Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở xuân mai, chương mỹ hà nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP oo0oo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP T ỂN ỌN NG N Ứ T Ố ỦNG Ạ N Ả N NG N ẤT NG N ỐNG NẤ G ỆN TRÊN CÂY KEO N Ậ ĐƢ Ở XUÂN MAI ƢƠNG Ỹ - HÀ N I NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Thị Minh Hằng Sinh viên thực : Bùi Văn Tuấn Mã sinh viên : 1453071774 Lớp : K59B – CNSH Khóa học : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC NH MỤ HIỆU H VI T TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ HƢỢNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan keo 1.1.1 Tình hình trồng keo lai Việt Nam 1.1.2 Các bệnh nấm hại gây keo lai 1.2 Giới thiệu xạ khuẩn 1.2.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.2.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 1.3 Phƣơng pháp ph n loại xạ khuẩn 11 1.3.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống .11 1.3.2 Phân loại theo phƣơng pháp đại .13 1.4 Đại cƣơng chất kháng sinh 13 1.4.1 Chất kháng sinh (Antibiotic) 13 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh .14 1.4.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 15 1.4.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 16 1.5 Ứng dụng chất kháng sinh 17 1.5.1 Ứng dụng y học .17 1.5.2 Ứng dụng bảo vệ thực vật chăn nuôi thú y 18 1.6 Khả tổng hợp enzyme vi sinh vật 20 1.6.1 Ƣu vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme 20 1.6.2 Tuyển chọn chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên 21 1.6.3 Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật 22 hƣơng NGUYÊN IỆU - MỤC TIÊU – NỘI UNG PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu 23 2.1.1 Mấu đất .23 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 23 2.2 Mục tiêu nghiên cứu .24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .25 2.4.1 Phƣơng pháp ph n lập nấm bệnh .25 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ đất 25 2.4.3 Phƣơng pháp khiết bảo quản giống 27 2.4.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27 2.4.5 Phƣơng pháp lên men thu sinh khối tế bào xạ khuẩn 28 2.4.6 Xác định hoạt tính enzyme xạ khuẩn phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 29 2.4.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 29 hƣơng T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập xạ khuẩn 30 3.1.1 Phân lập xạ khuẩn 30 3.1.2 Phân bố xạ khuẩn theo nhóm màu 31 3.1.3 khiết lƣu trữ giống XK phân lập đƣợc .33 3.2 Phân lập, khiết lƣu trữ giống nấm gây bệnh keo lai 33 3.2.1 Phân lập nấm gây bệnh .33 3.2.2 Thuần khiết bảo quản chủng giống 34 3.3 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh 35 3.3.1 Tuyển chọn sơ ban đầu phƣơng pháp thỏi thạch .35 3.3.2 Tuyển chọn chủng XK có HTKS cao .37 3.5 Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào chủng XK tuyển chọn 41 3.5.1 Xác định hoạt tính loại enzyme ngoại bào 41 3.6 Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cao 42 3.6.