(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu chuyển gen vào giống bưởi đỏ thông qua agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THƠNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Cơng nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 – 2014 Thái Nguyên - 2014 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THƠNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Cơng nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn PGS.TS Ngơ Xn Bình (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) Ths Lương Thị Thu Hường (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên - 2014 n LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, em tiến hành thực tập tốt nghiệp phịng thí nghiệm ni cấy mô, khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm Sau tháng thực tập phịng thí nghiệm em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Xn Bình Ths Lương Thị Thu Hường tận tình bảo, hướng dẫn em suốt thời gian thực tập Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới KS Lã Văn Hiền tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình thực tập hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lịng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài khơng tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, tháng năm 2014 Sinh viên thực Bùi Thị Ý n DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng bưởi Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lượng bưởi Thế giới giai đoạn 2006 – 2012 14 Bảng 2.3: Sản lượng sản xuất bưởi châu lục giới năm 2012 14 Bảng 2.4: Diện tích, suất bưởi số nước qua năm 2010 – 2012 15 Bảng 2.5: Diện tích, suất, sản lượng Việt Nam (2006 – 2012) 16 Bảng 4.1: Ảnh hưởng tuổi thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus sau 14 ngày 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen gus 38 Bảng 4.3: Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 41 Bảng 4.4: Ảnh hưởng nồng độ PPT đến khả chọn lọc chồi chuyển gen 43 n DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây bưởi năm tuổi Hình 2.2: Lá bưởi có eo Hình 2.3: Hoa bưởi Hình 2.4: Biểu đồ thể giá trị xuất bưởi số nước giới Hình 2.5: Một số hình ảnh giống bưởi đỏ Hình 2.6: Biểu đồ thể giá trị nhập bưởi số nước giới 15 Hình 2.6: Vi khuẩn A tumefaciens gây bệnh khối u thực vật 21 Hình 2.7: Ti plasmid có dòng Agrobacterium gây độc 22 Hình 2.8: Cơ chế phân tử chuyển gen qua A tumefaciens 22 Hình 2.9: Sơ đồ cấu trúc vector pCamvia3301 23 Hình 2.10: Kết nhuộm X-gluc callus 24 Hình 3.1: T-DNA plasmid pCambia3301 (gen gus, bar, Ca MV35S, Promoter) 27 Hình 3.2: Quy trình chuyển gen gus vào bưởi thông qua A tumefaciens 28 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình phát gen bar 30 Hình 4.1: Đoạn thân mầm bưởi đỏ tuổi khác sau biến nạp nhuộm X-gluc 37 Hình 4.2: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau lây nhiễm với phương thức khác nhuộm X-gluc 40 Hình 4.3: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau đồng nuôi cấy với thời gian khác nhuộm X-gluc 42 Hình 4.4: Chồi bưởi đỏ ni cấy môi trường chọn lọc nồng độ PPT khác 44 Hình 4.5: Kết điện di DNA tổng số 44 Hình 4.6: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 45 n DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT As Bar BAP CCM Cs CaMV35S CT CV DNA Đ/c FAO FMV GA3 GM Gus IAA IBA LSD MS MUG NAA RM RNAi SEM SIM Ti -plasmid USDA X-gluc PCR PEG PPT : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) Phosphinothricin acetyltransferase 6- Benzyl Amino Purine Co-Cultivation Medium Cộng Cauliflower Mosaic Virus Công thức Coeficient of Variation Deoxyribonucleic Acid Đối chứng Food and Agriculture Organization Figwort mosaic virus Gibberellic Acid Germination Medium β-1,4-Glucuronidase Indole-3-Acetic Acid β – Indol Butyric Acid Least Singnificant Diference Test Murashige & Skoog (1962) 4-methylumbelliferyl β-D-Glucuronide α -Napthalene