Quy trình chuyển gen thông qua A tumefaciens ở cây ngô

15 ngày (%) Đặc điểm của mô sẹo

3.3. Quy trình chuyển gen thông qua A tumefaciens ở cây ngô

Như vậy, một số yếu tố của quy trình chuyển gen vào giống ngô LVN99 thông qua A. tumefaciens đã được tối ưu bao gồm: Mật độ A. tumefaciens thích

hơ ̣p ở giá trị OD660nm= 0,8 và thời gian nhiễm khu ẩn tối ưu là 30 phút, bổ sung acetosyringone 150M và tuổi phôi từ 10 - 12 ngày tuổi, kích thước 0,9 - 1,3 mm tối ưu cho kh ả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh . Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối vớ i phôi bi ến nạp là 50 mg/l. Từ các kết quả trên , quy trình chuyển gen vào giống ngô LVN99 thông qua A. tumefaciens được đề xuất và trình bày ở sơ đồ hình 3.8, hình 3.9.

Có thể tóm t ắt quá trình chuyển gen gus và tái sinh cây ngô chuyển gen

như sau:

(i) Thu mẫu, tách phôi, nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Phôi ngô từ 10 – 12 ngày sau thụ phấn được thu hoạch, bóc bỏ 3 – 5 lớp vỏ ngoài bắp, ắt bỏ phần phía đầu râu ngô, khử trùng bề mặt bắp ngô bằng cồn 70%. Sau đó bắp sẽ được dùng để tách phôi. Phôi được tách trong điều kiện vô trùng. Đặt bắp ngô theo chiều dọc, dùng dao cắt một phần hạt ngô, ấn nhẹ để đẩy phôi tách ra khỏi hạt, phôi đạt kích thước 0,9 - 1,3 mm. Gây tổn thương bằng mũi dao hoặc kim nhọn.

Nuôi chủng A. tumerfaciens C58 chứa gen gus trên môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin (50 mg/l) và rifamicin (50 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 28oC, trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc mọc trên môi trường LB đặc và nuôi cấy trong LB lỏng với chế độ lắc 2.000 v/p ở 28oC trong 16 - 18 giờ.

Hình 3.8. Sơ đồ chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 thông qua A.

Lấy dung dịch nuôi lỏng lần 1 này (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi trong 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin. Ly tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2, loại bỏ dịch nổi rồi hòa tan cặn trong môi trường MS lỏng và pha loãng dịch với các mật độ tế bào vi khuẩn OD660nm 0,8.

Phôi ngô non được gây tổn thương, ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong 30 phút, bổ sung acetosyringone 100 M sau đó thấm khô, cấy trên môi trường đồng nuôi cấy A1 và phôi được nuôi trong tối 3 ngày.

(ii) Diệt khuẩn chọn lọc, tạo mô sẹo và chọn lọc mô sẹo biến nạp gen

Phôi sau khi gây nhiễm được rửa bằng dung dịch cefotaxin 500 mg/l. Thấm phôi vào giấy thấm và cấy trên môi trường A2: N6, 2 mg/l 2,4-D , 10 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 500 mg/l cefortaxin, 50 mg/l kanamycin.

Sau 1 tuần, chuyển phôi sang môi trường A3: N6, 3 mg/l 2,4-D ,20 mg/l AgNO3, 2,3 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 150 mg/l cefortaxin, 25 mg/l kanamycin.

Sau 1 tuần tiếp theo, cấy mô sẹo sang môi trường A4: N6, 2 mg/l 2,4D, 15 mg/l AgNO3, 1,15 g/l L-proline, 100 mg/l casein hydrolysate, 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose. Nuôi cấy trong tối để mô sẹo đạt kích thước lớn hơn.

(iii) Tái sinh chồi

Các mô sẹo sau khi xử lý và chọn lọc được đưa vào môi trường tái sinh là môi trường N6 có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP 2,0 mg/l; sucrose 60 g/l; 7,5 g/l agar; pH 5,8. Đặt trong điều kiện 280C, ánh sáng 8 giờ/ngày trong phòng nuôi cấy.

A B C DE F G H