Thời gian lây nhiễm vi khuẩn với tế bào thực vật có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả biểu hiện gen tạm thời và khả năng phục hồi của mẫu sau khi biến nạp. Nếu thời gian lây nhiễm quá dài sẽ dẫn đến sự sinh trưởng quá mức của vi khuẩn trong môi trường đồng nuôi cấy sau khi nuôi cấy sau khi lây nhiễm, làm hạn chế khả năng sống và tái sinh của mô thực vật sau khi chuyển gen. Tiến hành thử nghiệm các khoảng thời gian nhiễm khuẩn, kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A. tumerfaciens đến hiệu su ất
biểu hiện tạm thời gen gus vào phôi ngô non LVN99
Thời gian gây nhiễm khuẩn (phút) Số phôi lây nhiễm Số phôi nhuộm gus Số phôi biểu hiện gen gus
Hiệu suất biểu hiện tạm thời gen gus (%) 5 120 120 7 5,83 10 120 120 17 14,16 20 120 120 35 29,17 30 120 120 51 42,50 40 120 120 39 32,50
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, ở các khoảng thời gian nhiễm khuẩn khác nhau, kết quả biểu hiện tạm thời gen gus là khác nhau , hiệu quả biến nạp tăng
có xu hướng giảm. Thời gian gây nhiễm khuẩn 30 phút thu được hiệu suất biến nạp cao nhất (42,50%). Còn ở thời gian ngâm khuẩn 5 phút hiệu suất thấp nhất (5,83%), có thể do thời gian này chưa đủ để A. tumerfaciens C58 di chuyển vào trong phôi ngô. Thời gian nhiễm (thời gian ngâm phôi trong dịch huyền phù khuẩn) có ảnh hưởng rất lớn tới sự thành công của việc chuyển gen, đồng thời ảnh hưởng đến việc tạo mô se ̣o, tái sinh của cây. Nhâ ̣n đi ̣nh này cũng được đưa ra bởi Takava và cs (2010) [31] và kết quả nghiên c ứu của chúng tôi phù hợp với nhâ ̣n xét của Ishida và cs (2007) khi ngâm khuẩn 30 phút cho hiệu quả biến nạp tốt nhất [19].
3.1.4. Xác định tuổi phôi để làm vật liệu nhận gen
Để lựa chọn được nguồn nguyên liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi phôi ngô của giống ngô LVN99. Phôi ở các ngày tuổi khác nhau được nhiễm khuẩn A. tumefaciens CV58 chứa gen gus với mật độ OD660nm=0,8, trong thời gian 30 phút, bổ sung 150 µM acetosyringone.
Hình 3.1. Kích thước phôi sau (A) 8 ngày, (B) 10 ngày, (C) 12 ngày, (D) 14
Hình 3.2. Phôi sau 3 ngày đồng nuôi cấy. A: Phôi 12 ngày tuổi, B: Phôi 16 ngày
tuổi
Để kiểm tra biểu hiện của gus các phôi sau 3 ngày đồng nuôi cấy tiến
hành nhuộm phôi, còn các phôi để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo sau đồng nuôi cấy 3 ngày, được diệt khuẩn bằng cefotaxin 500 mg/l và chuyển sang môi trường tạo mô sẹo (môi trường A 2, không bổ sung kháng sinh ) kết quả đươ ̣c trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tuổi phôi đến hiê ̣u suất biểu hiện gen gus và tạo mô
sẹo của giống ngô LVN99
Tuổi phôi (Ngày)
Hiệu quả biến nạp gen gus Khả năng tạo mô sẹo Số phôi nhuộm gus Số phôi biểu hiện tạm thời gen gus Hiệu suất biểu hiện tạm thời gen gus (%) Số phôi nuôi trên môi trƣờng
tạo mô sẹo
Số phôi tạo mô sẹo Hiệu suất tạo mô sẹo (%) 8 120 71 59,17 120 28 23,33 10 120 68 56,67 120 51 42,50 12 120 53 44,17 120 67 55,83 14 120 32 26,67 120 73 60,83 16 120 21 17,50 120 89 74,16
Bảng 3.4 cho thấy, hiệu suất biến nạp gen ở ngô LVN99 giảm dần theo tuổi phôi, còn hiệu suất tạo mô sẹo la ̣i tăng dần theo tuổi phôi. Ở phôi 8 ngày tuổi hiệu suất biến nạp gen là cao nhất 59,17 % tuy nhiên hiệu quả tạo mô sẹo lại thấp nhất, đạt 23,33%. Còn ở 10 ngày tuổi hiệu suất biến nạp gen đạt 56,67%, hiệu suất tạo mô sẹo là 42,50%. Phôi 12 ngày tuổi hiệu suất biến nạp gen giảm còn 44,17%, nhưng hiệu quả tạo mô sẹo lại cao hơn đạt 55,83%. Đến tuổi phôi 16 ngày, hiệu quả biến nạp gen thấp hơn hẳn, chỉ còn 17,50%; tuy nhiên hiệu suất tạo mô sẹo lại cao nhất đạt 74,16%. Như vậy, để hiệu quả biến nạp gen, tạo mô sẹo cao ở giống ngô LVN99 lựa chọn phôi ngô ở 10 – 12 ngày tuổi với kí ch thước phôi tương ứng là 0,9 – 1,3 mm. Phôi non đã được sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô. Nhiều công trình đã công bố tuổi phôi ngô có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh [22], và kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với những nhận xét này .
Hình 3.3. Kết quả biểu hiện tạm thời gen gus khi nhuộm X-gluc.
A, B: Mẫu biến nạp biểu hiện hoạt động gen gus; C,D: Mẫu biến nạp không biểu hiện hoạt động gen gus