Acetic Acid Rooting Medium Ribonucleic Acid interference Shoot Elongation Medium Shoot Induction Medium Tumor Including Plasmid United States Department of Agriculture 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronidase Acid Polymerase Chain Reaction polyethylene glycol phosphinothricine n MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung bưởi 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật học bưởi 2.1.2.1 Bộ rễ 2.1.2.2 Thân Cành 2.1.1.3 Lá 2.1.2.4 Hoa 2.2 Giá trị bưởi 2.2.1 Giá trị dinh dưỡng 2.2.2 Giá trị kinh tế 2.2.3 Giá trị sử dụng 2.3 Đặc điểm giống bưởi đỏ 2.4 Vùng sản xuất bưởi Việt nam 10 2.5 Phương pháp nhân giống bưởi 10 2.5.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 10 2.5.2 Phương pháp nhân giống công nghệ sinh học 11 2.6 Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi giới Việt Nam 13 2.6.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi giới 13 2.6.2 Tình hình sản suất, tiêu thụ bưởi Việt Nam 16 2.7 Nghiên cứu chuyển gen bưởi giới Việt Nam 17 2.7.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bưởi giới 17 2.7.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bưởi Việt Nam 18 n 2.8 Các phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật 18 2.8.1 Biến nạp trực tiếp 19 2.8.2 Biến nạp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 20 2.9 Cơ sở khoa học kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterimum Tumefaciens 20 2.9.1 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 2.9.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 2.9.3 Cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua A tumefaciens 22 2.9.4 Hệ thống vector pCambia 3301 22 2.9.5 Gen thị sàng lọc gus 23 2.9.6 Gen thị chọn lọc bar 25 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 27 3.2.1 Hóa chất sử dụng 27 3.2.2 Thiết bị sử dụng 27 3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 27 3.4 Nội dung nghiên cứu 28 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1 Chuẩn bị mẫu thực vật 29 3.5.2 Chuẩn bị khuẩn biến nạp 29 3.5.3 Lây nhiễm đồng nuôi cấy 29 3.5.4 Tái sinh chọn lọc 29 3.5.5 Đánh giá biểu gen gus 30 3.5.6 Đánh giá chuyển gen 30 3.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá xử lý kết 32 3.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 3.6.2 Theo dõi, đánh giá, xử lý số liệu 35 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus 36 n 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp lây nhiễm đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 38 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 40 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ PPT đến khả chọn lọc chồi chuyển gen 43 4.5 Kết đánh giá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ (bar) vào bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết Luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Tài liệu tiếng Việt 47 Tài liệu tiếng Anh 49 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck) loại ăn có múi có giá trị dinh dưỡng cao sử dụng với nhiều mục đích khác Trong 100g thịt bưởi tươi có: Đường 6-12%, lipit 0,1g, protein 0,9g, xenluloza 0,2g, vitamin B1, B2, caroten 0,2mg…và số khoáng chất dạng vi lượng cần thiết cho thể người (Vũ Cơng Hậu, 1998)[11] Ngồi dùng để ăn tươi bưởi dùng chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị khác như: Nước hoa quả, mứt, nước ngọt, tinh dầu, hương liệu Trong công nghiệp chế biến vỏ, hạt để lấy tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng bồi bổ thể, đặc biệt bưởi có tác dụng tốt để chữa bệnh đường ruột, tim mạch (Nguyễn Hữu Đống, 2003)[9] Ở Việt Nam, điều kiện khí hậu đất đai thích hợp cho trồng ăn quả, bưởi ăn đặc sản trồng phổ biến khắp ba miền với 100 giống có nhiều giống bưởi quý: Bưởi Năm Roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Đỏ Mê Linh…(Trần Thế Tục cs, 1998)[28] Một số giống bưởi Việt Nam coi loại tốt