(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chuyển gen GUS vào giống ngô LVN99 việt nam

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐẶNG THỊ HOÀNG HÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GUS VÀO GIỐNG NGÔ LVN99 VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, năm 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây ngô (Zea mays L.) năm loại lương thực giới Ở Việt Nam, ngô trồ ng quan tr ọng thứ hai sau lúa gạo Hạt ngô chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cho người gia súc Trong năm gần sản xuất ngô Việt Nam tăng nhanh nhờ thúc đẩy ngành chăn nuôi công nghiệp chế biến Hạt ngô cũng loại ngũ cốc khác dễ bị mọt xâm hại Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) loại đa thực, chúng ăn hầu hết loại ngũ cớc, loại đậu, hạt có dầu nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp với mọt hạt ngô gạo Mọt trưởng thành dùng vòi khoét lỗ sâu vào hạt, đẻ trứng tiết thứ dịch nhầy để bít kín lỗ lại Sâu non nở hạt ngơ, thường ăn phơi trước, sau đến nội nhũ phận khác làm cho hạt lại lớp vỏ mỏng Khi đẫy sức, sâu non đục lỗ nhỏ lộ rõ hạt để vũ hố bay ngồi [16] Defensin thực vật peptide cation thuộc siêu họ lớn peptide kháng khuẩn Defensin thực vật hoạt động tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức kênh protein màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase côn trùng [16] Liu cs (2006) phân lập defensin từ đậu xanh (VrD1) chứng minh vai trị chớng trùng, kháng mọt protein VrD1 VrD1 ức chế hoạt động α-amylase kìm hãm tiêu hóa tinh bột ruột mọt [23] Năm 2008, Pelegrini và cs thông báo phân lập protein defensin1 từ đậu đũa (VuD1) có khả ức chế hoạt động αamylase ấu trùng mọt [25] Các giống ngô lai cho suất cao sản lượng, giá thành, chất lượng bị giảm nhiều hạt gi ống ngô dễ bị mọt xâm hại Hiê ̣n nay, nhiề u bi ện pháp bảo quản hạt ngô sau thu hoạch đã đươ ̣c áp du ̣ng , Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com tốn thời gian, hiệu thấp tổn thất sau thu hoạch lớn Nghiên cứu ứng dụng công ngh ệ sinh học đại tạo giống ngô kháng mọt nhiều nhà khoa học quan tâm , đó có chi ến lược tạo ngô chuyển gen kháng mọt Việt Nam Do viê ̣c nghiên cứu xây dựng quy trình chuyể n gen ở ngô làm sở cho viê ̣c chuyể n thành công gen defensin vào giống ngô Việt Nam phục vụ tạo dịng ngơ chuyển gen có khả kháng mọt cao cần thiết Xuấ t phát từ những lý đã xây dựng và thực hiê ̣n đ ề tài luâ ̣n văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu chuyển gen gus vào giố ng ngô LVN 99 Viê ̣t Nam” Mục tiêu nghiên cứu Xác định tuổi phơi non thích hợp cho biến nạp gen thông qua A tumefaciens đề xuất quy trình chuyển gen ngơ Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu khả tái sinh in vitro tuổi phôi ngô non phu ̣c vu ̣ chuyể n gen ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ tế bào vi khuẩ n A tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone (AS), nồ ng đô ̣ kanamycin và thời gian nhiễm khuẩ n đến hiệu chuyể n gen gus giống ngô lai LVN99 3.2 Nghiên cứu chuyể n gen gus tạo ngô chuyển gen từ giống ngô lai LVN99 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Về khoa ho ̣c , kế t quả nghiên cứu xác đ ịnh tuổi phơi non thích hợp đớ i với sự tá i sinh in vitro hoàn thi ện quy trình tái sinh từ phơi ngơ non phục vụ chuyển gen ngô Chuyển thành công gen gus đề xuất quy trình chuyển gen vào giớng LVN99 Về thực tiễn, kế t quả chuy ển thành công gen gus tạo ngô chuyển gen sở việc ứng dụng quy trình chuyển gen ngô nhằm tạo ngô chuyể n gen có sự tăng cường khả chố ng chiụ các stress từ ngoa ̣i cảnh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm sinh học ngô Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo (Gramineae), hoà thảo (Graminales) Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ hạt hình thái bên ngồi, ngơ phân thành lồi phụ: ngơ đá rắn, ngơ ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa ngựa Từ loài phụ dựa vào màu hạt màu lõi ngô phân chia thành thứ Ngồi ngơ cịn phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng thương phẩm Căn vào hầu hết kết khảo cổ học, dẫn liệu lịch sử tế bào học cho thấy ngơ có nguồn gớc từ châu Mỹ Tuy nhiên dạng ngơ dại khơng cịn tồn nên có nhiều giả thuyết khác nguồn gớc di truyền ngô Điều quan trọng hình thành vơ sớ lồi phụ, thứ nguồn dị hợp thể ngô, dạng biến dạng chúng tạo cho nhân loại lồi ngũ cớc có giá trị đứng cạnh lúa mì lúa nước [32] Cơ quan sinh dưỡng ngơ gồm rễ, thân, làm nhiệm vụ trì đời sống cá thể Hạt coi quan khởi đầu Sau gieo hạt, ngô phát triển thành mầm Cây mầm chủ yếu sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa nội nhũ hạt Bộ phận phía hạt phát triển lên mặt đất gồm có trụ mầm Phần đỉnh trụ mầm có mấu bao mầm, từ phát sinh bao mầm bên bao mầm thân mầm Trên trục mầm, đầu hình thành rễ mầm, sau phát triển thành rễ chính, từ rễ hình thành rễ phụ Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Ngơ có hệ rễ chùm tiêu biểu cho rễ hoà thảo Hệ rễ có loại: rễ mầm, rễ đớt rễ chân kiềng Ngô lớp rễ đốt lúc 3- mầm mọc theo thứ tự từ lên Rễ đốt giúp cho ngô hút nước dinh dưỡng Rễ chân kiềng mọc xung quanh đốt phần thân sát gốc mặt đất, rễ giúp chống đổ, bám chặt vào đất tham gia vào hút nước thức ăn cho Số lượng rễ, số lông rễ độ dài rễ khác giống Đây tiêu quan trọng để đánh giá khả chịu hạn Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng, cứng, dạng bền Thân chia làm nhiều gióng, gióng nằm đớt, gióng dài to dần từ lên Lá ngô mọc từ mắt đốt mọc đối xứng xen kẽ Độ lớn số ngô dao động từ – 22 tuỳ thuộc vào giớng điều kiện tự nhiên theo hình thái vị trí cây, ngơ chia thành nhóm: mầm, thân, ngọn, bi Lá ngô trưởng thành bao gồm phận: bẹ lá, phiến lá, thìa Trên có nhiều khí khổng Cơ chế đóng mở lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán Bắp ngô phát sinh từ mầm nách thân Số mầm nách thân nhiều – mầm nách phát triển thành bắp Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái chăm sóc, thời vụ mà sớ bắp cây, sớ hạt bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu trỗ cờ khác Hạt ngô thuộc loại dĩnh gồm phận chính: vỏ hạt, lớp alơron, phơi nội nhũ (Hình 1.1) Phía hạt có gớc hạt gắn liền với lõi ngơ Vỏ hạt bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tuỳ thuộc vào giống Nằm sau lớp vỏ hạt lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ phôi Nội nhũ phận chiếm 70- 78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu tinh bột, có chứa protein, lipit, vitamin, khống enzym để ni phôi phát triển Phôi ngô lớn (chiếm 8- 15%) nên cần trọng bảo quản [32] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Hình 1.1 Sơ đồ hạt ngơ bổ dọc [43] Các chất hạt ngơ dễ đồng hố nên có giá trị dinh dưỡng cao Hạt ngơ chứa phần lớn tinh bột Hàm lượng tinh bột ngô tẻ nhiều ngô nếp (68% so với 65%) chia thành tinh bột mềm (tinh bột bột) tinh bột cứng (tinh bột sừng) Ngô nếp cấu tạo hồn tồn từ amilopectin nên có độ dẻo ngơ tẻ Hàm lượng lipit cao thứ hai loại hạt ngũ cốc (3,5- 7%) phụ thuộc vào giống, điệu kiện tự nhiên Lipit tập trung phôi tầng alơron Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic Hàm lượng lipit tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích hạt gồm có phần: ngù (phần ngăn cách nội nhũ phôi), mầm, trụ mầm, rễ mầm chồi mầm [32] 1.1.2 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam Ngô vừa lương thực, vừa thức ăn cho gia súc Ngơ có địa bàn phân bố rộng rãi Trong năm gần đây, diện tích ngơ tồn giới tăng lên gấp rưỡi, suất tăng gấp 2,5 lần Diện tích, sản lượng suất ngơ giới có xu hướng tăng qua năm từ niên vụ 2001 – 2002 đến niên vụ 2014 – 2015 Diện tích từ 173,3 triệu niên vụ 2001 2002 tăng lên 177,4 triệu niên vụ 2013 – 2014, tăng 29% vịng 13 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com niên vụ Năng suất cũng tăng 26% giai đoạn 2001 – 2013 Sản lượng ngô