Nghiên cứu cố định vi khuẩn cố định đạm trong hạt polyter và ứng dụng trên cây dâu tây

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THUỲ QUÝ TÚ NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG HẠT POLYTER VÀ ỨNG DỤNG TRÊN CÂY DÂU TÂY LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THUỲ QUÝ TÚ NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG HẠT POLYTER VÀ ỨNG DỤNG TRÊN CÂY DÂU TÂY Chuyên ngành: Mã số chuyên ngành: Công nghệ sinh học 62420201 Phản biện độc lập 1: GS TS Nguyễn Hồng Sơn Phản biện độc lập 2: PGS TS Nguyễn Văn Kết Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Đức Hoàng Phản biện 2: PGS TS Phạm Văn Hiền Phản biện 3: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm S PGS.TS Nguyễn Thuý Hương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Chữ ký Nguyễn Thuỳ Quý Tú TÓM TẮT Luận án nghiên cứu số tính chất chất giữ ẩm nơng nghiệp polyter chủng Azotobacter Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP.HCM cung cấp từ sưu tập giống Bộ môn nhằm kết hợp tạo chế phẩm Biopolyter-Azotobacter Các chủng Azotobacter sử dụng để tiến hành lên men môi trường bán rắn với giá thể polyter Kết cho thấy hai chủng A2 (Azotobacter chroococcum ATCC 4412) A3 (Azotobacter vinelandii ATCC 12337) tổng số chủng khảo sát có mật độ tế bào sau lên men cao, đạt 3,2 - 3,8x109 CFU/g Hai chủng có khả tổng hợp nitơ IAA cao, đạt 7,1 - 7,5 ml nitơ tổng/100ml 70,08 - 78,15 µg IAA/ml sau ngày ni cấy Kết khảo sát cho thấy hai chủng phát triển tốt khoảng biến thiên rộng nhiệt độ (20 - 400C), pH môi trường (4,0 - 8,5) Tuy nhiên, chúng phát triển tối ưu nhiệt độ 25 - 300C pH 6,5 - 7,5 Tiếp theo, sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), phương án cấu trúc có tâm (CCD) để tiến hành tối ưu hóa q trình tạo chế phẩm cố định vi khuẩn Azotobacter lên men bán rắn giá thể hạt polyter Các yếu tố chọn lựa để khảo sát hàm lượng sucrose, nhiệt độ, pH, độ ẩm tỉ lệ giống Kết giá trị tối ưu môi trường lên men bán rắn giá thể hạt polyter để nuôi cấy Azotobacter thu sinh khối cực đại đạt 4,12x109 CFU/g giá trị hàm lượng sucrose 2,9%; nhiệt độ 31,50C; pH 6,44; độ ẩm 61,04%; tỉ lệ giống 1,05% Các giá trị tối ưu nhận tính tốn kiểm chứng thực nghiệm với kết cho thấy số liệu tối ưu mà nhận hồn tồn tương thích với liệu thực nghiệm (97%) Nghiên cứu chế phẩm trình ứng dụng dâu tây, mật độ vi khuẩn Azotobacter chế phẩm trì mức 3,20 - 3,92x109 CFU/g suốt tháng theo dõi Khi bổ sung chế phẩm Biopolyter - Azotobacter giá thể trồng dâu tây sinh trưởng, phát triển tốt, hoa sớm - ngày, suất cao 11 - 17%, độ Brix trái tăng - 4%, chất lượng trái dâu tươi tăng lên thể qua tiêu chất khơ hồ tan, hàm lượng đường tổng vitamin C Các khảo sát đại thể, vi thể, tính chất mật số Azotobacter cố định chế phẩm Biopolyter - Azotobacter cho thấy: chế phẩm tạo thành giữ tính chất polyter - chất giữ ẩm nông nghiệp, chế phẩm tạo thành bảo tồn số lượng vi khuẩn Azotobacter thời gian dài 15 tháng với mật độ 0,30x109 CFU/g chế độ nhiệt độ phòng (28 - 320C) 1,28x109 CFU/g chế độ nhiệt độ mát (15 - 200C) ABSTRACT This thesis studies some properties of polyter and some strains of Azotobacter by the Department of Biotechnology, Ho Chi Minh City Polytechnical University to create preparations of Biopolyter-Azotobacter to use in microbiology fertilizer production Azotobacter strains have been used to conduct fermentation in semi-solid state medium with polyter as polymeric substrate The results indicate that A2 and A3 strains in strains surveyed to have high cell density after fermented, reach 3.2 - 3.8x109 CFU/g These two strains have high ability to synthesize nitrogen and IAA, reach 7.1 - 7.5 mg of total nitrogen per 100ml and 70.08 - 78.15 µg IAA/ml after days of fermentation The survey result also show that two products develop well in wide-range changes of temperature, pH and