giới Năm Roi, Da xanh, hai giống bưởi không hạt, chất lượng cao Những năm gần đây, sản lượng bưởi nước ta thấp ảnh hưởng sâu bệnh chủ yếu; đặc biệt bệnh vàng (Greening) bệnh tàn lụi (Tristeza) ảnh hưởng đến suất phẩm chất bưởi (Ngô Hồng Bình, 2006)[7] Trong phương pháp nhân giống truyền thống như: Gieo hạt, chiết, ghép cành nhiều hạn chế Gieo hạt: Thời gian hoa kết trái lâu thường không sai quả; chiết ghép cành tuổi thọ giống rút ngắn, dễ bị nhiễm bệnh từ gốc nhanh chóng bị chặt bỏ sau vài năm trồng Phương pháp ghép chồi đỉnh, nuôi cấy mô tế bào chuyển gen thực vật phương pháp đem lại hiệu cao nhân giống tạo bệnh loài thực vật thân gỗ, bao gồm có múi cung cấp đặc tính thơng qua biến đổi q trình ni cấy (Yan- Xin Duan cs, 2007)[53] Ở nước ta việc ứng dụng công nghệ sinh học cơng tác chọn tạo có múi bệnh, có suất cao cịn n 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận Từ kết thu đề tài đưa số kết luận sau: Một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu biến nạp gen chọn lọc chồi chuyển gen bưởi đỏ - Tuổi mẫu thân mầm 20 ngày tuổi cho hiệu biến nạp gen tốt, tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ 26,7%, tỷ lệ nảy chồi 36,7% - Lây nhiễm khuẩn kết hợp với siêu âm 30 giây, hút chân không 30 giây ngâm 30 phút cho hiệu biến nạp gen cao, tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ 62,5% - Thời gian đồng nuôi cấy ngày cho hiệu biến nạp gen tốt với tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ 39,6% - Nồng độ PPT phù hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen mg/l, tỷ lệ mẫu nảy chồi 36,8%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc 5,5% Phân tích sản phẩm PCR bưởi đỏ chuyển gen cho kết dương tính với gen bar 5.2 Đề nghị - Tiến hành thí nghiệm để thăm dò, đánh giá hiệu biến nạp gen số giống bưởi khác Việt Nam dựa kết thu - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác đến hiệu biến nạp gen từ hồn thiện quy trình chuyển gen bưởi đỏ n 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ, 2008 Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ 11(1): 90 – 95 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng (tập II chuyển nạp gen) Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Lê Trần Bình, 1993 Ứng dụng kỹ thuật vi ghép nhân giống cam chanh Nxb Nông nghiệp Huế Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997 Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nxb Nơng nghiệp Lê Trần Bình, 2007 Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học Nhà Xuất Bản Đại học Huế Lê Trần Bình, 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà Xuất Bản Khoa học Công nghệ Ngô Hồng Bình, 2006 Kỹ thuật trồng số ăn vùng duyên hải miền trung Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, 2006 Công nghệ chuyển gen động vật, thực vật Đại học Huế Nguyễn Hữu Đống, Viện nghiên cứu phổ biến kiến thức bách khoa, tủ sách hồng phổ biến kiến thức bách khoa, chủ đề nông nghiệp nông thơn, 2003 Cây ăn có múi (cam Chanh, qt, bưởi) Nxb Nghệ An 10 Lê Trần Đức, 1997 Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 11 Vũ Công Hậu, 1998 Trồng ăn Việt Nam, Nxb Nông nghiệp n 48 12 Lê Thị Ánh Hồng 2000 Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn Văn Kế, 2001 Cây ăn nhiệt đới Nxb Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 14 Đỗ Tất Lợi, 2003 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà Xuất Bản trẻ Hà Nội 15 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, 2006 Giáo trình cơng nghệ gen nơng nghiệp Đại học Huế 16 Nguyễn Hoàng Lộc, 2007 Giáo trình nhập mơn Cơng nghệ Sinh học Nxb Đại học Huế 17 Hoàng Minh, 2005 Sổ tay kỹ thuật trồng chăm sóc số chủng loại ăn Nhà Xuất Bản Lao động – xã hội Hà Nội 18 Lương Thị Kim Oanh, 2011 Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học giống bưởi Sa Điền (Trung Quốc) số vùng sinh thái phía Bắc Việt Nam Đề tài nghiên cứu