Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian sử dụng collagenase tới sự phân tách mạch mô đệm svf và sự sống của tế bào gốc trung mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trần Thu Hằng NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN SỬ DỤNG COLLAGENASE TỚI SỰ PHÂN TÁCH MẠCH MÔ ĐỆM SVF VÀ SỰ SỐNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trần Thu Hằng NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN SỬ DỤNG COLLAGENASE TỚI SỰ PHÂN TÁCH MẠCH MÔ ĐỆM SVF VÀ SỰ SỐNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm trước phát luật Tác giả luận văn Trần Thu Hằng ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trung Nam - ngƣời thầy tận tâm, nhiệt tình bảo, hƣớng dẫn nhƣ động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Cơng trình đƣợc thực với hỗ trợ kinh phí từ hợp phần “ Nghiên cứu xây dựng số quy trình sản xuất lƣu giữ tế bào gốc trung mô định hƣớng ứng dụng”, mã số TĐTBG0.02/21-23, chủ nhiệm hợp phần TS.Trần Trung Thành thuộc dự án, “Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học tăng sinh dịng tế bào gốc nhằm định hƣớng ứng dụng điều trị ung thƣ” chủ nhiệm dự án TS.Nguyễn Trung Nam từ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị trung tâm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc liệu pháp gen (STEMREC), Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành luận án thạc sĩ Em xin cảm ơn bác sĩ CK2 Trần Trung Kiên GS Nguyễn Duy Ánh bệnh viện phụ sản Hà Nội cung cấp mẫu nghiên cứu để em thực luận văn thạc sĩ Em xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, phòng chức Học viện khoa học Công nghệ thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam dạy dỗ bảo tận tình trình em học tập Cuối cùng, em xin đƣợc gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất ngƣời thân u ln động viên, khích lệ, quan tâm giúp đỡ em q trình học tập để hoàn thành luận văn này! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TẾ BÀO GỐC 1.1.1 Khái niệm tế bào gốc 1.1.2 Phân loại tế bào gốc 1.2 TỔNG QUAN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 1.2.1 Tế bào gốc trung mô 1.2.2 Nguồn phân lập tế bào gốc trung mô 1.2.3 Đặc điểm tế bào gốc trung mô 1.2.4 Phân đoạn mạch mô đệm (Stromal Vascular Fraction Cells - SVF) 1.2.5 Tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ mô mỡ 1.2.6 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 11 1.2.7 Các phƣơng pháp phân lập SVF từ mô mỡ 12 1.2.8 Phân tách tế bào gốc trung mô 12 1.2.9 Collagenase 14 1.2.10 Phân loại collagenase 15 1.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH 16 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Hóa chất, dụng cụ vật tƣ tiêu hao 17 2.1.2 Thiết bị sử dụng 17 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phân lập SVF từ mô mỡ phƣơng pháp xử lý collagenase 17 2.2.2 Nuôi cấy tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ mơ mỡ 19 2.2.3 Đánh giá hình thái tế bào ASC 19 2.2.4 Đánh giá tỷ lệ sống/chết tế bào ASC 19 iv 2.2.5 Đánh giá biểu marker bề mặt tế bào ASC 20 2.2.6 Đánh giá khả biệt hóa ASC 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 PHÂN LẬP SVF TỪ MÔ MỠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP Ủ COLLAGENASE 22 3.2 NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ MỠ 24 3.2.1 Nuôi cấy tế bào sơ cấp 24 3.2.2 Nuôi cấy thứ cấp 28 3.3 TỶ LỆ SỐNG CHẾT Ở GIAI ĐOẠN NUÔI CẤY BAN ĐẦU 28 3.4 PHÂN TÍCH DÕNG CHẢY TẾ BÀO 31 3.5 BIỆT HÓA CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 34 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASC Adipose Derived Stem cells (Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ) COPD Chronic obstructive pulmonary disease (Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính) DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s - Medium (Mơi trƣờng nuôi cấy cải tiến Dulbecco) ECM Extra cellular matrix (Chất ngoại bào) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết bào thai bò HSC Hematopoietic stem cells (Tế bào gốc tạo máu) iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc tiềm cảm ứng) ISCT International Society for Cellular Therapy (Hiệp hội Quốc tế Liệu pháp Tế bào) MSC Mesenchymal Stem Cell (Tế bào gốc trung mô) SVF Stromal Vascular Fraction Cells (Phân đoạn mạch mô đệm) vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Khả biệt hóa tế bào gốc trung mô Hình 1.2 Phân đoạn mạch mơ đệm SVF Hình 1.3 Q trình biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 11 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập SVF từ mô mỡ 18 Hình 3.1 Q trình phân lập SVF từ mơ mỡ 23 Hình 3.2 Mô mỡ sau xử lý collagenase đƣợc ly tâm 24 Hình 3.3 Hình thái tế bào sau 24 phân lập từ mơ mỡ (xử lý collagenase) 25 Hình 3.4 Hình ảnh ngày 2, 16 sau nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc trung mô từ mơ mỡ khơng xử lý collagenase độ phóng đại 40X 25 Hình 3.5 Hình ảnh ngày 2,3,7,10 16 sau nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đƣợc phân giải collagenase thời gian 30 phút, 60 phút, 180 phút 360 phút độ phóng đại 40X 27 Hình 3.6 Nuôi cấy thứ cấp tế bào gốc trung mô từ mơ mỡ độ phóng đại 100X 28 Hình 3.7 Hình ảnh biểu đồ số lƣợng tế bào ASC giai đoạn đầu 29 Hình 3.8 Biểu đồ phần trăm sống tế bào ASC với mẫu không xử lý phân tách (-), mẫu xử lý phân giải tế bào collagenase thời gian 30, 60, 180, 360 phút Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần *p