hình 3.11 Kết qu th ho t t nh protein P thu nhận đƣ c t nấm oàng chi v i ph n ứng kh máu 5046 viii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài ọ nấm inh chi (Ganodermataceae) biết c nhiều loài quý nhƣ inh chi chu n Ganoderma lucidum s dụng l nh vực y dƣ c Phƣơng Đ ng loài Trong đ r rst đ đƣ c năm n y nh m điều trị nhiều lo i bệnh khác nh u ngƣ i nhƣ bệnh vi m g n m n t nh c o huyết áp cholesterol hoá m ch máu ti u đƣ ng tắc nghẽn động m ch vành hen suyễn vi m loét d dày iện n y đ xác định đƣ c nấm inh chi c kho ng nhiều lo i polys cch ride c giá trị nhƣ -D glucan đ ng đƣ c xem yếu t m i c tác dụng ch ng ung thƣ Các nghi n cứu củ Zh ng cộng T ng cộng lo i triterpens rcm r cộng Qin cộng 999 …cho thấy ho t chất triterpens polys cch rides protein c nguồn g c t th qu nấm inh chi c m i tƣơng qu n dƣơng t nh v i đáp ứng miễn dịch th Ngoài r đáng k đến họ protein điều chỉnh miễn dịch Ps immunomodul tory protein đ ng đƣ c gi i kho học nghi n cứu s dụng điều trị bệnh hi m nghèo năm 9 loài inh chi chu n ino cộng việc P đƣ c phát lần đầu ti n 9 v i t n gọi Z-8 (FIP-glu) P đƣ c nghi n cứu kỹ v i v i trò nhƣ lo i protein ch ng dị ứng phổ rộng điều hoà miễn dịch Qin cộng lƣ ng fung l đ chứng minh v i hàm µg/ml protein Z- đ c th làm tế bào lách chuột tăng sinh t i v i hàm lƣ ng 9% cịn µg/ml th protein đ ch ng đƣ c ph n ứng ngƣng kết máu ngƣ i Cho t i n y P đ đƣ c t m thấy nhiều loài nấm khác nh u t nấm dƣ c liệu nhƣ inh chi đến nấm ăn nhƣ pháp cổ n nhƣ đ phát r im ch m h y nấm Rơm v i c ng phƣơng Z- thực ph n ứng PCR v i cặp mồi đ t m LZ-8) Nấm oàng chi Ganoderma colosum Donk) loài nấm quý Việt N m đ đƣ c nhiều công trình chứng minh có thành phần ho t chất đ d ng v i ho t tính sinh học c o nhƣ kháng khu n (Ofodile cộng sự, 2005), kháng HIV tuýp I (Dine cộng sự, 2008), ức chế tế bào ung thƣ g n Weng cộng sự, 2010) Mặc dù v i thành phần ho t chất đƣ c biết đ d ng, song nghiên cứu chủ yếu m i tập trung vào triterpenoid nhƣ colossol ctones -G) (Kleinwacher cộng sự, 2001; Dine cộng sự, 2008), phenolic (Dine cộng sự, 2009) thành phần khác v n đ đƣ c biết có vai trị quan trọng họ inh chi noderm t ce e nhƣ polys cch ride h y protein th thơng tin đề cập, chẳng h n nấm đặc thù t i Việt N m nhƣ Ganoderma colossum V i mục đ ch t m hi u protein vai trị t nấm Hồng chi, chọn đề tài: “Xác định diện gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk) Việt N m” Tính đề tài: Đ y kết qu đầu ti n chƣ đƣ c nghi n cứu c ng b nƣ c tr n gi i thực tr n đ i tƣ ng nấm oàng Chi củ Việt N m Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Đánh giá điều kiện nhiệt độ độ p nh hƣởng l n sinh trƣởng củ hệ s i nấm oàng chi m i trƣ ng dịch th - Xác định gen quy định protein - Thu nhận protein P t nấm oàng chi P t nấm oàng chi th nghiệm ho t t nh kh máu Nhiệt độ C sau ngày pH Bình 123,7 329,7 277 129,3 126,5 327,2 279,4 126,6 125,2 333,1 281,3 132,1 Trung bình 125,1333 330 279,2333 129,3333 Độ l c c u n 1,40119 2,961419 2,15484 2,750152 Nhiệt độ C sau 14 ngày pH Bình 190,3 512,4 373,8 218,9 188,4 517,8 374,5 221,6 192,1 516,2 371,2 220,8 Trung bình 190,27 515,4667 