(Luận văn) nghiên cứu chuyển gen vào giống bưởi đỏ thông qua agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: lu an NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS n va p ie gh tn to d oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC u nf va an lu Hệ đào tạo : Chính quy ll oi m Chuyên ngành : Công nghệ sinh học : Công nghệ Sinh học - Cơng nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 – 2014 z at nh Khoa z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2014 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: lu NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS an n va tn to p ie gh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC oa nl w Hệ đào tạo d : Chính quy lu : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Cơng nghệ Thực phẩm u nf Khóa học va an Chuyên ngành ll oi m Giảng viên hướng dẫn : 2010 - 2014 PGS.TS Ngơ Xn Bình z at nh (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) z Ths Lương Thị Thu Hường (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông lâm Thái Nguyên) m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2014 n va ac th si LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, em tiến hành thực tập tốt nghiệp phịng thí nghiệm ni cấy mơ, khoa Cơng nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm Sau tháng thực tập phịng thí nghiệm em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua lu an Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Xn Bình Ths Lương va Thị Thu Hường tận tình bảo, hướng dẫn em suốt thời gian thực tập n tn to Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới KS Lã Văn Hiền tận tình hướng dẫn gh tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập hồn p ie thành khóa luận w Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lòng động viên, d nghiên cứu oa nl giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập lu an Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài khơng tránh khỏi sai em hoàn thiện ll u nf va sót Em mong nhận đóng góp kiến thầy cô bạn để đề tài oi m Em xin chân thành cảm ơn! z at nh Thái nguyên, tháng năm 2014 Sinh viên thực z m co l gm @ Bùi Thị Ý an Lu n va ac th si DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng bưởi Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lượng bưởi Thế giới giai đoạn 2006 – 2012 14 Bảng 2.3: Sản lượng sản xuất bưởi châu lục giới năm 2012 14 Bảng 2.4: Diện tích, suất bưởi số nước qua năm 2010 – 2012 15 Bảng 2.5: Diện tích, suất, sản lượng Việt Nam (2006 – 2012) 16 lu Bảng 4.1: Ảnh hưởng tuổi thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus sau 14 ngày 36 an Bảng 4.2: Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen gus 38 va n Bảng 4.3: Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 41 p ie gh tn to Bảng 4.4: Ảnh hưởng nồng độ PPT đến khả chọn lọc chồi chuyển gen 43 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây bưởi năm tuổi Hình 2.2: Lá bưởi có eo Hình 2.3: Hoa bưởi Hình 2.4: Biểu đồ thể giá trị xuất bưởi số nước giới Hình 2.5: Một số hình ảnh giống bưởi đỏ lu Hình 2.6: Biểu đồ thể giá trị nhập bưởi số nước giới 15 an Hình 2.6: Vi khuẩn A tumefaciens gây bệnh khối u thực vật 21 va n Hình 2.7: Ti plasmid có dịng Agrobacterium gây độc 22 tn to Hình 2.8: Cơ chế phân tử chuyển gen qua A tumefaciens 22 gh p ie Hình 2.9: Sơ đồ cấu trúc vector pCamvia3301 23 w Hình 2.10: Kết nhuộm X-gluc callus 24 oa nl Hình 3.1: T-DNA plasmid pCambia3301 (gen gus, bar, Ca MV35S, Promoter) 27 d Hình 3.2: Quy trình chuyển gen gus vào bưởi thơng qua A tumefaciens 28 lu va an Hình 3.3: Sơ đồ quy trình phát gen bar 30 u nf Hình 4.1: Đoạn thân mầm bưởi đỏ tuổi khác sau biến nạp nhuộm