giới tăng 63%, bình qn 4,2%/năm Trong đó, sản lượng tăng tăng diện tích 2,2%/năm tăng suất 2% Hoa Kỳ nước dẫn đầu sản lượng ngô, đạt 353 triệu niên vụ 2013 – 2014, Trung Quốc đạt 217 triệu Đứng hàng thứ ba Brazil với sản lượng 80,5 triệu tấn, khối EU-27 đứng thứ tư với sản lượng gần 65 triệu Tổng lượng cung ngô giới có xu hướng tăng liên tục từ niên vụ 2001 đến 2014, bình quân 3,6%/năm chủ yếu tăng sản lượng hàng năm Lượng ngô dự trữ qua năm biến động không lớn, năm dự trữ thấp 104 triệu tấn, năm cao 152 triệu tấn, trung bình khoảng 131 triệu tấn/năm Ở Việt Nam, giống ngô lai trồng hầu hết địa phương có đất cao dễ nước: Đơng Nam Bộ, Tây Nguyên, tỉnh miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung Trong đó, giớng ngơ địa phương chủ yếu tập trung khu vực miền núi phía Bắc đứng nguy bị xói mịn quỹ gen Diê ̣n tić h, suấ t , sản lượng ngô năm (20112015) gầ n tăng không đáng kể (Bảng 1.1) Bảng 1.1 Diê ̣n tích, suấ t và sản lượng ngô năm (2011 - 2015) Việt Nam Diện tích (1000 ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (1000 tấn) 2011 2012 2013 2014 2015 1121,3 1156,6 1179,5 1200,0 1300,0 43,1 43,0 44,3 44,5 45,0 4835,6 4973,6 5188,5 5625,0 5980,0 “Nguồn: Bản đồ thương mại giới” [42] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com Năng suất giống ngơ địa phương thường thấp có ưu điểm chất lượng cao, khả chịu hạn kháng sâu bệnh tớt gieo trồng nhiều loại đất khác Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu đánh giá cách toàn diện nguồn gen giống ngô địa phương cần thiết cho công tác giống, bảo tồn nguồn gen quý 1.2 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY PHÔI NGÔ 1.2.1 Lịch sử nuôi cấy phôi ngô Lịch sử nuôi cấy in vitro ngô sớm vào năm 1930, Lampe Mills nuôi cấy nội nhũ phơi non mơi trường có bổ sung dịch chiết khoai tây [49], mơ sinh trưởng có giới hạn Lần nuôi cấy liên tục thời gian dài nghiên cứu Larue , phôi non phôi trưởng thành ngô nuôi cấy để xác định nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng phát triển [22] Tái sinh từ phơi non phận khác lồi ngũ cốc lần miêu tả năm 1960 đến 1980 [36] Phôi non sử dụng làm nguồn vật liệu nghiên cứu ni cấy mơ ngơ Lu sử dụng phơi có kích thước - 1,5 mm thu sau tuần thụ phấn cấy vào môi trường MS bổ sung 2,4-D từ 0,25 đến 2,0 mg l-1 sucrose từ đến 12% [23] Năm 1987, Wang tái sinh thành cơng từ phơi trưởng thành hai dịng B73 Mo17, khả tái sinh phụ thuộc nhiều vào kiểu gen tỉ lệ tái sinh thấp (4 – %) Đới với dịng ngơ A632 khơng thu tái sinh [38] Năm 1989, Vain cs đánh giá ảnh hưởng ethylene nuôi cấy mô, AgNO3 sử dụng nhu chất ức chế hoạt động ethylene Tỉ lệ tạo mô sẹo dạng II (mô sẹo xốp, vàng, cho tỉ lệ tái sinh cao) nâng cao phôi non nuôi cấy môi trường MS chứa AgNO3 từ đến 20 mg/l Nghiên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com cứu rằng khả tái sinh mô sẹo mơi trường có AgNO3 tăng cao [36] Năm 2004, Zhang cs nghiên cứu 15 dịng ngơ Tangsipingtou bằng nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hưởng kiểu gen, mơi trường, chất kích thích sinh trưởng phương pháp tạo mơ sẹo có nguồn gốc từ phôi non tái sinh Nghiên cứu cho thấy mơ sẹo tạo từ tất 15 dòng thử nghiệm khả tái sinh giảm đến mức độ định với già hóa mơ sẹo [41] Shohael đồng tác giả (2003) tiến hành nghiên cứu dịng CML161; CML-323; CML-327 Phơi non ni cấy môi trường N6, tỉ lệ tạo mô sẹo giao động từ 56,33 đến 72,0 % Kết cho thấy môi trường đạt tỉ lệ mô sẹo cao (72,0 %) mơi trường N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, casein hydroysate 200 mg/l 2,4-D 1,0 mg/l Khi nuôi cấy môi trường MS, tỉ lệ mô sẹo tạo từ 39,0 đến 68,66 % Môi trường cho tỉ lệ mô sẹo cao (68,66%) MS có bổ sung L-asparagine 150 mg/l, thiamin 50 mg/l 2,4-D mg/l Cây tái sinh thành công môi trường MS N6 khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng đạt lỉ lệ tương ứng từ 52,83 đến 61,0 % từ 35,66 đến 42,49 % [29] Năm 2004, Huang Wei tái sinh thành cơng từ phơi trưởng thành dịng ngơ nội phối với tần số tương đối cao (19,8 - 32,4 %) Và đặc biệt với dòng Mo17 đạt 25,6% [18] Binott cs (2005) nuôi cấy phôi non từ 12 dịng ngơ bớ mẹ chủng lai tương ứng chúng để đánh giá khả tạo mô sẹo, phơi hóa tái sinh Hạt non thu giai đoạn khác 10, 15, 18, 21 24 ngày tuổi sau thụ phấn khử trùng bề mặt Phôi non cấy vào môi trường tạo mô sẹo bao gồm môi trường N6 bổ sung 2,4-D - mg/l; L-proline 2,87 g/l; casein hydrosate 0,1 g/l, glycine g/l, sucrose 30 g/l gelrite g/l Mơ Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 10 sẹo hình thành nồng độ 2,4-D mg/l từ 80 đến 90 % đối với phôi non lai từ 50 đến 80 % từ phơi non dịng bớ mẹ Khả phơi hóa tiến hành dòng dòng lai Tuy nhiên tái sinh dòng dòng lai [5] Năm 2011, Gorji đồng tác giả nghiên cứu khả tạo mơ sẹo tái sinh dịng ngơ B73, Oh28, Va35, Gss0966, Vog134 Hi34 Kết cho thấy môi trường N6 cho tần số tạo mô sẹo cao bổ sung Dicamba mg/l, mơi trường MS có bổ sung 2,4-D nồng độ mg/l cho tần sớ tạo mơ sẹo cao Mặt khác, mơi trường N6 có bổ sung Dicamba thúc đẩy q trình tạo mơ sẹo cao so với môi trường N6 bổ sung 2,4-D tỉ lệ cũng chất lượng mô sẹo Trong dịng ngơ thử nghiệm dịng Va35, Gss0966, Vag134 Hi34 có mơ sẹo tớt Bên cạnh đó, dịng Va35 có tỷ lệ hình thành chồi từ mơ cấy cao dịng Vog134 Kết nghiên cứu cịn cho thấy tỉ lệ hình thành rễ cao đưa chồi vào môi trường MS có bổ sung NAA mg/l Mơ cấy hai dịng Va35 Vog134 mơi trường MS có bổ sung BAP mg/l IAA 0,5 mg/l thúc đẩy tần sớ hình thành chồi cao, tỉ lệ tái sinh đạt từ 53 đến 67% [16] Ở Việt Nam, ngô cũng nghiên cứu nuôi cấy nhằm phục vụ cho việc chuyển gen Năm 2005, Phạm Thị Lý Thu nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non ngô Kết nghiên cứu cho thấy tần sớ tạo mơ sẹo dịng ngơ HR8 HR9 đạt 75,2 % 74,1 %, tỷ lệ tái sinh đạt 24,9 % 21,4 % [1] Năm 2009, Nguyễn Văn Đồng cs tiến hành nghiên cứu khả tái sinh từ phôi non 45 dịng ngơ Việt Nam thuộc nhóm ngơ tẻ, ngơ nếp ngơ ngọt, sử dụng dịng đới chứng dịng ngơ mơ hình HR8 có khả tái sinh cao Kết nghiên cứu thu dịng ngơ tẻ VH1, VH11, VH19, VH29; dịng ngơ nếp VHN9, VHN10, VHN16 dịng ngơ VHD2, VHD5 có khả tái sinh cao đồng thời mang sớ đặc tính nơng học tớt sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen [1] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 37 dương tính, hiệu suất biến nạp gen gus giai đoạn tái sinh in vitro đạt 1,22% Mẫu dương tính mẫu có rễ nhuộm X-Gluc có màu xanh chàm đặc trưng (Hình 3.6) Hình 3.6 Kết biểu gen gus nhuộm X-gluc (từ trái sang phải): thân, chồi, lá, rễ A, B, C, D: mẫu chuyển gen biểu hoạt động gen gus; E, F, G, H: mẫu không chuyển gen Các chuyển gen (11 cây) sau có chiều cao khoảng 10 cm có xanh tốt chuyể n từ ố ng nghiê m ̣ giá thể ở điề u kiê ̣n nhà lưới Sau 10 ngày thu số ng sót và nhu ộm X-gluc đối với chuyển gen để đánh giá bi ểu gen gus cho kế t quả c ả dương tính Hiê ̣u suấ t chuyể n gen đươ ̣c xác đinh ̣ ở giai đoa ̣n nhà lưới là 0,33% (Bảng 3.8, Hình 3.7) Mẫu đới chứng có sớ mô sẹo môi trường không chọn lọc bằng kháng sinh đạt 100% Số chồi phát triển mạnh, rễ sinh trưởng tốt 26 (đạt 86,67%), số tái sinh thu 23 cây, đạt chiều cao 10 cm có xanh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 38 tốt đưa giá thể Sau 10 ngày thu 16 (đạt 53,33%) Cây chuyển gen có kích thước nhỏ tốc độ sinh trưởng chậm so với khơng chuyển gen (Hình 3.7) Bảng 3.8 Sớ chuyể n gen số ng sót giá thể và hiê ̣u ś t chủ n gen gus Lơ thí nghiệm Số mẫu Số Số số ng sót Hiêụ suấ t chuyể n đối chứng biến nạp sống sót giá thể gen gus (%) Thí nghiệm 900 11 0,33% Đới chứng 30 16 11 Hình 3.7 Kết biểu gen gus chuyển gen A: mẫu biểu gen gus, B: chuyển gen, C: Cây đối chứng Trong nghiên cứu trước , Takavar cs (2010) thông báo hiê ̣u suấ t chuyể n gen đạt tỉ lệ 1,74% dịng ngơ S61 [28] Hiệu chuyển gen nhờ A tumefaciens ngô theo Nguyễn Văn Đồng cs đạt 1,88% dòng H89, 1,53% dòng H98 [2] Nghiên