cấp Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 19 Nguyễn Thị Minh Phương, 2007 Cây đặc sản kỹ thuật trồng Nxb Nông nghiệp Hà Nội 20 Nguyễn Văn Phượng, Nguyễn Chi Mai, Đào Thị Sen, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà, 2010 Nghiên cứu quy trình tái sinh đa chồi chuyển gen vào cam Xã Đồi (Citrus sinensis) thơng qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2): 203 – 211 21 Hoàng Thị Sản, 2011 Phân loại học thực vật Nxb Giáo dục Việt Nam 22 Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đồn Văn Lư, Nguyễn Đức Bách, Abhaya Dandenkar, 2013 Nghiên cứu chuyển gen mẫn cảm Auxin (ino-rolb) vào giống quýt Đường Canh cam Vinh Tạp chí khoa học phát triển 11(6): 892 – 901 23 Nguyễn Tiến Thịnh, Lê Văn Thức, 2007 Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro phân lập đột biến trồng nhân giống sinh dưỡng, Hội nghị khoa học n 49 công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Nxb Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh, trang 155 – 163 24 Lê Văn Tố, Nguyễn Duy Đức, Nguyễn Vũ Hồng hà, Vũ Mạnh Hải, Đỗ Đình Ca, 2006 Kỹ thuật trồng chăm sóc ăn theo ISO, Quyển 1: Cây có múi Nxb Lao Động Xã Hội 25 Tổ chức GTZ Metro Cash Carry Việt Nam, công ty Nghiên Cứu Thị Trường Axis Research, 2006 Dự án nghiên cứu chuỗi giá trị cho bưởi Vĩnh Long từ tháng 12/2005-2/2006 26 Tổng cục thống kê Niên giám thống kê 2013 Nhà Xuất Bản thống kê Hà Nội 27 Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, Đỗ Đình Ca, 1996 Các vùng trồng cam qt Việt Nam Tạp chí Nơng Nghiệp Cơng nghiệp Thực phẩm, 408, trang 106 – 137 28 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Phạm Văn Cơn, Hồng Ngọc Thuận, Đồn Thế Lư, 1998 Giáo trình ăn Nxb Nơng nghiệp Hà Nội 29 Hồng Ngọc Thuận, 2000 Nhân giống vơ tính ăn (chiết, ghép, giâm cành, tách chồi nuôi cấy in vitro Nhà Xuất Bản Nơng nghiệp Huế 30 Đồn Thu Thủy, Trương Quốc Cần, N Baisk, O Normal, SW Datta, 2008 Kêt chuyển gen gus vào lúa với điều khiển promoter khác Tạp chí Cơng nghệ Sinh hoc 6(3): 321- 326 31 Trần Thượng Tuấn cộng tác viên, 1994 Cây ăn trái đồng sông Cửu Long Sở khoa học Công nghệ Môi trường An Giang 32 Võ Quốc Việt, Đào Thị Thu Hương, Ma Thị Thúy Vân, 2010 Giáo trình ăn Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 33 M Cervera, J A Pina, J Juárez, L Navarro, L Peña Agrobacterium-mediated factors effecting transformation transformation Plant Cell Reports 18: 271 – 278 n and of 1998 Citrange: regeneration 50 34 M Dutt, J Madhavaraj, J W Grosser, 2010 Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation and plant regeneration from a complex tetraploid hybrid citrus rootstock Scientia Horticulturae 123: 454 – 458 35 Diane Luth, Gloria Moore, 1999 Trangenic grapefruit plants obtained by agrobacterium tumefaciens – mediated transformation Plant cell Tissue and Organ Culture 57: 219 – 222 36 Deacon J, Robertson A, Isbiter A, 2005, The Microbial World: Biology and control of Crown Gall (Agrobacterium tumerfaciens) Institute of cell and Molecular Biology The Univercity of Edinburgh 37 Elisabetta Nicolosi, 2007 Origin and Taxonomy, Citrus Genetics Breeding and Biotechology, Dipartimento di OrtoFloroArboricoltura e technologie Agroalimentari, University of Cattania, Italy 38 FAOSTAT (2014) Producion from : http://faostat.fao.org 39 M A Gutiérrez-E, D Luth, GA Moore (1997), “Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation in Citrus and production of sour orange (Citrus aurantium L.) plants expressing the coat protein gene of citrus tristeza virus”, Plant Cell Reports, 16(11), p 745-753 40 Kondeti Subramanyam, Koona Subramanyam, K V Sailaja, K Lakshmidevi, 2011 Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of banana cv Rasthali (AAB) via sonucation and vacuum infiltration Plant Cell Rep 30: 425 – 426 41 Maria Luiza Peixoto de Oliveira, Vicente J Febres, Marcio Gilberto Cardoso Costa, Gloria A Moore, Wagner Campos