(Luận văn) nghiên cứu chuyển gen gmchi vào giống đậu tương đt51

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN lu an n va to p ie gh tn NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 d oa nl w va an lu ll u nf LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi m z at nh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN – 2018 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN lu an n va NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 p ie gh tn to w Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm : 42 01 14 d oa nl Mã số an lu ll u nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC m oi Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu z at nh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN – 2018 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết sử dụng luận văn trung thực đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Tác giả luận văn lu an va n Phạm Hải Yến p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt giúp thực nghiên cứu hoàn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone đậu tương bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 TS Hồng Phú Hiệp làm lu chủ nhiệm an Tơi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang va n toàn thể thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục tn to sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên p ie gh tạo điều kiện giúp tơi q trình nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động d oa nl w viên, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn lu ll u nf va an Tác giả luận văn oi m z at nh Phạm Hải Yến z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Trang Lời cam đoan………………………………………………………… i Lời cảm ơn…………………………………………………………… ii Mục lục……………………………………………………………… iii Danh mục bảng………………………………………………… iv lu Danh mục hình……………………………………………………… v Danh mục chữ viết tắt……………………………………………… vi an n va Mở đầu ……………………………………………………………… 1 tn to Đặt vấn đề …………………………………………………… p ie gh Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………… Nội dung nghiên cứu………………………………………… w Chương Tổng quan tài liệu……………………………………… oa nl d 1.1 Cây đậu tương…………………………………………………… an lu 1.1.1 Đặc điểm hình thái đậu tương……………………… u nf va 1.1.2 Vai trò đậu tương…………………………………… ll m oi 1.2 Isoflavone enzyme chìa khóa q trình sinh tổng hợp z at nh isoflavone ………………………………………………… 1.2.1 Isoflavone …………………………………………………… z @ 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone đậu tương…… l gm m co 1.2.3 Enzyme chalcone isomerase (CHI) gen GmCHI…… 10 an Lu 1.3 Chuyển gen đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13 n va ac th iii si 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen đậu tương 13 1.3.2 Nghiên cứu biểu gen CHI……… .…………………… 17 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 19 2.2 Hóa chất thiết bị……………………………………………… 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 21 lu an 21 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử………………………… 24 2.4 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận văn…………… 27 n va 2.3.1 Phương pháp tạo đậu tương chuyển gen………………… gh tn to Chương Kết thảo luận……………………………… 28 ie 3.1 Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 28 p nhờ A.tumefaciens……………………………………… w 3.1.1 Kết khử trùng hạt………………………………… oa nl 28 3.1.2 Kết tạo nguyên liệu biến nạp……………………………… d 29 an lu 3.1.3 Kết lây nhiễm tái sinh đậu tương ………………… u nf va 30 3.2 Phân tích có mặt gen chuyển GmCHI đậu tương ll 35 oi m chuyển gen hệ T0………………………………………………… z at nh 35 3.2.2.Kết phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI…………… 