cứu Phạm Thị Lý Thu cs cho thấy kết chuyển gen vào dòng VH1 0,073% dòng C8H9 đạt 0,06% [1] Trong kế t nghiên cứu chúng tôi, giai đoạn tạo chuyển gen in vitro, tở ng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 39 số 900 mẫu biế n na ̣p có 11 ố ng nghiê ̣m dương tin ́ h với nhuô ̣m X -Gluc hiệu suất chuyển gen giai đoạn đạt 1,22% Tuy nhiên, chuyể n giá thể ở điề u kiê ̣n nhà lưới chỉ có số ng sót và có biể u h iê ̣n gen gus, hiê ̣u suấ t chuyể n gen ở giai đoa ̣n này đa ̣t 0,33% 3.3 Quy trình chuyển gen thơng qua A tumefaciens ngô Như vậy, số yếu tố quy trình chuyển gen vào giớng ngơ LVN99 thơng qua A tumefaciens tối ưu bao gồm: Mật độ A tumefaciens thích hơ ̣p giá trị OD 660nm= 0,8 thời gian nhiễm khu ẩn tố i ưu là 30 phút, bổ sung acetosyringone 150M tuổi phơi từ 10 - 12 ngày tuổi, kích thước 0,9 - 1,3 mm tố i ưu cho kh ả tiếp nhận gen sự tái sinh Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đố i với phôi bi ến nạp 50 mg/l Từ kế t quả , quy trình chuyển gen vào giớng ngơ LVN99 thơng qua A tumefaciens đươ ̣c đề xuất trình bày sơ đồ hình 3.8, hình 3.9 Có thể tóm t trình chuyển gen gus tái sinh ngô chuyể n gen sau: (i) Thu mẫu, tách phôi, nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy Phôi ngô từ 10 – 12 ngày sau thụ phấn thu hoạch, bóc bỏ – lớp vỏ ngồi bắp, bỏ phần phía đầu râu ngơ, khử trùng bề mặt bắp ngơ bằng cồn 70% Sau bắp dùng để tách phôi Phôi tách điều kiện vô trùng Đặt bắp ngô theo chiều dọc, dùng dao cắt phần hạt ngô, ấn nhẹ để đẩy phơi tách khỏi hạt, phơi đạt kích thước 0,9 - 1,3 mm Gây tổn thương bằng mũi dao kim nhọn Nuôi chủng A tumerfaciens C58 chứa gen gus mơi trường LB đặc có bổ sung kanamycin (50 mg/l) rifamicin (50 mg/l) tủ ổn nhiệt 28oC, 48 Chọn khuẩn lạc mọc môi trường LB đặc nuôi cấy LB lỏng với chế độ lắc 2.000 v/p 28oC 16 - 18 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 40 Hình 3.8 Sơ đờ chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 thông qua A tumefaciens Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 41 Lấy dung dịch nuôi lỏng lần (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin rifamycin Ly tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2, loại bỏ dịch hòa tan cặn mơi trường MS lỏng pha lỗng dịch với mật độ tế bào vi khuẩn OD660nm 0,8 Phôi ngô non gây tổn thương, ngâm dịch huyền phù vi khuẩn 30 phút, bổ sung acetosyringone 100 M sau thấm khơ, cấy mơi trường đồng ni cấy A1 phôi nuôi tối ngày (ii) Diệt khuẩn chọn lọc, tạo mô sẹo chọn lọc mô sẹo biến nạp gen Phôi sau gây nhiễm rửa bằng dung dịch cefotaxin 500 mg/l Thấm phôi vào giấy thấm cấy môi trường A2: N6, mg/l 2,4-D , 10 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 500 mg/l cefortaxin, 50 mg/l kanamycin Sau tuần, chuyển phôi sang môi trường A3: N6, mg/l 2,4-D ,20 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 150 mg/l cefortaxin, 25 mg/l kanamycin Sau tuần tiếp theo, cấy mô sẹo sang môi trường A4: N6, mg/l 2,4D, 15 mg/l AgNO3, 1,15 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose Nuôi cấy tối để mô sẹo đạt kích thước lớn (iii) Tái sinh chồi Các mô sẹo sau xử lý chọn lọc đưa vào môi trường tái sinh môi trường N6 có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng BAP 2,0 mg/l; sucrose 60 g/l; 7,5 g/l agar; pH 5,8 Đặt điều kiện 280C, ánh sáng giờ/ngày phịng ni cấy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 42 A A B B C C D D E E F F G G H H II K K LL L M MM Hình 3.9 Hình ảnh chuyển gen gus vào giớng ngô LVN99 thông qua A tumefaciens A, B: tách phôi ngô non; C: gây tổn thương; D, E: nhiễm khuẩn; F: đồng nuôi cấy; G, H: chọn lọc tái sinh chồi; I: nuôi phục hồi; K: tái sinh phôi; L: rễ; M: trồ ng bầ u (iv) Tạo rễ cho giá thể Sau chồi tái sinh chuyển sang môi trường tạo rễ gồm mơi trường ½ N6, mg/l NAA, 30 mg/l sucrose, 7,5 g/l agar; pH 5,8 Đặt điều kiện 280C, ánh sáng giờ/ngày phịng ni cấy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 