X-gluc 37 ll Hình 4.2: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau lây nhiễm với phương thức khác oi m nhuộm X-gluc 40 z at nh Hình 4.3: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau đồng nuôi cấy với thời gian khác z nhuộm X-gluc 42 @ gm Hình 4.4: Chồi bưởi đỏ ni cấy môi trường chọn lọc nồng độ PPT khác 44 m co l Hình 4.5: Kết điện di DNA tổng số 44 Hình 4.6: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 45 an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT As Bar BAP CCM Cs CaMV35S CT CV lu DNA an Đ/c va FAO n GA3 gh tn to FMV p ie GM Gus Gibberellic Acid Germination Medium β-1,4-Glucuronidase Indole-3-Acetic Acid β – Indol Butyric Acid Least Singnificant Diference Test Murashige & Skoog (1962) 4-methylumbelliferyl β-D-Glucuronide α -Napthalene Acetic Acid Rooting Medium Ribonucleic Acid interference Shoot Elongation Medium Shoot Induction Medium Tumor Including Plasmid United States Department of Agriculture 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronidase Acid Polymerase Chain Reaction phosphinothricine an Lu polyethylene glycol m co PPT Figwort mosaic virus l PEG Food and Agriculture Organization gm PCR Đối chứng @ X-gluc Deoxyribonucleic Acid z USDA Coeficient of Variation z at nh Ti -plasmid Công thức oi SIM Cauliflower Mosaic Virus m SEM Cộng ll RNAi Co-Cultivation Medium u nf RM 6- Benzyl Amino Purine va NAA Phosphinothricin acetyltransferase an MUG Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) lu MS d LSD oa nl IBA w IAA : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : n va ac th si MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn lu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU an 2.1 Giới thiệu chung bưởi va n 2.1.1 Nguồn gốc phân loại tn to 2.1.2 Đặc điểm thực vật học bưởi gh 2.1.2.1 Bộ rễ p ie 2.1.2.2 Thân Cành 2.1.1.3 Lá nl w 2.1.2.4 Hoa d oa 2.2 Giá trị bưởi 2.2.1 Giá trị dinh dưỡng lu va an 2.2.2 Giá trị kinh tế 2.2.3 Giá trị sử dụng u nf 2.3 Đặc điểm giống bưởi đỏ ll oi m 2.4 Vùng sản xuất bưởi Việt nam 10 z at nh 2.5 Phương pháp nhân giống bưởi 10 2.5.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 10 2.5.2 Phương pháp nhân giống công nghệ sinh học 11 z gm @ 2.6 Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi giới Việt Nam 13 2.6.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi giới 13 l 2.6.2 Tình hình sản suất, tiêu thụ bưởi Việt Nam 16 m co 2.7 Nghiên cứu chuyển gen bưởi giới Việt Nam 17 an Lu 2.7.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bưởi giới 17 2.7.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bưởi Việt Nam 18 n va ac th si 2.8 Các phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật 18 2.8.1 Biến nạp trực tiếp 19 2.8.2 Biến nạp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 20 2.9 Cơ sở khoa học kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterimum Tumefaciens 20 2.9.1 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 2.9.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 2.9.3 Cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua A tumefaciens 22 2.9.4 Hệ thống vector pCambia 3301 22 2.9.5 Gen thị sàng lọc gus 23 lu an 2.9.6 Gen thị chọn lọc bar 25 va PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 n 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 tn to 3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 27 ie gh 3.2.1 Hóa chất sử dụng 27 p 3.2.2 Thiết bị sử dụng 27 w 3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 27 oa nl 3.4 Nội dung nghiên cứu 28 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 d an lu 3.5.1 Chuẩn bị mẫu thực vật 29 va 3.5.2 Chuẩn bị khuẩn biến nạp 29 u nf 3.5.3 Lây nhiễm đồng nuôi cấy 29 ll 3.5.4 Tái sinh chọn lọc 29 m oi 3.5.5 Đánh giá biểu gen gus 30 z at nh 3.5.6 Đánh giá chuyển gen 30 3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá xử lý kết 32 z 3.