nutrition supplied of media Specifically, optimum development temperature is 20 - 400 C, pH 4.0 - 8.5 Target of the study is optimization of some parameters for Biopolyter Azotobacter production to using in biofertilizer production These selected factors are sucrose content, temperature, pH, moisture and inoculum’s size These factors have been subsequently optimized using the Response Surface Methodology (RSM) - Central Composite Designs (CCD) Calculations show that optimal levels are as follows: sucrose content (2.9%), temperature (31.5 0C), pH (6.44), moisture content (61.04%), inoculum’s size (1.05%) and the value of maximum biomass is 4.12x109 CFU/g The optimum values just found by calculations have been checked by the experiments and we find that calculations are in good agreement with the experiments (97%) By applying BioPA on strawberries, density of Azotobacter bacteria in polyter always maintain at 3.20 - 3.92x109 CFU/g over months monitoring period The strawberries grow, develop well, flowering earlier - days, productivity higher at 11 - 17%, the Brix ratio the berries increase - 4%, the quality of fresh berries increase by adding Biopolyter-Azotobacter in cultivation substract due to critera on soluble dry matter, total sugar content, and vitamin C Based on the appearance, structure (SEM images), properties, and concentrations of the immobilized Azotobacter in Biopolyter-Azotobacter, it was found that the properties of polyter as a supper absorbent polymer maintained in this bio product Additionally, the high concentrations of Azotobacter were preserved in the product such as 0,30x109 CFU/g at 28 - 320C (room temperature) and 1,28x109 CFU/g at 15 - 200C LỜI CÁM ƠN Cơng trình nghiên cứu tơi hoàn thành với ủng hộ nhiều tập thể, cá nhân thời gian qua Trước tiên, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể thầy cô hướng dẫn khoa học: TS Phạm S, PGS.TS Nguyễn Thuý Hương truyền đạt kiến thức, định hướng nghiên cứu, phương pháp luận, ý tưởng, nội dung nghiên cứu, chỉnh sửa văn phong, phương pháp báo cáo khoa học… tơi thiết nghĩ khơng có tận tâm hướng dẫn hai thầy tơi khơng thể hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tới Trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh đặc biệt Bộ môn Công nghệ Sinh học – Khoa Kỹ thuật Hố học, Sở Nơng nghiệp & PTNT Lâm Đồng, Trung tâm phân tích – Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, rau hoa Đà Lạt, Công ty TNHH Organik Đà Lạt có giúp đỡ tích cực, tạo điều kiện để tơi thực tốt thí nghiệm, nghiên cứu quan trọng luận án Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình, tất bạn bè, đồng nghiệp người thân thương yêu, động viên, khích lệ tơi thời gian qua Những tình cảm thân thương nguồn động lực lớn lao giúp tơi hồn thành tốt chương trình học tập, nghiên cứu TÁC GIẢ NGUYỄN THUỲ QUÝ TÚ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xiii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiv MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nội dung đề tài 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể 2.3 Các nội dung 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu: 4.2 Phạm vi nghiên cứu Những đóng góp đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu chất giữ ẩm nông nghiệp hạt polyter .5 1.1.1 Chất giữ ẩm nông nghiệp 1.1.1.1 Khái niệm 1.1.1.2 Polymer phương pháp tổng hợp 1.1.1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chất giữ ẩm canh tác nông nghiệp 1.1.2 Polyter 13 1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4 1.1.2.5 Khái niệm polyter 13 Nguyên lý tạo polyter 14 Cơ chế trương nước polyter 15 Các loại sản phẩm polyter thị trường 16 Vai trị polyter canh tác nơng nghiệp 16 1.2 Nghiên cứu cải tạo vai trị chất giữ ẩm nơng nghiệp phƣơng pháp lên men bán rắn cố định vi sinh vật 18 1.2.1 Vi sinh vật sử dụng sản xuất