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc chủng XK tuyển chọn 42 3.6.2 Quan sát đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử số chủng xạ khuẩn dƣới k nh hiển vi .43 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nƣớc nằm khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm lƣợng mƣa lớn, nhiệt độ độ ẩm không cao điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển có nhiều loại vi sịnh vật có hại gây ảnh hƣởng tới đời sống ngƣời đặc biệt với q trình sản xuất nơng nghiệp Có nhiều vi sinh vật gây bệnh cho động vật, thực vật theo ghi nhận hàng năm g y thiệt hại lớn cho ngành sản xuất nông – lâm – ngƣ nghiệp Để giảm thiểu nguy hại vi sinh vật gây bệnh sử dụng lƣợng lớn chất bảo vệ thực vật hóa học đem lại hiệu nhanh tức thời xong hệ lụy để lại khơng nhỏ Các chất độc hóa học khó tan, lắng đọng, gây nhiễm nguồn nƣớc không kh đất ảnh hƣởng xấu tới sống ngƣời sinh vật Chính Hội nghị tƣ vấn khu vực h u Thái Bình ƣơng F O năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học tảng trƣơng trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phá hoại vi sinh vật gây bệnh Một hƣớng giải tối ƣu đƣa sử dụng chủng vi sinh vật có khả sinh chất kháng sinh, chống lại vi sinh vật gây bệnh Xạ khuẩn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh đƣợc quan t m hàng đầu, khả sinh chất kháng sinh với hàm lƣợng lớn đa dạng hoạt tính cao Trong tổng số chất kháng sinh đƣợc ghi nhận sinh từ vi sinh vật có tới 80% xạ khuẩn, số có kháng sinh có khả kháng nấm gây bệnh Keo lai tên gọi viết tắt giống lai tự nhiên hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) keo tràm (Acacia auriculiformis) Giống lai đƣợc Messrs Hepbum Shim phát năm 1972 hàng trồng ven đƣờng Năm 1978 xem xét mẫu tiêu phòng tiêu thực vật Queensland ( ustralia) Pedkey xác nhận giống lai tự nhiên keo tai tƣợng keo tràm Trong tự nhiên keo lai đƣợc phát Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988)[27], eo lai đƣợc nghiên cứu nhân giống thành công hom (Griffin, 1991) Năm 1996 diện tích trồng Keo lai khoảng 15.000ha đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai 127.000ha đến ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha Nhƣng bên cạnh hàng năm nấm g y bệnh c y keo lai g y hậu nặng nề ảnh hƣởng lớn tới suất nhƣ chất lƣợng sản phẩm c y giống, việc sử dụng thuốc hóa học BVTT gây ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời, vật ni mơi trƣờng sống Vì việc sử dụng chế phẩm sinh học từ VSV cần thiết việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật x y dựng nơng nghiệp an tồn bền vững Xuất phát từ tình hình thực tiễn theo xu hƣớng công nghệ sinh học giới nhƣ để góp phần khai thác nguồn lợi VSV phong phú khu vực Xuân Mai tiến hành thực đề tài : “Tu n họn v n hiên u sinh h n nấ ts h n hu n ệnh o Chươn Mỹ - Hà N i" h năn sinh hất hán i ph n p Xuân Mai - Ƣ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan keo 1.1.1 Tình hình trồng keo lai t i Việt Nam Keo lai tên gọi viết tắt giống lai tự nhiên hai loài keo tai tƣợng (Acacia mangium) keo tràm (Acacia auriculiformis) Giống lai đƣợc Messrs Hepbum Shim phát năm 1972 hàng trồng ven đƣờng Năm 1978 xem xét mẫu tiêu phòng tiêu thực vật Queensland ( ustralia) Pedkey xác nhận giống lai tự nhiên keo tai tƣợng keo tràm Trong tự nhiên keo lai đƣợc phát Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988) [27] Hiện keo lai đƣợc trồng nhiều quốc gia giới : Australia, Papua new Guinea va Indonexia , Malaixia, Philippin phù hợp với nhiều ñiều kiện sinh thái, phát triển nhanh, trồng dễ sống, chu kỳ cho sinh khối lớn loài keo khác chất lƣợng gỗ đẹp Sinh trƣởng sản lƣợng: Qua số liệu khảo nghiệm trồng rừng thực tế sinh trƣởng c y keo lai sinh trƣởng nhanh cho sinh khối lớn nhiều so với loài keo bố mẹ giống keo lai khác Những giống qua chọn lọc khảo nghiệm đạt suất 18 25 m3/ha/năm tỉnh miền Bắc, 30 - 40m3/ha/năm tỉnh Đơng Nam Bộ [27] Keo lai có khả cố định đạm khả cải tạo đất cao eo tai tƣợng Keo tràm, phù hợp với điều kiện đất trống đồi núi trọc nƣớc ta, gỗ keo lai làm nguyên liệu giấy ván dăm sử dụng xây dựng đóng đồ mộc… tăng thu nhập đáng kể cho ngƣời trồng rừng Vì eo lai nhóm có diện tích trồng rừng lớn nƣớc ta năm gần đ y Năm 1996 diện tích trồng Keo lai khoảng 15.000ha đến hết năm 2004 diện tích trồng c y eo lai 127.000ha đến ƣớc tính diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha 1.1.2 Các bệnh nấm h i gây keo lai Các bệnh nấm hại gây keo lai gồm loại bệnh tiêu biểu ệnh phấn trắng keo o nấm Oidium sp g y Nấm bệnh mọc bề mặt non chồi non để hút dinh dƣỡng làm cho xoăn lại màu n u vàng khô chết nhƣng không rụng Bệnh bắt đầu phát sinh vào tháng 11 nặng tháng - Trong điều kiện th ch nghi thời tiết m u bệnh dễ l y lan thành dịch Sợi nấm qua đơng đốm vàng già để năm sau x m nhiễm ệnh thán thƣ (đốm than) o nấm Colletotrichum gloeosporioi g y Bệnh phát sinh g y hại chủ yếu đầu mép úc đầu màu lan rộng dần vào phiến vết bệnh làm khô đến nửa Vết bệnh màu n u xám n u đen bề mặt vết bệnh có đốm chấm đen nhỏ lúc trời ẩm thấy nhiều màu hồng Trên cành non vết bệnh lõm xuống chung quanh có viền đen vết bệnh có chấm đen nhỏ Bệnh g y hại c y keo vƣờn ƣơm rừng trồng làm c y sinh trƣởng chậm Bệnh phát triển mạnh vào tháng - tháng giảm dần ệnh đen thân o nấm Macrophomina phaseolina Tassi g y Ban đầu gốc biến thành màu n u màu xanh bệnh phát triển dần lên làm khô héo rũ xuống phần vỏ th n co ngót tầng vỏ thối đen xốp dạng bột Trong mọc nhiều hạch nấm màu đen Nấm bệnh x m nhiễm vào phần gỗ phần tủy gỗ biến thành màu n u đen lan dần đến phần rễ c y nhổ c y lên lại phần gỗ Trong mùa nắng nóng nhiệt độ mặt đất lên cao phần gốc c y bị tổn thƣơng tạo điều kiện cho bệnh x m nhập g y hại Ở khu vực t ch tụ nhiều nƣớc tỷ lệ c y bệnh tăng lên rõ rệt Sau thời tiết mƣa phùn 10 - 15 ngày bệnh bắt đầu phát sinh Về sau tăng dần đến tháng 10 Nặng tháng ệnh nấm hồng o nấm Corticium salmonicolor Berk & Br g y vùng có lƣợng mƣa cao Bệnh thƣờng xuất vào đầu mùa mƣa dấu hiệu mắt thƣờng dễ dàng nhận thấy có đám màu trắng xuất bề mặt vỏ th n c y hay cành c y ph a bị che bóng thƣờng vị tr từ 1/5 đến 1/4 chiều cao c y t nh từ Đến cuối mùa mƣa lớp màu hồng da cam nhạt dần màu trở nên màu trắng bẩn vỏ c y bị nứt để lộ phần gỗ sợi nấm x m nhiễm vào th n cành c y nhƣ toàn của c y từ chỗ bị nấm x m nhiễm lên đến bị héo chết có màu n u khơng rụng Đỉnh c y bị chết đổ gẫy từ chỗ gốc c y mọc chồi Trƣờng hợp nặng toàn c y bị chết 1.2 Giới thiệu xạ khuẩn 1.2.1 Vị trí phân lo i phân b x khu n tự nhiên Theo hệ thống phân loại nay, xạ khuẩn thuộc Tenericutes (gồm vi khuẩn gram dƣơng xạ khuần, thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) siêu giới nh n sơ (prokaryota) [35] Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ 110 chi 1000 lồi có 478 lồi thuộc chi Streptomyces 500 lồi thuộc chi cịn lại đƣợc xếp vào nhóm XK [12,43] Streptomyces đặc biệt nhiều đất nơi chúng phân hủy hoại sinh nhiều hợp chất hữu enzyme ngoại bào Một phần lớn chất kháng sinh đƣợc sử dụng hiệu điều trị có nguồn gốc từ lồi Streptomyces, đƣợc biết đến streptomycin, erythromycin, tetracyclin [41] Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật đa dạng đa số sinh trƣởng hiếu khí tạo khuẩn ty ph n nhánh tƣơng tự nhƣ nấm Tên xạ khuẩn – actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) “mykes” (nấm) ban đầu xạ khuẩn đƣợc coi vi nấm chúng sinh trƣởng giống với nấm Mạng lƣới phân nhánh thể sợi thƣờng phát triển bề mặt chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên (tạo thành hệ sợi chất) [28] Đ y đặc điểm để phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn VK G(+) có tỷ lệ G+ cao (>55%) N Đa số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh phân bố rộng rãi đất nƣớc xác thực vật Xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng mặt sinh thái vịng tuần hồn tự nhiên Chúng phân hủy sử dụng chất hữu khó ph n hủy nhƣ humic acid đất [43] Nhiều chủng xạ khuẩn có khả hịa tan lignhin cách sinh enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose peoxidase ngoại bào [34] Các chủng xạ khuẩn xuất môi trƣờng giàu chất hữu nhƣ compost hai pha ơn hịa (mesophilic) chịu nhiệt (thermophilic) [40], cống rãnh nƣớc thải nơi mà xạ khuẩn chứa mycolic acid kết hợp với việc tạo thành bọt khí váng bọt ổn định đặc trƣng [38] Nhìn chung, nhiệt độ ơn hịa 25 - 30º pH trung t nh điều kiện tối ƣu cho xạ khuẩn phát triển Mặc dầu vậy, nhiều lồi đƣợc phân lập mơi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ Nam cực sống nhiệt độ 0ºC [28] Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5 - 10 [31] 3.3.2 Tuy n chọn ch ng XK có HTKS cao Trong trình khảo sát tuyển chọn ban đầu, tơi nhận thấy có chủng XK cho hoạt t nh kháng sinh tƣơng đối mạnh rõ rệt với chủng nấm gây bệnh có chủng màu trắng sữa, chủng màu xám trắng Hoạt tính mạnh với chủng nấm gây bệnh có ký hiệu LPT1,LPT3 chủng nấm cịn lại LPT2 có hoạt t nh nhƣng yếu Vì tơi định tuyển chọn chủng XK ký hiệu lần lƣợt là: Đ 12 Đ để tiến hành thí nghiệm Kết kiểm tra khả đối kháng chủng XK với chủng nấm gây bệnh đƣợc trình bày Bảng 3.5 B ng 3.5 HTKS h n XK tu n họn ằn phươn pháp thỏi th h Chủng nấm Hoạt tính kháng sinh K = (D – d) (mm) LPT1 LPT2 LPT3 Đ 12 17,3 ±0,21 6,5 ±0,18 12,5±0,18 Đ 15,6 ±0,17 5,5 ±0,27 11,3±0,17 Chủng XK Bảng số liệu cho thấy HTKS chủng X đƣợc tuyển chọn tƣơng đối mạnh Ở điều kiện môi trƣờng thạch đĩa, với chủng nấm có ký hiệu LPT1 chủng ĐV12 cho HTKS cao (17,3mm), tiếp X Đ 9(15 6mm) cịn chủng nấm bệnh có ký hiệu LPT2 hầu hết chủng XK tuyển chọn cho HTKS thấp, Đối với chủng nấm bệnh LPT3 hai chủng XK cho HT S tƣơng đối cao với chủng X ĐV12 cho HT S (12 5mm) chủng X Đ (11 3mm) Bƣớc tiếp theo, tiến hành lên men chủng X môi trƣờng dịch thể GI lỏng khoảng thời gian nuôi lắc khác nhau, sau 4, 7, 10 14 ngày Sau tiến hành kiểm tra HTKS dịch lên men phƣơng pháp đục lỗ thạch Kết đƣợc thể bảng 3.6 37 B n 3.6 HTKS h n XK nuôi ấ ôi trư n GI ỏn ho n th i i n há