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 @ gm 3.6.2 Theo dõi, đánh giá, xử lý số liệu 35 l PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 m co 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus 36 an Lu n va ac th si 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp lây nhiễm đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 38 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 40 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ PPT đến khả chọn lọc chồi chuyển gen 43 4.5 Kết đánh giá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ (bar) vào bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết Luận 46 lu an 5.2 Đề nghị 46 va TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 n Tài liệu tiếng Việt 47 p ie gh tn to Tài liệu tiếng Anh 49 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck) loại ăn có múi có giá trị dinh dưỡng cao sử dụng với nhiều mục đích khác Trong 100g thịt bưởi tươi có: Đường 6-12%, lipit 0,1g, protein 0,9g, xenluloza 0,2g, vitamin B1, B2, caroten 0,2mg…và số khoáng chất dạng vi lượng cần thiết cho thể người (Vũ Cơng Hậu, 1998)[11] Ngồi dùng để ăn tươi bưởi cịn dùng chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị khác lu an như: Nước hoa quả, mứt, nước ngọt, tinh dầu, hương liệu Trong công va nghiệp chế biến vỏ, hạt để lấy tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng bồi n bổ thể, đặc biệt bưởi có tác dụng tốt để chữa bệnh đường ruột, tim mạch Ở Việt Nam, điều kiện khí hậu đất đai thích hợp cho trồng ăn quả, ie gh tn to (Nguyễn Hữu Đống, 2003)[9] p bưởi ăn đặc sản trồng phổ biến khắp ba miền với w 100 giống có nhiều giống bưởi quý: Bưởi Năm Roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi oa nl Đoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Đỏ Mê Linh…(Trần Thế Tục cs, 1998)[28] Một số d giống bưởi Việt Nam coi loại tốt giới Năm Roi, Da xanh, lu an hai giống bưởi không hạt, chất lượng cao u nf va Những năm gần đây, sản lượng bưởi nước ta thấp ảnh hưởng sâu bệnh chủ yếu; đặc biệt bệnh vàng (Greening) bệnh tàn lụi (Tristeza) ll oi m ảnh hưởng đến suất phẩm chất bưởi (Ngơ Hồng Bình, 2006)[7] z at nh Trong phương pháp nhân giống truyền thống như: Gieo hạt, chiết, ghép cành nhiều hạn chế Gieo hạt: Thời gian hoa kết trái lâu thường không sai quả; chiết ghép cành tuổi thọ giống rút ngắn, dễ bị nhiễm bệnh từ z gm @ gốc nhanh chóng bị chặt bỏ sau vài năm trồng Phương pháp ghép chồi đỉnh, nuôi cấy mô tế bào chuyển gen thực vật phương pháp đem lại hiệu cao l nhân giống tạo bệnh lồi thực vật thân gỗ, bao gồm m co có múi cung cấp đặc tính thông qua biến đổi an Lu trình ni cấy (Yan- Xin Duan cs, 2007)[53] Ở nước ta việc ứng dụng công nghệ sinh học cơng tác chọn tạo có múi bệnh, có suất cao n va ac th si 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận Từ kết thu đề tài đưa số kết luận sau: Một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu biến nạp gen chọn lọc chồi chuyển gen bưởi đỏ - Tuổi mẫu thân mầm 20 ngày tuổi cho hiệu biến nạp gen tốt, tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ 26,7%, tỷ lệ nảy chồi 36,7% lu an - Lây nhiễm khuẩn kết hợp với siêu âm 30 giây, hút chân không 30 giây n va ngâm 30 phút cho hiệu biến nạp gen cao, tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ 62,5% nhuộm gus+ 39,6% - Nồng độ PPT phù hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen mg/l, tỷ lệ mẫu nảy p ie gh tn to - Thời gian đồng nuôi cấy ngày cho hiệu biến nạp gen tốt với tỷ lệ mẫu w chồi 36,8%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc 5,5% d 5.2 Đề nghị oa nl Phân tích sản phẩm PCR bưởi đỏ chuyển gen cho kết dương tính với gen bar lu an - Tiến hành thí nghiệm để thăm dị, đánh giá hiệu biến nạp gen u nf va số giống bưởi khác Việt Nam dựa kết thu ll - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác đến hiệu biến nạp oi m gen từ hồn thiện quy trình chuyển gen bưởi đỏ z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ, 2008 Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ 11(1): 90 – 95 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng (tập II chuyển nạp gen) Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp lu an Lê Trần Bình, 1993 Ứng dụng kỹ thuật vi ghép nhân giống cam chanh va Nxb Nông nghiệp Huế n cải tiến giống trồng Nxb Nông nghiệp ie gh tn to Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997 Công nghệ sinh học thực vật p Lê Trần Bình, 2007 Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học Nhà Xuất Bản Đại học Huế w oa nl Lê Trần Bình, 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà Xuất Bản d Khoa học Công nghệ lu va an Ngơ Hồng Bình, 2006 Kỹ thuật trồng số ăn vùng duyên hải miền trung Nxb Nông nghiệp Hà Nội u nf ll Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ, 2006 Cơng nghệ chuyển gen m oi động vật, thực vật Đại học Huế z at nh Nguyễn Hữu Đống, Viện nghiên cứu phổ biến kiến thức bách khoa, tủ sách hồng phổ biến kiến thức bách khoa, chủ đề nơng nghiệp nơng thơn, 2003 Cây z ăn có múi (cam Chanh, quýt, bưởi) Nxb Nghệ An @ Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp m co l gm 10 Lê Trần Đức, 1997 Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu 11 Vũ Công Hậu, 1998 Trồng ăn Việt Nam, Nxb Nông nghiệp an Lu n va ac th si 48 12 Lê Thị Ánh Hồng 2000 Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn Văn Kế, 2001 Cây ăn nhiệt đới Nxb Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh 14 Đỗ Tất Lợi, 2003 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà Xuất Bản trẻ Hà Nội 15 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, 2006 Giáo trình cơng nghệ gen nơng nghiệp Đại học Huế 16 Nguyễn Hồng Lộc, 2007 Giáo trình nhập mơn Cơng nghệ Sinh học Nxb Đại lu an học Huế va 17 Hoàng Minh, 2005 Sổ tay kỹ thuật trồng chăm sóc số chủng loại ăn n tn to Nhà Xuất Bản Lao động – xã hội Hà Nội bưởi Sa Điền (Trung Quốc) số vùng sinh thái phía Bắc Việt Nam Đề p ie gh 18 Lương Thị Kim Oanh, 2011 Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học giống w tài nghiên cứu cấp Đại học Nông Lâm Thái Nguyên oa nl 19 Nguyễn Thị Minh Phương, 2007 Cây đặc sản kỹ thuật trồng Nxb Nông d nghiệp Hà Nội lu an 20 Nguyễn Văn Phượng, Nguyễn Chi Mai, Đào Thị Sen, Lê Văn Sơn, Lê Trần va Bình, Chu Hồng Hà, 2010 Nghiên cứu quy trình tái sinh đa chồi chuyển ll u nf gen vào cam Xã Đồi (Citrus sinensis) thơng qua Agrobacterium oi m tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2): 203 – 211 z at nh 21 Hoàng Thị Sản, 2011 Phân loại học thực vật Nxb Giáo dục Việt Nam 22 Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đồn Văn Lư, Nguyễn Đức Bách, Abhaya z Dandenkar, 2013 Nghiên cứu chuyển gen mẫn cảm Auxin (ino-rolb) vào @ l 892 – 901 gm giống quýt Đường Canh cam Vinh Tạp chí khoa học phát triển 11(6): m co 23 Nguyễn Tiến Thịnh, Lê Văn Thức, 2007 Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro phân lập đột biến trồng nhân giống sinh dưỡng, Hội nghị khoa học an Lu n va ac th si 49 công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Nxb Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh, trang 155 – 163 24 Lê Văn Tố, Nguyễn Duy Đức, Nguyễn Vũ Hồng hà, Vũ Mạnh Hải, Đỗ Đình Ca, 2006 