15 ngày (%) Đặc điểm của mô sẹo
3.2. Kết quả chuyển gen gus vào giống ngô LVN
Từ các kết quả nghiên cứu tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen để xây dựng quy trình chuyển gen vào cây ngô ở trên, chúng tôi tiến hành biến nạp gen gus vào phôi ngô nhờ A. tumefaciens chủng C58/pGV2260 mang vector pCB-gusplus để đánh giá hiệu quả của quy trình chuyển gen vào giống ngô LVN99. Chúng tôi tiến hành 3 lô thí nghiệm với tổng số mẫu biến nạp là 900 mẫu, cùng với 30 mẫu đối chứng nuôi cấy trên môi trường không có kháng sinh chọn lọc, kết quả được trình bày ở bảng 3.7. Qua chọn lọc mô sẹo thu được 125 mẫu sống sót (đạt 13,89%). Lấy ngẫu nhiên các mô sẹo sống sót kiểm tra sự biểu hiện của gen gus ở mức độ mô sẹo. Kết quả nhuộm hóa mô tế bào
cho thấy hầu hết các mô sẹo sống sót đều có màu xanh chàm, chứng tỏ gen gus
Bảng 3.7. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen gus vào giống ngô LVN99 Lô thí nghiệm và đối chƣ́ng Số mẫu biến nạp Số mô sẹo sống sót Số chồi tái sinh, ra rễ Số cây tái sinh Số cây sống sót
Hiê ̣u suất biểu hiện tạm thời gen gus ở giai đoa ̣n in vitro (%) Đối chứng 30 30 26 23 16 Thí nghiệm 1 300 38 13 3 2 1,22% 2 300 43 15 6 4 3 300 44 18 7 5 Tổ ng 900 125 46 16 11 A B C D
Hình 3.5. Kết quả biểu hiện gen gus khi nhuộm X-gluc ở mô sẹo.
A, B, C: mẫu biến nạp biểu hiện hoạt động gen gus. D: mẫu không biến nạp
Chuyển các mô sẹo sống sót sang môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l thu được 46 mô sẹo. Tiếp theo, 46 mô sẹo này được chuyển sang môi trường tái sinh để đánh giá khả năng ra rễ, thu được 16 cây. Lấy các chồi non, lá, rễ của các cây này nhuộm X-Gluc, thu được 11 cây cho kết quả
dương tính, hiệu suất biến nạp gen gus ở giai đoạn tái sinh cây in vitro đạt
1,22%. Mẫu dương tính là mẫu có lá và rễ khi nhuộm X-Gluc có màu xanh chàm đặc trưng (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả biểu hiện gen gus khi nhuộm X-gluc (từ trái sang phải): thân,
chồi, lá, rễ.
A, B, C, D: mẫu chuyển gen biểu hiện hoạt động gen gus; E, F, G, H: mẫu không chuyển gen
Các cây chuyển gen (11 cây) sau khi có chiều cao khoảng 10 cm có lá xanh tốt được chuyển từ ống nghiê ̣m ra giá thể ở điều kiê ̣n nhà lưới. Sau 10 ngày thu được 3 cây sống sót và khi nhu ộm X-gluc đối với lá cây chuyển gen để đánh giá sự bi ểu hiện gen gus cho kết quả c ả 3 cây đều dương tính. Hiê ̣u suất chuyển gen đươ ̣c xác đi ̣nh ở giai đoa ̣n nhà lưới là 0,33% (Bảng 3.8, Hình 3.7).
Mẫu đối chứng có số mô sẹo trong môi trường không chọn lọc bằng kháng sinh đạt 100%. Số chồi phát triển mạnh, rễ sinh trưởng tốt là 26 (đạt 86,67%), số cây tái sinh thu được là 23 cây, khi đạt chiều cao 10 cm có lá xanh
tốt được đưa ra giá thể. Sau 10 ngày thu được 16 cây (đạt 53,33%). Cây chuyển gen có kích thước nhỏ và tốc độ sinh trưởng chậm hơn so với cây không chuyển gen (Hình 3.7).
Bảng 3.8. Số cây chuyển gen sống sót trên giá thể và hiê ̣u suất chuyển gen gus
Lô thí nghiệm và đối chứng Số mẫu biến nạp Số cây sống sót
Số cây sống sót trên giá thể
Hiê ̣u suất chuyển gen gus (%)
Thí nghiệm 900 11 3 0,33%
Đối chứng 30 16 11
Hình 3.7. Kết quả biểu hiện gen gus ở cây chuyển gen.
A: mẫu lá biểu hiện gen gus, B: cây chuyển gen, C: Cây đối chứng
Trong các nghiên cứ u trước , Takavar và cs (2010) thông báo hiê ̣u suất chuyển gen đạt tỉ lệ 1,74% ở dòng ngô S61 [28]. Hiệu quả chuyển gen nhờ A. tumefaciens trên ngô theo Nguyễn Văn Đồng và cs đạt 1,88% ở dòng H89,
1,53% ở dòng H98 [2]. Nghiên cứu của Phạm Thị Lý Thu và cs cho thấy kết quả chuyển gen vào dòng VH1 là 0,073% và dòng C8H9 đạt 0,06% [1]. Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, ở giai đoạn tạo cây chuyển gen
số 900 mẫu biến na ̣p có 11 cây trong ống nghiê ̣m dương tính với nhuô ̣m X -Gluc và hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn này đạt 1,22%. Tuy nhiên, khi chuyển ra giá thể ở điều kiê ̣n nhà lưới chỉ có 3 cây sống sót và có biểu h iê ̣n gen gus, hiệu suất chuyển gen ở giai đoa ̣n này đa ̣t 0,33%.