Otoni (2009), “High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of citrus via sonication and vacuum infiltration” Plant Cell Rep 28, p.387-395 42 Mehrzad Mahmoudian, Meral Yucel, Huseyin Avni Oktem 2002 Transformation of Lentil (Lens culinaris M.) Cotyleddonary Nodes by Vacuum Infiltation of Agrobacterium tumerfacies Plant Molecular biology Reporter 20: 251 – 257 43 Margie M Paz, Juan Carlos Martinez, Andrea B Kalvig, Tina M Fonger, Kan Wang (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative n 51 explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Rep, 25, p 206-213 44 Paudyal KP, Haq N, 2007 Variation of pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) in Nepal and participatory selection of strais for further improvement Agroforestry system 72(3): 195 – 204 45 Pichaiyongvongdee S, Haruenkit R, 2009 Investtiation of limonoids, flavanones, total polyphenol content and antioxidant activity in seven Thai pummel cultivars Kasetsart J (Nat.Sci) 43: 458 – 466 46 Richard A Jefferson, Sean M Burgess, David Hish, 1986 β-glucuronidase from Escherichia coli as a gene fusion marker Proc natl Acad Sci U S A 83(22), 8447 8451 47 Richard A Jefferson, Tony A.Kavanagh, Michael W.Bevan, 1987 GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants The EMBO Journal 6(13), 3901 – 3907 48 P Spiegel Roy, E.E Goldschmidt, 1996 Biology of horticultural crops Biology of Citrus Press Syndicate of the Univercity of Cambridge 49 Seiichi Toki, Susumu Takamatsu, Chyuhei Nojiri, Shinya Ooba, Hiroyuki Anzai, Michiaki Iwata, Alan H Christensen, Peter H Quail, Hirofumi Uchimiya, 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric gene in transgenic Rice Plants Plant Physiol 100(3): 1503 – 1507 50 E R Santarém, H N Trick, J S Essig, J J Finer (1998), “Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression”, Plant Cell Reports, 17, p 752-759 51 USDA (2014), Search databases from: http://www.ars.usda.gov 52 Walther F, A Saucer, 1989 In vitro mtagenesis in Rose, Acta Horticulturea 189: 37 – 53 Yan- Xin Duan, Xin Liu, Jing Fan, Ding- Li Li, Reng-Chao Wu, and Wen Wu Guo (2007), “Mutiple shoot induction from seedling epicotyls and transgenic n 52 citrus plant regeneration containing the green fluorescent protein gene”, Botanical Studies, 48, p.165 -171 54 Tolkowsky, 1938 hesperides: a history of the culture and use of citrus fruits John Bale, Sons and Curnow Ltd, London 55 Tanaka, 1954 Species problem in citrus (Revisio aurantiacearum, IX) Japan Society Prom Sci, veno, Tokyo 56 Z.N Yang, I.L Ingelbrecht, E Louzada, M Skaria, T.E Mirkov (2000), “Agrobacterium-mediated transformation of the commercially important grapefruit cultivar Rio Red (Citrus paradisi Macf.)”, Plant Cell Reports, 19, p 1203-1211 57 Brukhin V, Clapham D, Elfstrand M, Arnol SV, 2000 Basta tolerance as selectable and screening marker for transgenic plant of Narway spruce Plant Cell Rep 19: 889 – 903 n PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần Môi Môi Môi Môi Môi trường trường trường trường kéo trường tạo chồi dài chồi tạo rễ nảy mầm lây nhiễm (GM) (CCM) (SIM) (SEM) (RM) MS đa lượng, vi lượng - 1x 1x 1x 1x Sucrose 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l Agar g/l g/l g/l g/l g/l pH 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 *BAP - - 2,0 mg/l - - *IAA - - 0,2 mg/l - - *GA3 - - - 1,0 mg/l - *IBA - - - - 1,0 mg/l *NAA - - - *Acetosyringone - 20 µM - - - *Ticarcillin - 100 mg/l - - - *Cefotaxime - 500 mg/l - - - *Vancomyxine - 250 mg/l - - - 1,0 mg/l Ghi chú: (*) – lọc qua màng lọc bổ sung sau khử trùng môi trường Phụ lục Môi trường YEP (pH = 7) Thành phần Khối lượng (g/l) Bacto-peptone 10 Yeast-extract NaCl Agar 12 n Phụ lục Thành phần môi trường MS STT Thành phần g/l Lượng lấy (ml) KNO3 1900 20 NH4NO3 1650 20 KH2 PO4 170 10 MgSO4.7H2O 370 10 CaCl2.2H2O 440 10 FeSO4.7H2O Na2EDTA 27,8 37,3 