373,1667 220,4333 1,850225 2,773686 1,738774 1,386843 Độ l c c u n Nhiệt độ C sau ngày pH Bình 61 148,2 450,5 324,6 169,4 150,4 452,7 326,2 166,3 152,3 447,8 322,4 164,9 Trung bình 150,3 450,3333 324,4 166,8667 2,051828 2,454248 1,907878 2,302897 Độ l c c u n Nhiệt độ C sau 14 ngày pH Bình 202,1 633,3 467,2 291,6 206,4 629,7 462,1 294,7 201,7 628,2 464,2 288,1 Trung bình 203,40 630,4 464,5 291,4667 2,605763 2,621068 2,563201 3,30202 Độ l c c u n Nhiệt độ C sau ngày pH Bình 113,3 280 230,8 125,9 116,1 276,4 228,1 125,4 62 114 281,7 229,4 121,4 Trung bình 114,4667 279,3667 229,4333 124,2333 Độ l c c u n 1,457166 2,706166 1,350309 2,466441 Nhiệt độ C sau 14 ngày pH Bình 188,5 449,2 354,1 226,5 187,4 444,1 349,7 228,1 183,3 448,3 352,6 230,8 Trung bình 186,40 447,2 352,1333 228,4667 2,740438 2,722132 2,236813 2,173323 Độ l c c u n 63 Kết giải trình tự sản ph m PCR t genome nấm Hồng chi (Ganoderma colossum) CƠN TY TN DỊC VỤ VÀ T ƢƠN MẠ N M O 793/58 Trần Xuân Soạn, P Tân Hưng, Q.7, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam ISO Phone: (08)37715818; (08)37752252 (08)37752250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com namkhoa.biotek@gmail.com 9001:2008 Fax: (08)37750583; Email: WHO GMP/GLP S : ISO 13485 163/2015/DVVS KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM THƠNG TIN VỀ MẪU THỬ Nơi gởi mẫu: TĂN Mẫu thử: Mẫu nấm Yêu cầu: Gi i trình tự chiều P ƢƠN CƠN TRƢỜNG P ÁP T ỰC HIỆN  Gi i trình tự chiều Kết Kết giải trình tự TCCGACACTGCCTTGATCTTCAGGCTCGCCTGGGACGTGAAGAAGCTCTCGTTTGACTACACCCCGAAC TGGGGCCGCGGCAACCCCAACAACTTCATCGACACTGTCACCTTCCCGAAAGTCTTGACCGACAAGGC GTACACGTACCGCGTCGCCGTCTCCGGACGGAACCTCGGCGTGAAACCCTCGTACGCGGTCGAGAGCG ACGGCTCGCAGAAGGTCAACTTCCTCGAGTACAACTCCGGGTATGGCATAGCGGACACGAACACGATC CAGGTGTTCGTTGTCGACCCCGACACCAACAACGACTTC Trình tự amino acid 64 SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDG SQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDF Kết tra cứu BLAST SEARCH RecName: Full=Immunomodulatory protein Ling Zhi-8; Short=LZ-8 [Ganoderma lucidum] Sequence ID: sp|P14945.2|LZ8_GANLULength: 111Number of Matches: See more title(s) Related Information Structure-3D structure displays Identical Proteins-Identical proteins to P14945.2 Range 1: to 105GenPeptGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 65 Score Expect 211 bits(537) 4e-68 Query Method Compositional matrix adjust Identities Positives Gaps 104/104(100%) 104/104(100%) 0/104(0%) SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGV 60 SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGV Sbjct SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGV 61 Query 61 KPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDF 104 KPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDF Sbjct 62 KPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDF 105 66 Kết qu đăng t p chí khoa học 3.1 Hội nghị Khoa học Kỹ thuật trƣ ng đ i học Y dƣ c Tp Hồ Chí Minh, 2017 67 68 69 70 71 72 3.1 T p chí Khoa học trƣ ng Đ i học Thủ Dầu Một 73 3.2 S n ph m đào t o Dự án đ g p phần đào t o 01 học viên cao học đ ghi t i phần s n ph m dự án) 74 75