36 z 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số……………………………… @ 3.3 Thảo luận kết nghiên cứu…………………………………… l gm 38 m co Kết luận đề nghị………………………………………………… 42 Kết luận…………………………………………………………… an Lu 42 n va ac th iv si Đề nghị…………………………………………………………… 42 Cơng trình cơng bố liên quan đến luận văn………………………… 43 Tài liệu tham khảo…………………………………………… 44 Phụ lục 1……………………………………………………… 50 Phụ lục 2……………………………………………………… 51 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần đệm tách DNA tổng số 24 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide cặp mồi GmCHI-coI- 25 F/GmCHI-cmyc-SacI-R Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn GmCHI- 26 cmyc-KDEL………….…………………………………………… Bảng 2.4 Chu kì nhiệt phản ứng PCR……………………… 26 Bảng 3.1 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi lu an khuẩn A.tumefaciens qua nách mầm hạt chín………………… 34 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử isoflavone ………………………… Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa isoflavone ………………… 11 Hình 2.1 Giống đậu tương ĐT51………………………………… 19 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc vector chuyển gen pCB301_GmCHI vi khuẩn A.tumefaciens…………… 20 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua lu an nách mầm……………………………………………… 23 Hình 3.1 Khử trùng hạt khí clo bình thủy tinh kín 29 n va tn to Hình 3.2 Hình ảnh hạt đậu tương hạt nảy mầm giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp……………………………… 30 gh p ie Hình 3.3 Hình ảnh đậu tương giai đoạn gây tổn thương nách mầm biến nạp………………………………………… 31 nl w d oa Hình 3.4 Hình ảnh đậu tương chuyển gen giai đoạn tạo chồi kéo dài chồi……………………………………… an lu 32 u nf va Hình 3.5 Hình ảnh đậu tương chuyển gen giai đoạn rễ trồng đậu tương chuyển gen giá thể ……… 33 ll m oi Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách z at nh từ đậu tương chuyển gen không chuyển gen 36 z @ gm Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại l đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ đậu tương chuyển gen m co không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI- an Lu cmyc- SacI-R……………………………………… 37 n va ac th v si DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT GmCHI Glycine max chalcone isomerase CHI Chalcone isomerse PCR Polymerase Chain Reaction A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng áp suất cao) lu an n va Estrogens receptor (thụ thể estrogens) CHR Chalcone reductase CHS Chalcone synthease gh tn to ER IFS Isoflavones synthease p ie Phenylalanine amoni-lyase va Gibberillic acid ll u nf Indole-3-acetic acid oi m Deoxynucleotide triphosphate z at nh DNTPs 6-Benzylaminopurine an IAA lu GA3 Complementary deoxyribonucleotide acid d BAP oa cDNA Deoxyribonucleotide acid nl DNA w PAL z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si lu Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen an n va GmCHI-cmyc-KDEL từ đậu tương chuyển gen không chuyển từ vector pCB301- GmCHI; (-): Kết PCR từ không chuyển gen; 1, 2, gh tn to gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc- SacI-R (+): Sản phẩm PCR p ie 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Kết PCR từ đậu tương chuyển gen T0; M; thang oa nl w DNA kb d Sản phẩm điện di hình 3.7 cho thấy, đậu tương chuyển an lu gen T0 phân tích thu cho kết PCR nhân đoạn va u nf GmCHI-cmyc-KDEL từ hệ gen có kích thước khoảng 0,7kb Hiệu chuyển ll gen giai đoạn T0 đạt 3,56% (8/225) Như vậy, hệ T0 tạo oi m z at nh đậu tương chuyển gen GmCHI Gen GmCHI nội có kích thước 657 bp [2], [24], cấu trúc GmCHI- z cmyc-KDEL có kích thước 702 bp