10 (B5 minor) H3 BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4 CoCl2.6H2O 0,3 0,76 0,2 0,075 0,025 0,0025 0,0025 10 (B5 Vitamins) Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxin-HCl Thiamin-HCl 10 0,1 0,1 20 Phụ lục Thành phần môi trường X-gluc (Chuẩn bị 100ml dung dịch X-gluc) Hoá chất Lượng lấy K3(Fe(CN)6 0,0165g K4(FeCN)6 0,211g X – Gluc 100mg Na3PO4 115 mM Chuẩn pH = sử dụng CH3COOH n Phụ lục Kết xử lý số liệu Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng tuổi mẫu thân mầm đến hiệu biến nạp gen gus khả nảy chồi bưởi đỏ - Ảnh hưởng tuổi thân mầm đến tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TSO FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE VARIATE V003 TSO LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.13500 1.06750 3.40 0.103 CTHUC$ 143.820 47.9400 152.59 0.000 * RESIDUAL 1.88501 314168 * TOTAL (CORRECTED) 11 147.840 13.4400 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE MEANS FOR EFFECT NLAI NLAI NOS 4 DF TSO 21.9750 21.2500 20.9750 SE(N= 4) 0.280254 5%LSD 6DF 0.969442 MEANS FOR EFFECT CTHUC$ CTHUC$ - NOS TSO ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 23/ 5/14 16:21 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TSO GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 21.400 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 3.6661 0.560 2.6 0.1027 |CTHUC$ | | | 0.0000 | | | | - Ảnh hưởng mẫu thân mầm đến khả nảy chồi bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 621667 310833 0.99 0.427 CT$ 702.670 234.223 745.51 0.000 * RESIDUAL 1.88506 314177 * TOTAL (CORRECTED) 11 705.177 64.1070 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS DF N.CHOI n 4 26.2250 26.3250 25.8000 SE(N= 4) 0.280257 5%LSD 6DF 0.969455 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 N.CHOI 17.7667 36.7000 30.0000 20.0000 SE(N= 3) 0.323613 5%LSD 6DF 1.11943 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 1BS 25/ 5/14 17:28 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE N.CHOI GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 26.117 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.0067 0.56051 2.1 0.4271 |CT$ | | | 0.0000 | | | | Thí nghiệm 2: ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen khả nảy chồi bưởi đỏ - Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến hiệu biến nạp gen bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.GUS FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE VARIATE V003 N.GUS LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 8.16667 4.08333 1.96 0.255 CT$ 2600.00 1300.00 623.99 0.000 * RESIDUAL 8.33350 2.08337 * TOTAL (CORRECTED) 2616.50 327.062 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 3 DF N.GUS 46.3333 46.6667 44.5000 SE(N= 3) 0.833342 5%LSD 4DF 3.26652 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ SE(N= 3) NOS 3 N.GUS 22.5000 52.5000 62.5000 0.833342 n 5%LSD 4DF 3.26652 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 2C 25/ 5/14 21: :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE N.GUS GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 45.833 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 18.085 1.4434 3.1 0.2552 |CT$ | | | 0.0002 | | | | - Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến khả nảy chồi bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 28.5000 14.2500 5.70 0.069 CT$ 1212.50 606.250 242.51 0.000 * RESIDUAL 9.99961 2.49990 * TOTAL (CORRECTED) 1251.00 156.375 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 3 DF N.CHOI 62.3333 58.3333 61.8333 SE(N= 3) 0.912853 5%LSD 4DF 3.57819 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 N.CHOI 72.5000 65.0000 45.0000 SE(N= 3) 0.912853 5%LSD 4DF 3.57819 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG2N 27/ 5/14 22:56 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE N.CHOI GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 