43 Hình 3.10 Kích thước rễ (A) kích thước thân (B) chuyển giá thể Cây hoàn chỉnh cho đất qua hai đợt huấn luyện: huấn luyện giá thể huấn luyện điều kiện khí hậu Giá thể sử dụng Tribat công ty Trách nhiệm hữu hạn Cơng nghệ sinh học Sài Gịn xanh sản xuất, có chứa đầy đủ thành phần dinh dưỡng, ḿi khống cần thiết cho sinh trưởng, phát triển Khi kích thước in vitro đạt 10 – 15 cm, rễ đạt từ 10 – 12 cm chuyển giá thể (hình 3.9) Cây bình tam giác đưa ngồi, rửa hết thạch bám rễ, trồng vào giá thể Tribat tưới nước đủ ẩm, bao nilon bên để hạn chế nước đặt điều kiện 280C, ánh sáng giờ/ngày phịng ni cấy tạo điều kiện thuận lợi cho rễ thích nghi với giá thể Giai đoạn huấn luyện điều kiện khí hậu tiến hành sau huấn luyện giá thể - 10 ngày Cây đưa điều kiện khí hậu bên ngồi, bỏ bao nilon tưới đủ nước ngày Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Tuổi phôi ngô non , mâ ̣t đô ̣ A tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone, nồ ng đô ̣ kanamycin và thời gian nhiễm khuẩ n ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen gus giố ng ngô lai LVN99 Mật độ A tumefaciens thích hợp giá trị OD 660nm= 0,8 thời gian nhiễm khu ẩn tố i ưu là 30 phút, bổ sung acetosyringone 150M tuổi phơi từ 10 - 12 ngày tuổi, kích thước 0,9 - 1,3mm tố i ưu cho khả tiếp nhận gen sự tái si nh in vitro Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đố i với phôi chuyển gen 50 mg/l 1.2 Chuyển thành công cấu trúc mang gen gus vào giống ngô LVN99 tạo ngô chuyển gen gus sinh trưởng ở điề u kiê ̣n nhà lưới , hiê ̣u suấ t chuyể n gen là 0,33% Đề nghị Ứng dụng quy trình chuyển gen vào ngơ thơng qua A tumefaciens xây dựng để chuyển gen defensin gen mục tiêu khác có giá trị nhằm tạo dịng ngơ chuyển gen có khả chớng chịu stress từ ngoại cảnh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 45 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Vì Thị Xn Thủy , Đặng Thị Hồng Hà , Trầ n Thi Hờ ̣ ng , Chu Hồng Mậu (2016) Chuyể n gen gus qua phôi non ở giố ng ngô LVN 99 nhờ Agrobacterium tumefaciens Kỷ yếu Hội nghị Khoa họ c toàn quốc nghiên cứu giảng dạy sinh học ở Viê ̣t Nam Đà Nẵng – 2016: 1262 – 1269 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007) Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu ứng dụng tạo trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien, Hội nghị khoa học công nghệ tr 345- 350 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Đinh Văn Trình, Lê Thị Thu Về, Nguyễn Văn Tồn, (2009) Nghiên cứu chuyển gen ngun ngơ, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7: 221-227 Lê Huy Hàm (2006) Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo sớ đặc tính nơng sinh học ngô lúa mỳ Báo cáo Viện di truyền nông nghiệp Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007) Tạo thuốc kháng th́c trừ cỏ trùng, phịng Cơng nghệ gen thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới Hội nghị Khoa học công nghệ Phạm Thị Lý Thu (2007) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phơi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô Luận án tiến sĩ sinh học (146 tr) Tài liệu tiếng Anh Anami SE, Mgutu AJ, Taracha C, Coussens G, Karimi M, Hilson P, Lijsebettens MV, Machuka J (2010) Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes Plant Cell Tiss Organ Cult 102:285-295 Armstrong CL, Green CE (1985) Establishment and maintenance of friable, embryogenesis maize callus and the involvement of L-proline Planta, 164: 207 – 214 Bhaskaran S, Smith RA (1990) Regeneration in cereal tissue culture: a review Crop Sci, 30: 1328 - 1336 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 47 Binott JJ, Songa J, Ininda J, Njagi EN, Machuka J (2005) Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids though somatic embryogenesis Afri Crop Sci Conf Prod, 7: 1305 - 1310 10 Bronsema FBF, van Oostveen WJF, van Lammeren AAM (1997) Comparative analysis of callus formation and regeneration on cultured immature maize embryos of the inbred lines A188 and A632 Plant Cell Tiss Organ 50: 57–65.) 