Nghien cuu ki thuat co dinh vi khuan streptococcus thermophi rwpxp 20140521020248 15188

MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chất mang cellulose vi khuẩn (BC) 1.1.1 Khái quát chung BC 1.1.2 Nguyên liệu sản xuất BC 10 1.2 Giới thiệu vi khuẩn ST LB 13 1.2.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus 13 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus 14 1.3 Các phương pháp bảo quản vi sinh vật 15 1.3.1 Phương pháp cấy chuyền bảo quản lạnh 15 1.3.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 16 1.4 Tình hình nghiên cứu cố định vi khuẩn chất mang BC nước 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu .20 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 20 2.1.2 Dụng cụ thiết bị thường dùng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu .21 2.2.1 Phương pháp cố định vi khuẩn ST LT chất mang BC phương pháp bẫy – hấp phụ 21 2.2.2 Phương pháp vi sinh .21 2.2.3 Phương pháp hóa sinh 25 2.2.4 Phương pháp phân tích hóa học 26 2.2.5 Phương pháp bảo quản vi khuẩn cố định chất mang BC 26 2.3 Phương pháp công nghệ 27 2.3.1 Lên men sữa chua 27 2.3.2 Lên men tạo cellulose .27 2.4 Phương pháp bảo quản vi khuẩn cố định chất mang BC 28 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 3.1 Kết phân lập ST LT từ sữa chua vinamilk 30 3.2 Khảo sát sinh trưởng phát triển vi khuẩn ST LT phương pháp đo mật độ quang (OD) máy quang phổ UV – Vis .32 3.3 Kết thu nhận BC .34 3.3.1 Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy 34 3.3.2 Xử lý BC .36 3.4 Cố định ST LT chất mang BC 36 3.4.1 Ngâm BC 36 3.4.2 Khảo sát nhiệt độ ủ thời gian ủ 37 3.4.3 Kiểm tra hiệu trình cố định giá thể BC 40 3.5 Xác định hiệu cố định vi khuẩn lactic chất mang BC sau thời gian bảo quản 42 3.5.1 Xác định khả sống sót vi khuẩn lactic cố định chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản .42 3.5.2 Xác định hoạt lực vi khuẩn lactic cố định chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản 43 3.6 Đánh giá phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic chất mang BC so với số phương pháp khác 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy dủ BC Bacterial cellulose ST Streptococcus thermophillus LB Lactobacillus bulgaricus AX Acetobacter xylinum DANH MỤC BẢNG STT Số hiệu 1.1 3.1 Tên Bảng Cấu trúc BC số lồi vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn LB ST Trang 31 DANH MỤC HÌNH STT Số Tên hình hiệu Cấu trúc cellulose (a) vi khuẩn (BC) ( 20000 lần) Trang 1.1 1.2 Sơ đồ đường tổng hợp cellulose AX 1.3 Màng BC ướt gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy 10 1.4 Cấu tạo AX bao bọc cellulose 11 1.5 Quy trình sản xuất thạch dừa 12 1.6 Trà túi lọc lipton 13 1.7 Đường saccharose 13 1.8 Streptococcus thermophillus 14 1.9 Lactobaccillus bulgaricus 14 10 1.10 Đông khô vi khuẩn 16 11 1.11 Bảo quản lạnh 16 12 2.1 Sơ đồ phân lập hai chủng vi khuẩn ST LB 24 13 2.2 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sữa chua 28 14 3.1 16 3.2 Khuẩn lạc vi khuẩn ST (1) LB (2) khiết 31 17 3.3 Hình ảnh ống giống chủng ST 32 18 3.4 Hình ảnh ống giống chủng LB 32 19 3.5 20 3.6 Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy 35 21 3.7 Khối lượng BC tạo thành mốc thời gian 35 22 3.8 BC sau sấy 36 23 3.9 BC trước ngâm (1) sau ngâm dịch vi khuẩn (2) 37 24 3.10 Chế phẩm vi khuẩn lactic BC 38 (b) thực vật (PC) ( 200 lần) Khuẩn lạc hỗn hợp hai vi khuẩn ST LB từ sữa chua vinamilk Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng chủng LB ST 72 30 33 Khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất 25 3.11 26 3.12 Khuẩn lạc chế phẩm ST (1) LB (2) sau hoạt hóa 40 27 3.13 Khả sinh acid lactic mẫu mẫu Đồ thị biểu diễn khả sống sót của vi khuẩn lactic 41 28 3.14 chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản là 43 mang BC 39 tháng và 2,5 tháng 29 3.15 Khả sinh acid lactic chế phẩm vi khuẩn lactic qua mốc thời gian bảo quản 44 LỜI MỞ ĐẦU Hiện kĩ thuật cố định tế bào đề cập quan tâm nhiều, đặc biệt trình bảo quản, lưu thơng, cung cấp giống cho lĩnh vực lên men tạo sản phẩm thực phẩm Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với tế bào tự do: Tiện lợi việc bảo quản, lưu thơng giúp giảm chi phí giai đoạn chuẩn bị giống Theo khảo sát chất mang thường dùng để cố định tế bào vi sinh vật: Aliganate, gelatin, xơ dừa, vỏ bưởi, táo, lê… Tuy nhiên chất mang truyền thống bền giá thành đắt, việc tìm kiếm chất mang có ưu cần thiết Cellulose vi khuẩn hội đủ điều kiện chất mang cố định tế bào: Giá thành rẻ, độ tinh khiết cao, có khả hút nước giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, bổ sung trực tiếp vào sản phẩm thực phẩm mà không xảy phản ứng phụ nào, bên cạnh cịn tốt cho hệ tiêu hóa mang chất cellulose giống thạch dừa…nên chọn làm chất mang đề tài Hiện nhà máy sản xuất sữa chua người ta bảo quản giống phương pháp bảo quản lạnh, nhân giống cấy chuyền hoạt hóa nhiều lần Tuy nhiên chi phí cho việc bảo quản lạnh cấy chuyền tốn kém, bên canh tiến hành hoạt hóa cấy chuyền nhiều lần làm giảm hoạt lực vi khuẩn lactic sau – hệ Vì nhà sản xuất phải tiến hành mua ống giống tinh khiết từ nhà cung cấp giống, chi phí cho việc mua ống giống tốn chi phí cao Vì thế, việc cố định hai chủng vi khuẩn ST LB giá thể BC điều cần thiết Chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC mang lại nhiều thuận lợi: Điều kiện bảo quản dễ dàng, lưu thông, cung cấp giống thuận tiện, chủ động việc sử dụng giống, đặc biệt chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC hệ thứ Từ thực tiễn yêu cầu em tiến hành đề tài “Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” với mong muốn mang lại nhiều thuận lợi việc bảo quản, lưu thông, cung cấp giống, giải vấn đề nan giải cung cấp bảo quản giống cho nhà máy sản xuất sữa chua lĩnh vực khác cần đến chế phẩm Trong phạm vi đề tài em tiến hành nghiên cứu điều kiện tối ưu để cố định chủng vi khuẩn ST LB chất mang BC khảo sát thời gian bảo quản, hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC sau cố định mốc thời gian trình bảo quản Sinh viên thực Lê Thị Bốn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chất mang cellulose vi khuẩn (BC) 1.1.1 Khái quát chung BC 1.1.1.1 Một số vi khuẩn sinh tổng hợp BC BC tổng hợp số vi khuẩn (bảng 1.1) (Theo Jonas Farah, 1998) Con đường tổng hợp chế điều hòa tổng hợp BC lồi có kẽ giống nhau, cấu trúc BC lồi khác (Ross cộng sự, 1991; Jonas Farah,1998) Có điểm khác biệt đáng kể thuộc tính vật lý sản phẩm celluose, chủ yếu chiều dài chuỗi glucan (được đặc trưng mức độ polymer hóa), tính kết tinh trạng thái tính chất Tùy thuộc vào loài mà trạng thái kết tinh cellulose khác nhau, từ xác định tính chất vật lý sản phẩm độ bền, độ hòa tan dung mơi, tính chịu ảnh hưởng tác nhân biến tính [2,3] Bảng 1.1 Cấu trúc BC số loài vi khuẩn [2] Giống Cấu trúc cellulose Acertobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành dãi Achromobacter Sợi Aerobacter Sợi Agrobacterium Sợi ngắn Alcaligen Sợi Pseudomonas Các sợi không tách biệt Rhizobium Sợi ngắn Sarcina Cellulose dị hình Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc AX (A.aceti ssp Xylinum, A.xylinus), vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu Gần xếp vào giống Gluconacertobacter, bao gồm loài G.xylinus (Yamada avf cộng sự, 1998,2000), G.hánenii, G.europaeus, G.oboediens G.intermedius [2,4] 1.1.1.2 Cấu trúc BC Cellulose polyme không phân nhánh bao gồm gốc glucopyranose nối với nối – 1,4 Các nghiên cứu BC cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật) Tuy nhiên, cấu trúc đa phân thuộc tính BC khác với PC Các sợi sinh BC kết lại với để hình thành nên sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm Là sợi mảnh có nguồn gốc tự nhiên [Kudlicka, 1989] Các vi sợi nằm bó (budle), cuối hình thành dải (ribbon) (Yamanaka cộng sự, 2000) Các dải có chiều dày – nm nm (Zarr,1977); 3,2 133 nm (Brown cộng sự, 1976); 4,1 chiều rộng 70 – 80 117 nm (Yumanaka cộng sự, 2000) Trong chiều rộng sợi cellulose tạo từ gỗ thông 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) 14.000 – 40.000 nm (hình 1.1) Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ – m làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, ổn định nối hydrogen BC khác với PC số kết chặt, mức độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2.000 – 6.000 (Jonas Farah, 1998); vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000 (Watanabc cộng 1998) mức polymer hóa thực vật 13.000 – 14.000 (Teeri, 1997) [2,5] Cấu trúc BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe cộng sự, 1998a; Yamanaka cộng sự, 2000) Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp miếng cellulose bề mặt dịch nuôi cấy, ranh giới bề mặt dịch lỏng khơng khí giàu oxy Các miếng BC gọi BC môi trường tĩnh ( S – BC: Static BC) Các sợi cellulose sơ cấp liên tục đẩy từ lỗ xếp dọc bề mặt tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành vi sợi, bị đẩy xuống sâu môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên mặt phẳng song song khơng tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào AX (Jonas Farah, 1998) Các sợi BC kế tạo từ môi trường tĩnh nối với nhánh sợi BC tạo từ mơi trường lắc (A – BC: Agitated – BC) A – BC tạo dạng hạt nhỏ, hạt hình sợi dài, chúng phân tán tốt môi trường (Vadamme cộng