nh u Hoạt tính kháng sinh K = (D - d) (mm) Đ 12 Chủng nấm Đ 10 14 10 14 LPT1 17,8 ±0,21 21,5 ±0,33 13,4 ±0,18 9,3 ±0,29 18,8 ±0,16 20,7 ±0,34 13,8 ±0,15 13,8 ±0,15 LPT2 10,6 ±0,31 15,8 ±0,20 7,5 ±0,12 6,7 ±0,24 9,4 ±0,12 16,3 ±0,29 11,6 ±0,13 LPT3 19,9 ±0,19 22,7 ±0,16 15,3 ±0,17 13,9 ±0,30 17,7±0,28 19,8 ±0,15 14,8 ±0,11 12,5 ±0,34 38 4,4 ±0,26 HTKS lên men dịch thể môi trƣờng GI lỏng chủng XK tuyển chọn đƣợc thể qua biểu đồ Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.6 HTKS h n hu n XKĐV12 ên h n nấ ệnh Hình 3.7 HTKS h n hu n XKĐK9 ên h n nấ ệnh Kết hợp bảng số liệu Bảng 3.5 Bảng 3.6 cho thấy HTKS chủng X đƣợc tuyển chọn không thay đổi chuyển từ môi trƣờng thạch đĩa sang môi trƣờng dịch thể Mặt khác, bảng số liệu 3.6 cho thấy khả ức chế nấm gây bệnh chủng XK tuyển chọn cịn tăng lên đƣợc ni mơi trƣờng dịch thể điều lần cho thấy ảnh hƣởng rõ rệt yếu tố điều kiện môi trƣờng lên khả sinh S chủng XK đƣợc tuyển chọn Điều đƣợc lý giải điều kiện nuôi lắc 39 tế bào sinh trƣởng tốt tiếp xúc với mơi trƣờng dinh dƣỡng đồng độ thơng thống khí tốt nên khả sinh hoạt chất sinh học tốt môi trƣờng nuôi tĩnh (đĩa thạch) Dựa vào bảng số liệu nhƣ biểu đồ, nhận thấy khoảng thời gian ngày thứ q trình ni lắc hầu hết chủng XK tuyển chọn cho HTKS mạnh nhất, sau khoảng thời gian HT S giảm dần.Tiến hành đồng thời phƣơng pháp sử dụng thỏi thạch phƣơng pháp nhỏ dịch lên men chủng XK tuyển chọn để kiểm tra HTKS với chủng nấm gây bệnh LPT1, LPT2 LPT3, kết thu đƣợc đƣợc thể qua Hình 3.8 ` Hình 3.8 HTKS h n XK hán nấ (A) kháng nấn LPT1 (B) Kháng nấm LPT3 (C) kháng nấm LPT2 40 h i ấ o i 3.5 Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào chủng XK tuyển chọn 3.5.1 Xá ịnh ho t tính c a lo i enzyme ngo i bào Trong trình sinh trƣởng, enzyme đƣợc hình thành tế bào số đƣợc tiết môi trƣờng xung quanh Trong trình sản xuất enzyme từ xạ khuẩn chủ yếu thu nhận enzyme ngoại bào Khơng phải tất VSV có khả sinh enzyme nhƣ chủng lồi khơng có hoạt t nh nhƣ Vì vậy, tuyển chọn chủng giống phải tiến hành phân lập, kiểm tra lựa chọn chủng có hoạt tính enzyme mạnh, sinh nhiều enzyme mong muốn theo mục đ ch Để tuyển chọn chủng có hoạt tính enzyme cao trƣớc hết tơi tiến hành kiểm tra sơ hoạt tính enzyme chủng XK tuyển chọn với loại mơi trƣờng có bổ sung loại chất là: Tinh bột, CMC (carboxymethyl celluloza) asein tƣơng ứng với loại enzyme ngoại bào là: amylase, cellulase protease Hai chủng X đƣợc nuôi lắc môi trƣờng dịch thể GI mơi trƣờng lên men thích hợp cho XK Sau - ngày thu dịch lên men tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme phƣơng pháp đục lỗ thạch Kết xác định hoạt tính enzyme chủng X đƣợc thể qua Bảng 3.7 B n 3.7 Ho t tính nz e a h n XK Hoạt tính enzyme H = (D – d,mm) Chủng XK Amylase CMC-ase Protease Đ 12 11,5 ±0,31 17,2 ±0,14 6,3 ±0,28 Đ 10,1 ±0,27 16,6 ±0,24 5,8 ±0,25 Dựa vào kết Bảng 3.7 cho thấy chủng XK tuyển chọn có hoạt tính enzyme đồng ổn định, hoạt tính enzyme amylase mức trung bình enzym proteaza có hoạt tính thấp riêng hoạt tính cellulaza mức cao Điều hoàn toàn phù hợp với số nghiên cứu trƣớc 41 đ y hoạt tính enzyme đa số XK Do sống chủ yếu đất thảm thực vật mục nát, thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng cung cấp chủ yếu hợp