khuếch đại PCR với cặp mồi @ l gm GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-SacI-R thu đoạn DNA có kích thước khoảng 700 bp (Hình 3.8) Như bước đầu nhận xét gen m co chuyển GmCHI xâm nhập vào hệ gen đậu tương chuyển gen Tuy an Lu nhiên, gen chuyển GmCHI có hợp vào hệ gen có biểu thành n va ac th 37 si protein tái tổ hợp đậu tương chuyển gen hay khơng cần phải tiếp tục phân tích Southern blot Western blot 3.3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Có nhiều phương pháp để thực chuyển gen ngoại lai mong muốn vào thực vật, bao gồm hai phương pháp chuyển gen trực tiếp chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp phổ biến súng bắn gen, sốc điện, sốc nhiệt, cịn chuyển gen gián tiếp thơng qua vi sinh vật trung gian Tuy nhiên phương pháp chuyển gen trực tiếp yêu cầu phải có lu an thiết bị, hóa chất đại, kỹ thuật cao phí cho phương pháp n va cao, ngược lại chuyển gen gián tiếp qua vi sinh vật lại dễ dàng thực hiện, tn to khơng địi hỏi q nhiều chi phí Chuyển gen gián tiếp chủ yếu thông qua gh hai loại vi khuẩn Agobacterium tumefaciens Agrobacterium zhirogens p ie hai lồi có khả xâm nhiễm qua viết thương hầu hết lồi thực w vật hai mầm Trong vi khuẩn A.tumefaciens sử dụng rộng rãi oa nl phương pháp dễ thực hiện, tốn hiệu quả, thuận lợi d cho phân tích chuyển gen khơng gây tổn thương tế bào an lu va Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người ta thường sử dụng số u nf loại promoter 35S, act, mas, Trong 35S promoter mạnh ll phân lập từ virus gây bệnh khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - m oi CaMV) Trong nghiên cứu chúng tôi, vùng promoter CaMV35S đưa z at nh vào cấu trúc vector chuyển gen pCB301 chứa gen chuyển GmCHI (Hình 2.2) z Promoter CaMV35S lựa chọn nhằm hướng đến việc khởi động hoạt @ gm động phiên mã gen GmCHI để tăng cường sinh tổng hợp enzyme CHI l mục đích nâng cao hiệu suất tổng hợp isoflavone đậu tương Một số m co thành phần khác cấu trúc làm thị cho chọn lọc trình biến an Lu nạp tái sinh chuyển gen Trong cấu trúc chuyển gen, gen nptII mã hóa cho protein kháng kanamycin, tín hiệu hiệu cho chọn lọc chuyển n va ac th 38 si gen; đoạn nucleotide mã hóa cho kháng nguyên c-myc sử dụng cho kỹ thuật Western blot ELISA Hai kỹ thuật nói dựa nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu ngưng kết kháng thể với kháng nguyên protein đính kèm với protein ngoại lai Việc gắn đuôi c-myc lựa chọn tốt phù hợp tính hiệu quả, phổ biến kinh tế cho nhiều nghiên cứu [10] Trong năm gần đây, nước ta có số cơng trình cơng bố chuyển gen vào đậu tương, nghiên cứu Trần Thị Cúc Hòa (2007), Nguyễn Thị Thúy Hường cs (2009, 2011), Nguyễn Thu Hiền cs lu (2012), Lò Thị Mai Thu cs (2014), Lò Thanh Sơn cs (2015), Đào Xuân an va Tân (2017) Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào đậu tương n nhờ A.tumefacies lây nhiễm qua nách mầm Trong nghiên cứu chuyển gen gh tn to chúng tôi, sử dụng mầm đậu tương làm vật liệu nhận gen cho p ie thấy, mầm gây tổn thương vùng nách thuận lợi cho việc xâm nhiễm w A.tumefaciens tái tổ hợp, điều khẳng định nghiên cứu Lò oa nl Thị Mai Thu (2014) d Kết thí nghiệm chuyển gen Nguyễn Thúy Hường (2011) vào lu va an giống đậu tương DT84 thu 28 sống sót 1262 mẫu biến nạp u nf (2,2%) [5]; còng nghiên cứu Nguyễn Thu Hiền (2011) chuyển gen vào ll giống đậu tương ĐT12 thu 32 chuyển gen từ 650 mẫu biến nạp m oi (4,9%) [7] Lò Thị Mai Thu (2014) tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào hai z at nh giống đậu tương thu 16 sống sót từ 370 mẫu giống ĐT12 (4,3%) 32 sống sót từ 850 mẫu giống DT2008 (3,7%) [4] Nghiên z gm @ cứu Lò Thanh Sơn (2015) biến nạp cấu trúc mang gen GmEXP1 vào l giống đậu tương DT84 thu sống sót từ 380 mảnh mầm (2,3%) m co [3] Trong nghiên cứu chúng tôi, chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI an Lu vào giống đậu tương ĐT51 thu chuyển gen sống sót 225 mẫu ba lần biến nạp, chiếm tỷ lệ 4,0% Như tỷ lệ chuyển gen sống n va ac th 39 si sót hệ T0 nằm khoảng từ 2,0% đến 5% Về hiệu suất chuyển gen T0, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 đạt hiệu suất 0,24% [6], Hiệu suất chuyển gen nghiên cứu Nguyễn Thu Hiền (2011) 1,23% [7], Lò Thị Mai Thu 1,35% 2,24% [4], Lò Thanh Sơn 1,23% [3] Trong nghiên cứu mình, chúng tơi tiến hành biến nạp 225, số đem trồng giá thể 28 có đậu tương chuyển gen phát triển bình thường nhà lưới Gen chuyển GmCHI có mặt hệ gen đậu tương chuyển gen lu hệ T0 xác nhận kết phân tích PCR Hiệu suất an chuyển gen đạt 3,56% va n Trong chuyển gen đậu tương, ngồi khó khăn chung đối gh tn to với chuyển gen thực vật cịn gặp số khó khăn khác như: hàm lượng p ie protein tế bào mô lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh khơng mong muốn, hạt giống khó bảo quản nhanh khả nảy mầm; hạt đậu oa nl w tương chứa nhiều protein lipid nên tái sinh mẫu biến nạp khó khăn, d điều kiện khí hậu thời tiết nguyên nhân làm cho an lu mẫu tái sinh bị nhiễm khuẩn Khó khăn mùa vụ sinh thái làm giảm khả u nf va tái sinh, sinh trưởng phát triển sinh sản bình thường biến đổi gen Để khắc phục khó khăn riêng nói cần tính tốn, khảo sát ll oi m nồng độ chủng loại kháng sinh phù hợp với giống cho vừa bảo z at nh đảm mẫu tái sinh không bị nhiễm khuẩn nấm lại vừa bảo đảm khả tái sinh tế bào mô tiếp nhận Đặc điểm mùa vụ sinh thái yếu z tố di truyền giống xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó có @ l gm thể thay đổi, lựa chọn giải pháp tính tốn thời gian biến nạp tái sinh cho trùng khớp với thời gian sinh thái giống tốt Nhìn chung, m co đậu tương, nghiên cứu tái sinh chuyển gen trồng an Lu vào vụ xuân hay xuân hè thích hợp cho hiệu tạo chuyển gen có n va ac th 40 si tỷ lệ sống cao Ngoài sử dụng buồng sinh trưởng để chủ động điều tiết nhiệt độ thời gian chiếu sáng giải pháp kỹ thuật chấp nhận Hiệu suất biến nạp gen thấp khó khăn cho việc chọn lọc chuyển gen, nghiên cứu tìm biện pháp làm tăng hệ số tái sinh đa chồi, tăng tỷ lệ sống sót chuyển gen đồng thời số lượng mẫu biến nạp phải lớn Chính nghiên cứu điều kiện tối ưu cho tái sinh chuyển gen đậu tương vấn đề tiếp tục quan tâm nghiên cứu lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 41 si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã chuyển thành công gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 nhờ A.tumafaciens qua nách mầm 1.2 Trong 225 mẫu biến nạp có 141 mẫu phát sinh chồi tạo 354 chồi Kết chọn lọc kháng sinh thu 196 chồi sống sót mơi trường SEM có 159 chồi sống sót rễ môi trường RM Số lu đem trồng giá thể 28 có đậu tương chuyển gen phát triển bình an thường nhà lưới va n 1.3 Gen chuyển GmCHI có mặt hệ gen đậu tương chuyển gen gh tn to hệ T0 xác nhận kết phân tích PCR Hiệu suất p ie chuyển gen giai đoạn thí nghiệm đạt 3,56% w Đề nghị oa nl Cần tiếp tục nghiên cứu để phân tích biểu gen chuyển d GmCHI hệ T1, T2, nhằm tạo dịng đậu tương chuyển gen có lu ll u nf va an hàm lượng isoflavone cao làm vật liệu chọn giống oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 42 si CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm Hải Yến, Lê Thị Hồng Trang, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân, Chu Hoàng Mậu (2017), “Chuyển gen mã hóa chalcone isomerase vào giống đậu tương ĐT51 thơng qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 171(11), tr.135 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 43 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Xuân Tân (2016), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn đậu tương (Glycine max L Merrill), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đặc điểm gen GmCHI phân lập từ số giống đậu tương khác hàm lượng isoflavone”, lu an Tạp chí Sinh học 38(2), tr 236-242 va n Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên gh tn to quan đến phát triển rễ đậu tương (Glycine max (L.) p ie Merrill, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên w Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus oa nl phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo d đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học va an lu Thái Nguyên u nf Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS ll liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt m oi Nam, Luận án tiến sỹ Sinh học, Đại học Thái Nguyên z at nh Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu z Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, (2009), “Phát triển hệ thống tái @ gm sinh invitro đậu tương (Glycine max L Merrill) phục vụ chuyển gen”, m co l Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr 82-88 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2011), an Lu “Nghiên cứu khả tái sinh và biến nạp gen qua nách mầm hai n va ac th 44 si giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 và DT84 bằng Agrobacteriun”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(38), tr.1035-1310 Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 18:11-16 Trần Văn Điền, (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nông nghiệp Tiếng Anh lu an 10 Ahn J., Lee K J., Ko K (2014), “Optimization of ELISA conditions to va n quantify colorectal cancer antigen-antibody complex protein (GA733- to Immunother., 33(1), pp - ie gh tn FcK) expressed in transgenic plant", Monoclon Antib Immunodiagn p 11 Barros R.P., Gustafsson J.A (2011), “Estrogen receptors and the nl w metabolic network”, Cell Metab, pp.289–299 d oa 12 Cheng H, Li L, Cheng S, Cao F, Wang Y, Yuan H (2011), “Molecular an lu cloning ang function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) from u nf va Ginkgo biloba”, Plant Cell Report, 30(1), pp.49-62 13 Conklin C.M., Bechberger J.F., MacFabe D., Guthrie N., Kurowska ll oi m E.M., Naus C.C (2007), “Genistein and quercetin increase connexin43 z at nh and suppress growth of breast cancer cells”, Carcinogenesis, pp.93–100 14 Dastmalchi M, Dhaubhadel S (2015), “Soybean chalcone isomerase: z BD, Williams biosynthesis and R, Gijzen m co “Isoflavonoid S, McGarvey l 15 Dhaubhadel gm the gene family”, Planta, pp.507 @ evolution of the fold, and the differential expression and localization of M (2003), accumulation in an Lu developing soybean seeds”, Plant Molecular Biology, pp.733 n va ac th 45 si 16 Gutierrez-Gonzalez JJ, Guttikonda SK, Tran LS, Aldrich Dl, Zhong R, Yu O, Nguyen HT, Sleper DA (2010), “Differential expresstion of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant Cell Physiol, pp.936-948 17 Hany El-Shemy (2011), “Soybean and health”, Agricultural and biological sciences, pp.1 18 Huilan Chen, Philippe Seguin, Annie Archambault, Lea Constan, and Suha Jabaji (2009), “Gene expression and isoflavone concentrations in lu soybean sprouts treated with chitosan”, Crop Science, pp.224–236 an 19 Hussain RM, Ali M, Feng X, Li X (2017), “The essence of NAC gene va n family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max