(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don )​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 i download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2017 ii download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng 09 năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iii download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn bảo suốt q trình tơi nghiên cứu thực đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực thí nghiệm nghiên cứu đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn; cảm ơn đóng góp ý kiến quý báu buổi seminar khoa học báo cáo đề cương luận văn Trong q trình nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn môn Sinh học đại GD sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống, thầy cô cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iv download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố dừa cạn 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn 1.1.3 Tác dụng dừa cạn 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 1.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 10 1.4 Enzyme peroxidase (Prx) gen mã hóa Prx 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx 12 1.4.2 Gen mã hóa peroxidase (Prx) 13 1.5 Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 14 1.6 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 16 1.6.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 16 1.6.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 17 1.7 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu thực vật 20 v download by : skknchat@gmail.com 2.1.2 Vật liệu di truyền 20 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 20 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.3.2 Phương pháp chuyển gen vào dừa cạn 22 2.3.3 Phân tích chuyển gen 26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 30 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens 30 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don [24] Hình 1.2 Cơng thức hóa học Vinblastine (A) Vincristine (B) Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine vincristine 11 Hình 1.4 Cấu trúc Cấu trúc intron exon CrPrx [15] 13 Hình 2.1 Sơ đồ chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A Tumefaciens 23 Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro 30 Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn 31 Hình 3.3 Mảnh mầm mơi trường đồng ni cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khô đặt lên môi trường SIM 32 Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi môi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM 33 Hình 3.7 Cây giá thể 33 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen 36 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số loại môi trường tái sinh Dừa cạn 24 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24 Bảng 2.3 : Hóa chấ t pha đê ̣m rửa 28 Bảng 2.4: Hóa chấ t pha đê ̣m chiế t 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 29 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn 34 viii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS Acetosyringone bp base pairs Cặp bazơ nitơ CrPrx Catharanthus roseus Gen Prx dừa cạn peroxidase Cộng cs CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked Môi trường đồng nuôi cấy Xét nghiệm ELISA ImmunoSorbent Assay EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GM Germination medium Môi trường tái sinh GMO Genetic Modify Origanism Lương thực thực phẩm biến đổi gen kb Kilo base LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy in vitro theo Murashige Skoog OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Prx Peroxidase Gen mã hóa peroxidase Prx Peroxidase Protein peroxidase RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi ix download by : skknchat@gmail.com SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Vir Virulence region WHO World Health Organization Plasmid gây khối u Tổ chức y tế giới x download by : skknchat@gmail.com ... tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L. ) G Don .)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo dịng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme peroxidase Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme. .. THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L. ) G Don .) Chuyên ngành:... Gen mã hóa peroxidase (Prx) Prx g? ??m gen mã hóa enzyme peroxidase cơng bố ngân hàng gen quốc tế, bao g? ??m: Prx, Prx1, Prx2, Prx3, Prx4… Theo Kumar cộng (200 7) gen mã hóa Prx phân lập từ dừa cạn