chất cao phân tử cellulose khó phân giải nên hoạt tính enzyme cellulaza cao giúp cho XK phân giải hợp chất cellulose phức tạp thành loại đƣờng đơn đƣờng đa dễ phân giải nhằm cung cấp chất dinh dƣỡng để sinh trƣởng phát triển Hình 3.9 Ho t tính nz e dị h ên n h n XK tu n họn 3.6 Nghiên cứu đ c điểm h nh thái chủng khuẩn có hoạt tính enzyme cao 3.6.1 Qu n sát ặ i m khu n l c c a ch ng XK n chọn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc giúp đánh giá sơ phân loại XK theo nhóm màu dựa vào yếu tố màu sắc khuẩn lạc, cấu trúc bề mặt, viền, mép, chất 42 tiết k ch thƣớc… ác chủng đƣợc nuôi môi trƣờng thạch đĩa GI ngày t0 = 300C Quan sát ghi nhận hình thái khuẩn lạc mọc mơi trƣờng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng X đƣợc thể qua Bảng 3.7 B n 3.8 Đặ ChủngXK XKĐV12 X Đ i Màu sắc HSKS Màu xám hình thái hu n h n XK tu n họn Đ c điểm hình thái khuẩn lạc Kích Tiết thƣớc Mép Bề m t sắc Hình ảnh (mm) tố Hình dạng Khuẩn lạc dính liền 0,5 - Tạo viền dày Lồi, thành dày xám Lồi, Trịn đều, bơng Màu khuẩn lạc 0,5 - 2,5 Sợi xốp, có trắng dính liền tia giọt tiết ngà nhỏ bề mặt - - Chú thích (-): khơng tiết sắc tố 3.6.2 Qu n sát ặ i hình thái v u n sinh o tử ts h n hu n ính hi n vi Đặc điểm hình thái tính chất ni cấy thông tin quan trọng để phân loại X Để làm cho chủng XK cần định loại biểu đầy đủ đặc điểm ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng môi trƣờng dinh dƣỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh ghi lại đặc điểm hình thái nuôi cấy X đặc biệt quan mang bào tử, hình dạng bề mặt bào tử Theo Pridham cộng (1995), cuống sinh bào tử chia thành nhóm: - RF cho cuống sinh bào tử thẳng lƣợn sóng 43 - RA cho cuống sinh bào tử xoắn thô sơ ngắn - S cho cuống sinh bào tử phát triển mạnh xoắn ác chủng X tinh đƣợc nuôi cấy môi trƣờng GI đƣợc tiến hành quan sát sau - ngày nuôi cấy ết đƣợc thể Bảng 3.8 B n 3.9: Kết qu qu n sát u n sinh o tử v hình d n h n XK tu n họn (dưới KHV trư n hủng uống inh bào tử o tử v t ính X40) ạng bào tử X ĐV12 Bầu dục X Đ Trịn Từ kết trình bày Bảng 3.9 hình ảnh tƣơng ứng cho thấy: cuống sinh bào tử chủng X tƣơng đối đa dạng thể hiện: chủng X ĐV12 cuống sinh bào tử dài xoắn đơn giản, có bảo tử hình bầu dục xoắn chủng X Đ cuống sinh bào tử ngắn, có dạng hình xoắn đơn giản bào tử có hình trịn 44 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ K T LUẬN - Từ mẫu đất thu thập ph n lập khiết đƣợc 27 chủng X Tỷ lệ chủng X theo nhóm màu nhƣ sau: màu trắng 44,44% màu xám 25,92% màu vàng 3,70% màu xanh 40% màu n u 11,11% màu hồng 7,40% - Phân lập khiết đƣợc chủng nấm g y bệnh điển hình c y chè ý hiệu chủng: LPT1, LPT2, LPT3, - Trong tổng số 27 chủng X ph n lập đƣợc có tới 13 chủng XK cho HTKS với chủng nấm gây bệnh chiểm tới 48,13% tổng số chủng phân lập đƣợc - Tuyển chọn đƣợc chủng XK có HTKS mạnh với chủng nấm gây bệnh LPT1, LPT3 hoạt tính enzyme ngoại bào cao Ký hiệu chủng: X ĐV12 X Đ KI N NGHỊ o thời gian tiến hành TN cịn hạn chế nên tơi chƣa thực đƣợc số nội dung nghiên cứu chuyên s u chủng xạ khuẩn Nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu thời gian cho phép thực công việc nghiên nhƣ: - Định danh đến tên loài cho chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn từ khu