phân bón vi sinh 18 1.2.2 Vi khuẩn Azotobacter .20 1.2.3 Lên men bán rắn Kỹ thuật cố định vi sinh vật 22 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật môi trường bán rắn 23 1.2.4 Phương pháp nhốt tế bào cấu trúc gel 28 1.2.4.1 1.2.4.2 1.2.4.3 1.2.5 Khái niệm 28 Ưu, nhược điểm 29 Một số chất mang sử dụng phương pháp nhốt tế bào 30 Cố định tế bào vi sinh vật ứng dụng nông nghiệp 31 1.2.5.1 1.2.5.2 nghiệp Ảnh hưởng polymer siêu hấp thụ nước (SAP) lên hẹ vi sinh vạ t đất 31 Vai trò sử dụng polymer siêu hấp thụ nước chất mang cố định vi sinh vật nông 32 1.3 Cây dâu tây tình hình sản xuất dâu tây 35 1.4 Nhận xét chung vấn đề quan tâm 37 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 39 2.1.1 2.1.2 Địa điểm 39 Thời gian 39 2.2 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 39 2.2.1 Vật liệu thiết bị nghiên cứu phòng 39 2.2.2 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu đồng .41 2.3 Sơ đồ tổng quát nội dung luận án 42 2.4 Thuyết minh chi tiết sơ đồ nội dung luận án .43 2.4.1 Giai đoạn nghiên cứu tiền đề 43 2.4.1.1 2.4.1.2 2.4.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm Biopolyter-Azotobacter .45 2.4.2.1 2.4.2.2 2.4.2.3 2.4.3 Các khảo sát đại thể, vi thể mật độ Azotobacter chế phẩm giai đoạn ban đầu 47 Một số tính chất chế phẩm Biopolyter-Azotobacter 47 Đánh giá hiệu sử dụng ảnh hưởng chế phẩm đến dâu tây 47 2.4.4.1 2.4.4.2 2.4.5 Bước đầu tạo chế phẩm Biopolyter-Azotobacter 45 Tối ưu hố thơng số trình tạo chế phẩm Biopolyter-Azotobacter 46 Đánh giá kết tối ưu hoá 47 Đánh giá chất lượng chế phẩm Biopolyter-Azotobacter .47 2.4.3.1 2.4.3.2 2.4.4 Khảo sát số tính chất hạt polyter 43 Đánh giá tuyển chọn chủng Azotobacter 45 Ứng dụng chế phẩm Biopolyter-Azotobacter dâu tây 48 Nghiên cứu chế phẩm Biopolyter-Azotobacter thực tế ứng dụng trồng dâu tây 50 Nghiên cứu ổn định chất lượng chế phẩm 50 2.4.5.1 2.4.5.2 Một số tính chất điển hình chế phẩm theo thời gian bảo quản phép thử dài hạn 50 Đánh giá chung hạn sử dụng chế phẩm 50 2.5 Các phƣơng pháp phân tích 51 2.5.1 Phương pháp vi sinh .51 2.5.2 Phương pháp hoá sinh 51 2.5.2.1 2.5.2.2 2.5.3 Phương pháp hoá lý 52 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.3.3 2.5.3.4 2.5.4 2.5.5 Phương pháp xác định nitơ tổng số 51 Phương pháp xác định IAA 51 Phương pháp xác định lượng nước hấp thụ polyter 52 Phương pháp xác định mức độ lưu giữ nước polyter 52 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 52 Phương pháp sắc ký ion (IC) 53 Các phương pháp lấy mẫu theo dõi trồng 53 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu .54 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Kết nghiên cứu tiền đề .55 3.1.1 Kết khảo sát số tính chất hạt polyter .55 3.1.1.1 3.1.1.2 3.1.1.3 3.1.1.4 3.1.2 Ảnh hưởng pH lên khả hấp thụ nước polyter 55 Khả lưu giữ nước điều kiện phịng thí nghiệm polyter 56 Khả hấp thụ dinh dưỡng polyter 58 Khả giải hấp dinh dưỡng polyter 59 Kết đánh giá tuyển chọn chủng Azotobacter 60 3.1.2.1 3.1.2.2 Kết khảo sát hoạt tính sinh học chủng Azotobacter 60 Kết khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển chủng Azotobacter 62 3.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm Biopolyter-Azotobacter 63 ... cho nghiên cứu chuyên sâu tác dụng kép hạt polyter vi? ??c vừa giữ ẩm vừa làm chất mang cố định vi sinh vật có ích cho trồng 2.2 Mục tiêu cụ thể Nghiên cứu cố định vi khuẩn cố định đạm hạt polyter. .. GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THUỲ QUÝ TÚ NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG HẠT POLYTER VÀ ỨNG DỤNG TRÊN CÂY DÂU TÂY Chuyên ngành: Mã số chuyên ngành: Công nghệ sinh học... tài ? ?Nghiên cứu cố định vi khuẩn cố định đạm hạt polyter ứng dụng dâu tây? ?? thực 2.1 Mục tiêu nội dung đề tài Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu giải pháp để nâng cao hiệu sử dụng hạt polyter sản xuất