60.833 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 12.505 1.5811 2.6 0.0686 |CT$ | | | 0.0005 | | | | Thí nghiệm 3: ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen bưởi đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.GUS FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE VARIATE V003 N.GUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 44.8317 22.4158 6.08 0.036 CT$ 682.430 227.477 61.66 0.000 n * RESIDUAL 22.1350 3.68916 * TOTAL (CORRECTED) 11 749.397 68.1270 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 4 N.GUS 36.3750 32.2500 36.3250 SE(N= 4) 0.960360 5%LSD 6DF 3.32204 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 N.GUS 22.5333 35.7000 42.1000 39.6000 SE(N= 3) 1.10893 5%LSD 6DF 3.83596 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 25/ 5/14 19:23 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE N.GUS GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 34.983 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.2539 1.9207 5.5 0.0365 |CT$ | | | 0.0002 | | | | Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ PPT đến tỷ lệ nảy chồi tỷ lệ sống sót chồi chuyển gen - ảnh hưởng nồng độ PPT đến tỷ lệ mẫu nảy chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE N.CHOI FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE VARIATE V003 N.CHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 37.6800 18.8400 4.91 0.085 CT$ 553.280 276.640 72.04 0.002 * RESIDUAL 15.3600 3.84001 * TOTAL (CORRECTED) 606.320 75.7900 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 3 DF N.CHOI 48.6667 43.6667 46.4667 SE(N= 3) 1.13137 5%LSD 4DF 4.43473 MEANS FOR EFFECT CT$ n CT$ NOS 3 N.CHOI 56.0000 36.8000 46.0000 SE(N= 3) 1.13137 5%LSD 4DF 4.43473 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 25/ 5/14 19:32 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE N.CHOI GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 46.267 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.7057 1.9596 4.2 0.0847 |CT$ | | | 0.0017 | | | | - Ảnh hưởng Nồng độ PPT đến tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc BALANCED ANOVA FOR VARIATE C.SONG FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE VARIATE V003 C.SONG LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 686667 343333 6.44 0.058 CT$ 25.3400 12.6700 237.57 0.000 * RESIDUAL 213328 533321E-01 * TOTAL (CORRECTED) 26.2400 3.28000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 3 DF C.SONG 4.83333 4.16667 4.40000 SE(N= 3) 0.133332 5%LSD 4DF 0.522632 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 C.SONG 5.80000 5.50000 2.10000 SE(N= 3) 0.133332 5%LSD 4DF 0.522632 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BANG 4B 25/ 5/14 20:53 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE C.SONG GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 4.4667 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.8111 0.23094 5.2 0.0575 n |CT$ | | | 0.0005 | | | | PHỤ LỤC ẢNH a b c d e f a) Quả bưởi chín; b) Mẫu thân mầm nuôi cấy môi trường 20 ngày; c) Mẫu đồng nuôi cấy ngày; d) Mẫu nhuộm gus; e) Mẫu tái sinh sau 28 ngày; f) Mẫu chọn lọc với PPT sau 14 ngày n ... tumefaciens? ?? sở cho nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen hữu ích vào bưởi nói riêng ăn nói chung 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả chuyển gen gus, bar vào giống bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens. .. thuật chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterimum Tumefaciens 2.9.1 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển nạp gen kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào gen sinh vật nghiên. .. cứu chuyển gus, bar vào giống bưởi đỏ nhằm xem khả tiếp nhận gen để từ có nghiên cứu để chuyển gen mang đặc tính mong muốn vào bưởi góp phần làm tăng giá trị suất giống bưởi đỏ n PHẦN TỔNG QUAN