vực Xu n Mai kỹ thuật sinh học ph n tử - Nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho khả sinh phƣơng pháp đại việc tinh S áp dụng S chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn - Thực kỹ thuật sinh hóa để xác định chất kháng sinh xạ khuẩn sinh có khả ức chế nấm vi khuẩn - hảo sát HT S chủng xạ khuẩn tuyển chọn lên đối tƣợng VSV g y bệnh thực vật khác - Tiến hành thử nghiệm khả đối kháng chủng xạ khuẩn tuyển chọn lên nấm g y bệnh c y keo lai thực tế 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TI NG VIỆT Ngơ Đình B nh Vi sinh vật học công nghiệp, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, tr 53-71, 2005 Nguyễn Văn ách Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học kĩ thuật, tr.17, 2004 Nguyễn Văn ách ê Văn Nhƣơng Cơ sở công nghệ sinh học, tập - công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, 2009 Nguyễn Hoàng Chiến, Nghiên cứu chủng xạ khuẩn streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội, 2000 Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bà o trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, 2000 Vi Thị Đoan h nh Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 - TN07 02 Nguyễn n ũng Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội 1993 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 1972 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 11 Nguyễn n ũng Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty Vi sinh vật học, NXB Giáo dục 2007 n 12 Nguyễn ũng Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietscience, 2006 13 Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập NXB Đại học sƣ phạm, 2007 14 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac, Tính biến dị bề mặt bào tử xạ khuẩn sinh choromomycin , Act.A buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974 15 ƣơng Thị Hƣơng Giang (2011) Tuyển chọn nghiên cứu hoạt t nh sinh học củ số chủng xạ khuẩn phân ập i Pháo – ại T – Thái 16 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 17 Đỗ Thu Hà ghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân ập t đất Quảng m– ẵng luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội 2004 18 Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu t nh đối kháng xạ khuẩn với số VSV gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009 19 ê Mai Hƣơng, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993 20 Lê Gia Hy, Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, NXB Giáo dục Việt Nam, 2010 21 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 22 Nguyễn hang Kháng sinh học ứng dụng NXB Y học Hà Nội 2005 23 Phan Quốc inh Cơng nghiệp hó chất, Thơng tin Kinh tế & Công nghệ, số 2004 24 Phan Quốc Kinh, Vài nét tình hình sản xuất hó dược giới, Tạp chí cơng nghiệp hóa chất, số 4, 2002 25 Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục, 2007 26 Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Vi Thị Đoan h nh Ngơ Đình B nh Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng vi khuẩn Xanthomonasoryzae gây bệnh bạc lúa “Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc ” 2009 27 ê Đình hả, Hà Huy Thịnh cơng tác viên, 2005 Giống keo lai triển vọng gây trồng H N NN&PTNT 20 năm đổi – Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn B TÀI LIỆU TI NG ANH 28 Ashutosh K, Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd, pp 89 – 101, 2008 29 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp 301- 305, 2008 30 Fred C Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J Med, 119, pp 3–10, 2006 31 Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkaliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbiol, 54, pp 247-252, 2004 32 J.H Auh, H.Y Chae, Y.R.Kim, K.H.Shim, S.H Yoo, K.H Park, Modification of Rice Starch by Seclective Degradation of Amylose Using Alkalophilic Bacillus Cyclomaltodextrinase, J Agric, Food Chem, 2006 33 MA Elberson, F Malekzadeh, M.T Yazdi, N Kameranpour, M.R Noori – Daloii, M.H Matte, M Shahamat, R.R Colwell, K.R Sower, Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose – degrading bacteria isolated from forest soils, J Syst Evol Microbiol 50, p.993, 2000 34 Pasti M B., Pometto A P., Nuti M P., Crawford D L., Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp 2213-2218, 1990 35 Ramasamy Vijaykumar, Thajuddin, nnamalai Chinnasamy Muthukumar, Panneerselvam, and Nooruddin Rengasamy Saravanamuthu, Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Strait region of Bay of Begal, India, Actinomycetologica, 2007 36 R Gupta, O.K Beg, P Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol 59 (1) ,p 15, 2002 37 Saga T., Yamaguchi K, History of antimicrobial agents and resistant bacteria, J Japan Med Assoc, 137, pp 513 – 517, 2008 38 Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge foam, J Microbiol, 37, pp 66-72, 1999 39 Shirling E.B., D Gottlieb, Methods for characterization of streptomyces species Vol 16 No International Journal of Systematic Bacteriology 40 Steger K, PhD Thesis: Composition of microbial communities in composts A tool to assess process development and quality of the final product Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006 41 Stuart H, Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp 191 – 369, 2005 42 Waksman, S.A, The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 1961 43 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H ,Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007 44 Geschva, A Shurk and W Romer (1979), Phosphate inhibition of secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal by cyclic AMP, Arch Microbiol.121, p 91 - 96 45 Adhikari T B (1993), Identification of biovars and races of Pseudomonas solanacearum and source of resistance in tomato in Nepa, Plant disease, vol 77, p 905 - 907 46 Agrios, G N (1997), Plant Pathology, 4th Edition Academic Press San Diego, USA TÀI LIỆU INTERNET 47 http://agro.gov.vn/news/chitiet_nghiencuu.aspx?id=54 48 http://vi.wikipedia.org/wiki/Kh%C3%A1ng_sinh 49 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm CÔNG THỨC CÁC LOẠ Ô TRƢỜNG SỬ DỤNG Công thức môi trƣờng Gause I hất àm lƣợng Tinh bột 20 g/l MgSO4.7H2O g/l K2HPO4 g/l KNO3 g/l KCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,1 g/l Agar 20 g/l ôi trƣờng PDA Khoai tây 200 g/l Đƣờng glucozo 20 g/l agar 20 g/l T mơi trƣờng thử hoạt tính enzym Agar 17 g/l chất: tinh bột, CMC, casein (Carboxymethyl cellulozo), Casein 1g/l