11 Benson EE (2000), Special symposium: in vitro plant recalcitrance in vitro plant recalcitrance: an introduction, In Vitro Cell Dev Biol –Plant 36: 141148 12 Chan MT, Lee TM, Chang HH (1992) Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens Plant Cell Physiol, 33: 577- 583 13 Chan MT, Chang HH, Ho SL, Tong WF, Yu SM (1993) Agrobacteriummediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylas promoter / P-glucuronidase gene Plant Mo1 Biol, 22: 491-506 14 Cho MJ, Jiang W, Lemaux PG (1998) Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism Plant Sc 138: 229–244 15 Das US, Hadiuzzaman S., Sarker RH (2001) Somatic embryogenesis and regeneration of plantlet from immature embryos of maize (Zea mays L.) Plant Tissue Culture 11:65-75 16 Frame BR, Shou H, Chikwamba RK, Zhang Z, Xiang C, Fonger TM, Pegg SEK., Li B, Nettleton DS, Pei D, and Wang K (2002) Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of maize embryos using a standard binary vector system Plant Physiol, 129: 13–22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 48 17 Fromm, M.E et al Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants Biotechnology 8, 833–839 (1990) 18 Garcial MD, Molina MDC (1988) In vitro culture of immature embryos, Maize Newsletter 62: 75 – 76 19 Garcial MD, Molina M, Del C, Caso O (1991) In vitro culture of 0.15-0.25 mm immature embryos II 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4D) effects, Maize Newsletter 65: 77 – 78 20 Gorji AH, Zolnoori M, A Jamasbi, Zolnoori Z (2011) In vitro plant generation of tropical maize genotypes 2011 International Conference on Enviromental, Biomedical and Biotechnology IPCBEE vol.16 (2011) IACSIT Press, Singapore 21 Gutierrez-Campos R., Torres-Acosta J.A., Saucedo-Arias L.J., Gomez-Lim M.A., 1999 The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants Nat Biotechnol 17: 12231226 22 Huang XQ, Wei ZL (2004) High- Frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize (Zea Mays L.) Plant Cell Rep, 22(11): 793 - 800 23 Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens Nature Biotechnology, 14(6): 745–750 24 Ishida Y, Hiei Y & Komari T (2007) Agrobacteium-mediated transformation of maize Nature Protocol (7): 1614-1621 25 Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: 3901-3907 26 Kim HA, Utomo SD, Kwon SY, Min SR, Kim JS, Yoo HS, Choi PS (2009) The development of herbicide-resistant maize: stable AgrobacteriumSố hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 49 mediated ransformation of maize using explants of type II embryogenic calli, Plant Biotechnol Rep, 3(4): 277-283 27 Lampe L, Mills CO (1933) Growth and development of isolated endosperm and embryo of maize Abs Papers Bot Soc, Boston 28 Larue CD (1949) Cultures of the endosperm of maize Amer J Bot 36: 798 29 Li N, Zhang S, Zhao Y, Li B, Zhang J (2011) Over- expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize Planta, 233:241–250 30 Liu Y.J., Cheng C.S., Lai S.M., Hsu M.P., Chen C.S., Lyu P.C (2006), Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids, Proteins, 63(4): 777786 31 Lu C, Vasil V, Vasil IK (1983) Improved efficiency of somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue cultures of maize (Zea mays L.) Theor Appl Genet, 66: 285 - 289 32 Pelegrini P.B., Lay F.T., Murad A.M., Anderson M.A., Franco O.L., (2008), Novel insights on the mechanism of action o fα-amylase inhibitors from the plant defensin family, Proteins, 73: 719–29 33 Qiudeng Que, Sivamani Elumalai, Xianggan Li, Heng Zhong , Samson Nalapalli , Michael Schweiner, Xiaoyin Fei , Michael Nuccio, Timothy Kelliher, Weining Gu, Zhongying Chen, Mary-Dell M Chilton (2014), “Maize transformation technology development for commercial event generation”, Plant Science 