Kỹ thuật trồng chăm sóc ăn theo ISO, Quyển 1: Cây có múi Nxb Lao Động Xã Hội 25 Tổ chức GTZ Metro Cash Carry Việt Nam, công ty Nghiên Cứu Thị Trường Axis Research, 2006 Dự án nghiên cứu chuỗi giá trị cho bưởi Vĩnh Long từ tháng 12/2005-2/2006 26 Tổng cục thống kê Niên giám thống kê 2013 Nhà Xuất Bản thống kê Hà Nội lu an 27 Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, Đỗ Đình Ca, 1996 Các vùng trồng cam quýt n va Việt Nam Tạp chí Nơng Nghiệp Cơng nghiệp Thực phẩm, 408, tn to trang 106 – 137 Lư, 1998 Giáo trình ăn Nxb Nơng nghiệp Hà Nội p ie gh 28 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Phạm Văn Cơn, Hồng Ngọc Thuận, Đồn Thế w 29 Hồng Ngọc Thuận, 2000 Nhân giống vơ tính ăn (chiết, ghép, giâm oa nl cành, tách chồi nuôi cấy in vitro Nhà Xuất Bản Nông nghiệp Huế d 30 Đoàn Thu Thủy, Trương Quốc Cần, N Baisk, O Normal, SW Datta, 2008 Kêt an lu chuyển gen gus vào lúa với điều khiển promoter khác va Tạp chí Cơng nghệ Sinh hoc 6(3): 321- 326 ll u nf 31 Trần Thượng Tuấn cộng tác viên, 1994 Cây ăn trái đồng sông Cửu oi m Long Sở khoa học Công nghệ Môi trường An Giang z at nh 32 Võ Quốc Việt, Đào Thị Thu Hương, Ma Thị Thúy Vân, 2010 Giáo trình ăn Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội z Tài liệu tiếng Anh @ effecting transformation Plant Cell Reports 18: 271 – 278 of and m co factors transformation l Agrobacterium-mediated gm 33 M Cervera, J A Pina, J Juárez, L Navarro, L Peña 1998 Citrange: regeneration an Lu n va ac th si 50 34 M Dutt, J Madhavaraj, J W Grosser, 2010 Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation and plant regeneration from a complex tetraploid hybrid citrus rootstock Scientia Horticulturae 123: 454 – 458 35 Diane Luth, Gloria Moore, 1999 Trangenic grapefruit plants obtained by agrobacterium tumefaciens – mediated transformation Plant cell Tissue and Organ Culture 57: 219 – 222 36 Deacon J, Robertson A, Isbiter A, 2005, The Microbial World: Biology and control of Crown Gall (Agrobacterium tumerfaciens) Institute of cell and Molecular Biology The Univercity of Edinburgh lu an 37 Elisabetta Nicolosi, 2007 Origin and Taxonomy, Citrus Genetics Breeding and va Biotechology, Dipartimento di OrtoFloroArboricoltura e technologie n Agroalimentari, University of Cattania, Italy gh tn to 38 FAOSTAT (2014) Producion from : http://faostat.fao.org p ie 39 M A Gutiérrez-E, D Luth, GA Moore (1997), “Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation in Citrus and production of sour nl w orange (Citrus aurantium L.) plants expressing the coat protein gene of citrus d oa tristeza virus”, Plant Cell Reports, 16(11), p 745-753 an lu 40 Kondeti Subramanyam, Koona Subramanyam, K V Sailaja, K Lakshmidevi, 2011 Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of banana cv Rasthali va u nf (AAB) via sonucation and vacuum infiltration Plant Cell Rep 30: 425 – 426 ll 41 Maria Luiza Peixoto de Oliveira, Vicente J Febres, Marcio Gilberto Cardoso m oi Costa, Gloria A Moore, Wagner Campos Otoni (2009), “High-efficiency z at nh Agrobacterium-mediated transformation of citrus via sonication and vacuum infiltration” Plant Cell Rep 28, p.387-395 z @ 42 Mehrzad Mahmoudian, Meral Yucel, Huseyin Avni Oktem 2002 Transformation of gm Lentil (Lens culinaris M.) Cotyleddonary Nodes by Vacuum Infiltation of m co l Agrobacterium tumerfacies Plant Molecular biology Reporter 20: 251 – 257 43 Margie M Paz, Juan Carlos Martinez, Andrea B Kalvig, Tina M Fonger, Kan an Lu Wang (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative n va ac th si 51 explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Rep, 25, p 206-213 44 Paudyal KP, Haq N, 2007 Variation of pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) in Nepal and participatory selection of strais for further improvement Agroforestry system 72(3): 195 – 204 45 Pichaiyongvongdee S, Haruenkit R, 2009 Investtiation of limonoids, flavanones, total polyphenol content and antioxidant activity in seven Thai pummel cultivars Kasetsart J (Nat.Sci) 43: 458 – 466 46 Richard A Jefferson, Sean M Burgess, David Hish, 1986 β-glucuronidase lu an from Escherichia coli as a gene fusion marker Proc natl Acad Sci U S A n va 83(22), 8447 8451 β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants The EMBO Journal 6(13), 3901 – 3907 p ie gh tn to 47 Richard A Jefferson, Tony A.Kavanagh, Michael W.Bevan, 1987 GUS fusion: 48 P Spiegel Roy, E.E Goldschmidt, 1996 Biology of horticultural crops Biology nl w of Citrus Press Syndicate of the Univercity of Cambridge d oa 49 Seiichi Toki, Susumu Takamatsu, Chyuhei Nojiri, Shinya Ooba, Hiroyuki Anzai, an lu Michiaki Iwata, Alan H Christensen, Peter H Quail, Hirofumi Uchimiya, 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric gene in transgenic va u nf Rice Plants Plant Physiol 100(3): 1503 – 1507 ll 50 E R Santarém, H N Trick, J S Essig, J J Finer (1998), “Sonication-assisted m oi Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: z at nh optimization of transient expression”, Plant Cell Reports, 17, p 752-759 51 USDA (2014), Search databases from: http://www.ars.usda.gov z 189: 37 – l gm @ 52 Walther F, A Saucer, 1989 In vitro mtagenesis in Rose, Acta Horticulturea m co 53 Yan- Xin Duan, Xin Liu, Jing Fan, Ding- Li Li, Reng-Chao Wu, and Wen Wu Guo (2007), “Mutiple shoot induction from seedling epicotyls and transgenic an Lu n va ac th si 52 citrus plant regeneration containing the green fluorescent protein gene”, Botanical Studies, 48, p.165 -171 54 Tolkowsky, 1938 hesperides: a history of the culture and use of citrus fruits John Bale, Sons and Curnow Ltd, London 55 Tanaka, 1954 Species problem in citrus (Revisio aurantiacearum, IX) Japan Society Prom Sci, veno, Tokyo 56 Z.N Yang, I.L Ingelbrecht, E Louzada, M Skaria, T.E Mirkov (2000), “Agrobacterium-mediated transformation of the commercially important grapefruit cultivar Rio Red (Citrus paradisi Macf.)”, Plant Cell Reports, 19, p lu 1203-1211 an 57 Brukhin V, Clapham D, Elfstrand M, Arnol SV, 2000 Basta tolerance as va n selectable and screening marker for transgenic plant of Narway spruce Plant p ie gh tn to Cell Rep 19: 889 – 903 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần Môi Môi Môi Môi Môi trường trường trường trường kéo trường tạo chồi dài chồi tạo rễ nảy mầm lây nhiễm (CCM) (SIM) (SEM) (RM) MS đa lượng, vi lượng - 1x 1x 1x 1x Sucrose 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l Agar g/l g/l g/l g/l g/l pH 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 *BAP - - 2,0 mg/l - - *IAA - - 0,2 mg/l - - *GA3 - - - 1,0 mg/l - *IBA - - - - 1,0 mg/l - - - *Acetosyringone - 20 µM - - - d - 100 mg/l - - - - 500 mg/l - - - - 250 mg/l - - - lu (GM) an n va p ie gh tn to oa nl w *NAA *Ticarcillin 1,0 mg/l ll u nf va *Vancomyxine an lu *Cefotaxime oi m Ghi chú: (*) – lọc qua màng lọc bổ sung sau khử trùng môi trường Thành phần 5 m co l Agar gm NaCl 10 @ Yeast-extract Khối lượng (g/l) z Bacto-peptone z at nh Phụ lục Môi trường YEP (pH = 7) 12 an Lu n va ac th si Phụ lục Thành phần môi trường MS Thành phần g/l Lượng lấy (ml) KNO3 1900 20 NH4NO3 1650 20 KH2 PO4 170 10 MgSO4.7H2O 370 10 CaCl2.2H2O 440 10 FeSO4.7H2O Na2EDTA 27,8 37,3 10 (B5 minor) H3 BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4 CoCl2.6H2O 0,3 0,76 0,2 0,075 0,025 0,0025 0,0025 10 Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxin-HCl Thiamin-HCl 10 0,1 0,1 20 lu STT an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu (B5 Vitamins) oi m Phụ lục Thành phần môi trường X-gluc Hoá chất 0,211g l 100mg m co Na3PO4 gm X – Gluc 0,0165g @ K4(FeCN)6 Lượng lấy z K3(Fe(CN)6 z at nh (Chuẩn bị 100ml dung dịch X-gluc) an Lu Chuẩn pH = sử dụng CH3COOH 115 mM n va ac th si Phụ lục Kết xử lý số liệu Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng tuổi mẫu thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus khả nảy chồi bưởi đỏ - Ảnh hưởng tuổi thân mầm đến tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TSO FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE VARIATE V003 TSO LN SOURCE OF VARIATION lu SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.13500 1.06750 3.40 0.103 CTHUC$ 143.820 47.9400 152.59 0.000 * RESIDUAL 1.88501 314168 * TOTAL (CORRECTED) 11 147.840 13.4400 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE MEANS FOR EFFECT NLAI - an n va NLAI DF TSO 21.9750 21.2500 20.9750 tn to NOS 4 ie gh SE(N= 4) 0.280254 5%LSD 6DF 0.969442 - p MEANS FOR EFFECT CTHUC$ NOS TSO oa nl w CTHUC$ - d ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE lu STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 3.6661 0.560 2.6 0.1027 ll u nf TSO GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 21.400 va VARIATE an F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - |CTHUC$ | | | 0.0000 | | | | oi m - Ảnh hưởng mẫu thân mầm đến khả nảy chồi bưởi đỏ LN SOURCE OF VARIATION DF z at nh BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI z SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 621667 310833 0.99 0.427 CT$ 702.670 234.223 745.51 0.000 * RESIDUAL 1.88506 314177 * TOTAL (CORRECTED) 11 705.177 64.1070 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL - m co l gm @ NOS N.CHOI an Lu NL n va ac th si 4 26.2250 26.3250 25.8000 SE(N= 4) 0.280257 5%LSD 6DF 0.969455 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 N.CHOI 17.7667 36.7000 30.0000 20.0000 SE(N= 3) 0.323613 5%LSD 6DF 1.11943 - lu ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE an F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - va VARIATE n GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 26.117 tn to N.CHOI STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.0067 0.56051 2.1 0.4271 |CT$ | | | 0.0000 | | | | p ie gh Thí nghiệm 2: ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen khả nảy chồi bưởi đỏ - Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen bưởi đỏ LN oa nl w BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.GUS FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE VARIATE V003 N.GUS SOURCE OF VARIATION DF d SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 8.16667 4.08333 1.96 0.255 CT$ 2600.00 1300.00 623.99 0.000 * RESIDUAL 8.33350 2.08337 * TOTAL (CORRECTED) 2616.50 327.062 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE MEANS FOR EFFECT NL - ll u nf va an lu oi m NOS 3 N.GUS 46.3333 46.6667 44.5000 z at nh NL z CT$ SE(N= 3) NOS 3 N.GUS 22.5000 52.5000 62.5000 0.833342 an Lu m co l gm @ SE(N= 3) 0.833342 5%LSD 4DF 3.26652 MEANS FOR EFFECT CT$ - n va ac th si 5%LSD 4DF 3.26652 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 45.833 N.GUS STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 18.085 1.4434 3.1 0.2552 |CT$ | | | 0.0002 | | | | - Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến khả nảy chồi bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF lu an n va gh tn to SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 28.5000 14.2500 5.70 0.069 CT$ 1212.50 606.250 242.51 0.000 * RESIDUAL 9.99961 