L to gh tn Merr.) cultivars”, BMC Plant Biology, 17(1), pp.55 p ie 20 Jie Yu, Xiaojuan Bi, Bing Yu, and Daiwen Chen, (2016), “Isoflavones: Anti-inflammatory benefit and possible caveats”, Nutrient, pp.361 nl w 21 Jin-Ho Kang, John McRoberts, Feng Shi, Javier E Moreno, A Daniel d oa Jones, Gregg A Howe (2014), “The flavonoid biosynthetic enzyme an lu chalcone isomerase modulates terpenoid production in glandular u nf va trichomes of tomato”, Plant Physiology, Vol.164, No.3, pp.1161-1174 22 Juan J Gutierrez-Gonzalez,Satish K Guttikonda, Lam-Son Phan ll Aldrich, Rui Zhong, Oliver oi L m Tran,Donavan Yu, Henry T z at nh Nguyen, David A Sleper (2010), “Differential expression of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant and Cells z gm @ Physiology, pp.1 23 Kuiper G.G., Lemmen J.G., Carlsson B., Corton J.C., Safe S.H., van der l m co Saag P.T., van der Burg B., Gustafsson J.-A.K (1998), “Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor an Lu β”, Endocrinology, pp.4252–4263 n va ac th 46 si 24 Le T H T., Ho T M., Hoang H P., Le S V and Chu M H (2016), Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar ĐT51 GenBank: LT594995.1 25 Lyle R., Senthil S., Michiyo M., “Partial Oliver Y., (2005), Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast Using Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases”, Plant Physiol, 137(4), pp 1375–1388 26 M Chen, W.J Zhu, X You, Y.D Liu, G.M Kaleri, Q Yang (2015), lu “Isolation and characterization of a chalcone isomerase gene promoter an n va from potato cultivars”, Genetics and Molecular Resaerch, pp.18873 tn to 27 Marugame T., Katanoda K (2006), “International comparisons of cumulative risk of breast and prostate cancer, from cancer incidence in p ie gh five continents vol”, Viii Jpn J Clin Oncol, pp.399–400 w 28 Medjakovic S., Mueller M., Jungbauer A., (2010), “Potential health- oa nl modulating effects of isoflavones and metabolites via activation of ppar d and ahr”, Nutrients, pp.241–279 lu va an 29 Mehran Dastmalchi, Sangeeta Dhaubhadel (2015), “Soybean chalcone isomerase: evolution of the fold, and the differential expression and u nf ll localization of the gene family”, Planta, Vol 241, Is 2, pp 507-523 m oi 30 Messina M (2014), “Soy foods, isoflavones, and the health of 31 Nguyen HT, Quach z at nh postmenopausal women”, Am J Clin Nutr, pp.423–430 TN, Tran LS, Valliyodan B, , Kumar z gm @ R, Neelakandan AK, Guttikonda SK, Sharp RE (2014), “Functional l analysis of water stress-responsive soybean GmNAC003 and GmNAC004 m co transcription factors in lateral root development in arabidopsis”, PLoS One 9(1) an Lu n va ac th 47 si 32 Olhoft, P.M., D.A Somer Agrobacteriummediated – T “L-Cystein (2001), DNA delivery increases into soybean cotyledonarynode cells”, Plant Cell Report, 20, pp.706-711 33 Phetnoo N., Werawatganon D., Siriviriyakul P (2013), “Genistein could have a therapeutic potential for gastrointestinal diseases”, Thai J Gastroenterol, pp.120–125 34 Qu J, Liu SY, Wang PW, Guan SY, Fan YG, Yao D, Zhang L, Dai JL (2016), “Agrobacterium-mediated transformation of the β-subunit gene in 7S globulin protein in soybean using RNAi technology”, Genetics lu an Molecular Research, 15(2) n va 35 Verdrengh M., Jonsson I.M., Holmdahl R., Tarkowski A (2003), gh tn to “Genistein as an anti-inflammatory agent”, Inflamm Res Off J Eur Histamine Res So, pp.341–346 p ie 36 Vitale D.C., Piazza C., Melilli B., Drago F., Salomone S (2013), “Isoflavones: activity, biological effect and w Estrogenic oa nl bioavailability”, Eur J Drug Metab