08/2015 34 Raineri, D.M., Bottino, P., Gordon, M.P., Nester, E.W (1990) Agrobacterium- mediated transformation of rice (Oryza sativa) Biotechnol, 8: 33-38 35 Rhodes C, Heree DA, Metfler I, Mascareehas D, Detmer J (1988) Genetically transformed maize plants from protoplasts Science, 240:204-206 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 50 36 Shohael AM, Akanda MAL, Parves S, Mahfuja S, Alam MF, Islam R, Joarder N (2003) Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo derived callus of inbred maize (Zea mays L.) Biotechnol, 2(2): 154 - 161 37 Songstad D D, Armstrong C L, Petersen WL (1991) AgNO3 increases type II callus production from immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives Plant Cell Rep 9(12): 699-702 38 Takava S, Rahnama H, Rahimian H, Kazemitabar K (2010), Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.) Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 21(1): 21-29 39 Throne J.E., (1994), Life history of immature maize weevils (Coleoptera: Curculionidae) on corn stored at constant temperatures and relative humidities in the laboratory, Environmental Entomology, 23: 1459–1471 40 Vancanneyt G, Schmidt R, Connor-Sanchez AO, Willmitzer L, Sosa MR (1990), “Contruction of an intron-containing maker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agobacterium-mediated plants transformation” Mol Gene genet 220: 245250 41 Vain P, Yean H, Flament P (1989) Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L by AgN03 Plant Cell Tiss Org 18: 143-15 42 Vasil V, Vasil IK, LU C (1984) Somatic embryogenesis in longterm callus cultures of Zea mays L (Gramineae) Amer J Bot 71: 158-161 43 Vasil V, Vasil IK (1986) Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension cultures of Zea mays L Plant Physiol, 124: 399 - 408 44 Vasil, 2005 - Vasil IK (2005) Tissue cultures of maize, Maydica, 50: 361365 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com 51 45 Vega JM, Yu W, Kennon A.R, Chen X, Zhang ZJ (2008) Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays L.) using standard binary vectors Plant Cell Rep 27: 297-305 46 Wang AS (1987) Callus induction and plant regeneration from maize mature embryo Plant Cell Rep, 6: 360 - 362 47 Wang Z, Chen X, Wang J, Liu T, Liu Y, Zhao L, Wang G (2007) Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants Plant Cell Tiss Organ Cult 88: 83-92 48 Wang TT, Ji J, Wang G, Guan CF, Zhang L, Jin C (2012) Study on Agrobacterium-mediated Transformation of psy Gene into Shoot Meristem of Maize China Biol 32(8): 36-40 49 Walden, R (1988) Genetic Transformation in Plants, Open University Press pp.138 50 Wilson HM, Held BM (2002) Methods for tissue culturing and transformation elite inbreds of Zea mays L., Patent application Publication Pub No.: US 2002/0104131 Al.) 51 Zhang HW, Tan ZB, Chen G, Li JS (2004) Evaluation of elite inbred lines of Maize (Zea mays L.) group Tangsipingtou for in vitro culture and plant regeneration Maydica, 49: 273 – 278 Các trang web tham khảo 52 http://www.vietrade.gov.vn/ca-phe/5425-tiem-nang-xuat-nhap-khau-cayngo-nam-2015.html 53 http://www.chelatevietnam.com/vn/tt/dac-diem-sinh-hoc-cay-ngo_2327.aspx Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn download by : skknchat@gmail.com ... cho thấy hiệu chuyển gen hệ T0 đạt 0,023% 1.3.3 Chuyển gen gus ngô 1.3.3.1 Gen gus và nghiên cứu chuyển gen gus Gen β-glucuronidase (gus) phân lập từ chủng E Coli RA201 Gen gus gen mã hóa cho... [19] Năm 2002, Frame cs chuyển gen vào phôi non dịng ngơ Hi II [12] 1.3.2 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi ngô Kể từ đưa thi ̣trường sản phẩm ngô chuyển gen Bt vào năm 1990, ngô trở thành mục tiêu... nhận gen sự tái si nh in vitro Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đố i với phôi chuyển gen 50 mg/l 1.2 Chuyển thành công cấu trúc mang gen gus vào giống ngô LVN99 tạo ngô chuyển gen gus