2.49990 * TOTAL (CORRECTED) 1251.00 156.375 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL p ie NOS 3 N.CHOI 62.3333 58.3333 61.8333 d oa nl w SE(N= 3) 0.912853 5%LSD 4DF 3.57819 MEANS FOR EFFECT CT$ N.CHOI 72.5000 65.0000 45.0000 u nf va NOS 3 an lu CT$ ll SE(N= 3) 0.912853 5%LSD 4DF 3.57819 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE oi m z at nh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 12.505 1.5811 2.6 0.0686 z |CT$ | | | 0.0005 | | | | gm @ N.CHOI GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 60.833 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen bưởi đỏ LN SOURCE OF VARIATION DF m co l BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.GUS FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE VARIATE V003 N.GUS an Lu SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 44.8317 22.4158 6.08 0.036 CT$ 682.430 227.477 61.66 0.000 n va ac th si * RESIDUAL 22.1350 3.68916 * TOTAL (CORRECTED) 11 749.397 68.1270 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 4 N.GUS 36.3750 32.2500 36.3250 SE(N= 4) 0.960360 5%LSD 6DF 3.32204 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 lu an N.GUS 22.5333 35.7000 42.1000 39.6000 n va gh tn to SE(N= 3) 1.10893 5%LSD 6DF 3.83596 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - ie p VARIATE STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.2539 1.9207 5.5 0.0365 |CT$ | | | 0.0002 | | | | nl w N.GUS GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 34.983 d oa Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ PPT đến tỷ lệ nảy chồi tỷ lệ sống sót chồi chuyển gen - ảnh hưởng nồng độ PPT đến tỷ lệ mẫu nảy chồi an lu LN SOURCE OF VARIATION u nf va BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI DF ll SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 37.6800 18.8400 4.91 0.085 CT$ 553.280 276.640 72.04 0.002 * RESIDUAL 15.3600 3.84001 * TOTAL (CORRECTED) 606.320 75.7900 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL - oi m z at nh z m co N.CHOI 48.6667 43.6667 46.4667 l NOS 3 gm @ NL an Lu SE(N= 3) 1.13137 5%LSD 4DF 4.43473 MEANS FOR EFFECT CT$ n va ac th si CT$ NOS 3 3 N.CHOI 56.0000 36.8000 46.0000 SE(N= 3) 1.13137 5%LSD 4DF 4.43473 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 46.267 N.CHOI STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.7057 1.9596 4.2 0.0847 |CT$ | | | 0.0017 | | | | lu - Ảnh hưởng Nồng độ PPT đến tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc an BALANCED ANOVA FOR VARIATE C.SONG FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE VARIATE V003 C.SONG va n LN SOURCE OF VARIATION DF p ie gh tn to SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 686667 343333 6.44 0.058 CT$ 25.3400 12.6700 237.57 0.000 * RESIDUAL 213328 533321E-01 * TOTAL (CORRECTED) 26.2400 3.28000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL - oa nl w NL NOS 3 d an lu C.SONG 4.83333 4.16667 4.40000 u nf va SE(N= 3) 0.133332 5%LSD 4DF 0.522632 - ll MEANS FOR EFFECT CT$ C.SONG 5.80000 5.50000 2.10000 z at nh NOS 3 oi m CT$ z SE(N= 3) 0.133332 5%LSD 4DF 0.522632 - gm @ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE l F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.8111 0.23094 5.2 0.0575 |CT$ | | | 0.0005 | | | | an Lu C.SONG GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 4.4667 m co VARIATE n va ac th si PHỤ LỤC ẢNH b c d e f lu a an n va p ie gh tn to oa nl w d a) Quả bưởi chín; b) Mẫu thân mầm ni cấy mơi trường 20 ngày; lu va an c) Mẫu đồng nuôi cấy ngày; d) Mẫu nhuộm gus; e) Mẫu tái sinh sau 28 ngày; ll u nf f) Mẫu chọn lọc với PPT sau 14 ngày oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si