Pharmacokinet, pp.15–25 d 37 Wang L, Liu X, Meng X, Wu G, Xu F (2018), “Cloning and expression lu an analysis of a chalcone isomerase (CnCHI) gene from Chamaemelum u nf va nobile”, Biotechology, 17(1), pp.19-25 38 Wang RK, Zhan SF, Zhao TJ, Zhou XL, Wang CE (2015), “Positive ll sites in tertiary structure of Leguminosae chalcone oi m selection z at nh isomerase 1”, Genetics and Molecular Reasearch, pp.1 39 Wang W, Wang L, Wan B, Zhang P, Zhan C, Huang D (2012), “Chalcone z isomerase in grape vine: gene expression and localization in the @ gm developing fruit”, Biologia Plantarum, 56(3), pp.545-550 m co l 40 Wenbo Giang, Qinggang Yin, Ranran Wu, Guangshun Zheng, Jinyue Liu, Richard A Dixon, Yongzhen Pang (2015), “Role of a chalcone an Lu isomerase-like protein in flavonoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana”, Journal of Experimental Botany, pp.7165-7179 n va ac th 48 si 41 Yang WJ, Wu YM, Tang YX (2009), “Expressing and functional analysis of GmMYBJ6 from soybean”, Yi Chuan, 31(6) 42 Yu O, Shi J, Hession AO, Maxwell CA, McGonigle B, Odell JT (2003), “Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed”, Plant Physiology, pp.1 43 Yue Zhang, Han Xia, Mei Yuan, Chuanzhi Zhao, Aiqin Li, Xingjun Wang, (2011), “Cloning and expression analysis of peanut (Arachis hypogaea L.) CHI gene”, Electronic Journal of Biotechnology, pp.0717-3458 lu Một số trang web an n va 44 http://ajcn.nutrition.org/content/83/5/1118.long tn to 45 http://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone gh 46 http://eol.org/pages/641527/overview p ie 47 http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/37895_dau-nanh-phuong- thuoc-quy-gia.aspx w oa nl 48 http://www.agi.gov.vn/files/files/HNKH2017/3_%20Bao%20cao%20dau d %20tuong%20(N_V_Dong)%20%5BCompatibility%20Mode%5D%20t va an lu hu.pdf u nf 49 http://www.ducquanam.com/SuuTam/chuabenh_daunanh.htm ll 50 http://www.isoflavone.info/what-are-isoflavone.php oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 49 si PHỤ LỤC Thành phần môi trường tái sinh đậu tương Môi Thành phần trường Nảy mầm Muối B5(3,052 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,8 + (GM) vitamin B5 (1 mg/l).0 Đồng nuôi Muối B5 (0,316 g/l ) + MES (3,9 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 cấy (CCM) g/l), pH = 5,4 Bổ sung box vitamin B5 (1 mg/l) + lu acetosyringon (0,2 mM) + L-cystatin (400 mg/l) + sodium an n va thiosulfate (200 mg/l) + DTT (154 mg/l) + GA3 (0,25 mg/l) + tn to BAP (2,5 mg/l) -Môi trường SIM lần 1: Muối B5 (2,0 g/l ) + MES (0,6 g/l) + tạo chồi đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,6 Bổ sung box p ie gh Cảm ứng (SIM) vitamin B5 (1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + cefotaxim 400 mg/l + d oa nl w kanarmycin 50 mg/l an lu - Môi trường SIM lần 2: Muối B5 (3,052 g/l ) + MES (0,59 g/l) va + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), PH = 5,6 Bổ sung vitamin B5 ll u nf (1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + 400 mg/l + kanarmycin 75 mg/l MS (4,3 g/l) + MES (0,6 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), oi m Kéo dài z at nh chồi (SEM) pH = 5,6 Bổ sung box vitamin B5 + L-asparagine + Lpyron glutamic acid + IAA (0,1 mg/l)+ GA3 (0,5 mg/l) + z gm @ cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), (RM) pH = 5,6 Bổ sung IAA (0,5 mg/l)+ vitamin B5 (1 mg/l) + m co l Tạo rễ an Lu cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l n va ac th 50 si PHỤ LỤC Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pcB301 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 51 si