Microsoft Word 8245 DOC VIỆN CHĂN NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ CNĐT NGUYỄN THỊ THOA 8245 HÀ NỘI – 2010 LỜI NÓI ĐẦU C«ng[.]
VIỆN CHĂN NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN PHỤC VỤ CƠNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BỊ CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA 8245 HÀ NỘI – 2010 LỜI NÓI ĐẦU Công nghệ Cấy truyền phôi bò đà đợc nghiên cứu ứng dụng Việt Nam từ năm 1978, nhng từ đến hầu nh cha có cải tiến đáng kể k thut sản xuất phôi in-vivo, phôi in-vitro bò sữa Với kết nghiên cứu trớc đây, số lợng phôi in-vivo trung bình thu đợc từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phôi, mặt khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngy, nh năm tiến hành thu phôi 4-5 lần/bò v s phụi bỡnh quõn/bũ/nm ch t 15 phụi Nghiên cứu cải tiến rút ngắn khoảng cách lần thu phôi từ 60-90 ngy xung 28-35 ngày/bị/lần ®· tăng số phơi thu từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần lờn 5,5-5,7 phôi/bò/lần tăng số phôi thu đợc 30- 45 phơi/bị/năm Nghiên cứu tạo phơi bị in-vitro từ tế bào trứng thu lò mổ trước với mục đích nghiên cứu để hồn thiện phương pháp cú ý ngha nghiờn cu khoa hc không cã ý nghĩa vÒ gièng sản xuất Nghiên cứu tạo phôi in-vitro từ tế bào trứng thu bò sống phơng pháp siêu âm đà a c quy trình thu tế bào trứng với tần xuất lần/ tuần áp xuất chân không 120 mmHg bị sữa 3-6 tuổi thu 7-8 tế bào trứng/bị/lần tạo nguồn phơi in-vitro từ nhứng bũ sa cú giá trị giống v tim nng di truyn cao Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đà đợc nghiên cứu từ năm 1984 Viện Khoa học Việt Nam Phơng pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 120C/phút) sau khử nớc phần nhiệt độ phòng với phôi bò đà thành công (Bùi Xuân Nguyên cs 1984) Năm 2003, Lu Công Khánh cng s đà báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò glycerol Năm 2005 Nguyễn Thị Thoa cng s đà nghiên cứu phơng pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ tinh thể) bớc đầu đà thành công nhng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh thấp đạt 73,24% Trong nghiên cứu đà đa đợc quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể (vitrification) cải tiến đà tăng tỷ lệ sống phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên 80% Chúng đa quy trình ci tin với mục tiêu cung cấp xác cỏc bc tin hnh quy trình cho cán nghiên cứu kỹ thuật viên cú th ng dng sn xut phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sa Việt Nam BO CO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2007-2010 THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo nhân giống bò” Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa Học vị : Thạc sĩ Điện thoại: 0913321521 Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoà- Cầu Giấy- Hà Nội Cơ quan : Viện Chăn nuôi Địa : Thuỵ Phương- Từ Liêm- Hà Nội Số điện thoại: 048389971 Cơ quan phối hợp: Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Việt Nam Trung tâm Thực nghiệm Bảo tồn vật nuôi- Viện Chăn ni Trung tâm Nghiên cứu Bị Đồng cỏ Ba Vì; Hà Tây Trung tâm, Trạm trại tỉnh Thanh Hoá, Hải Dương Thời gian thực hiện: Từ năm 2007-2010 Kinh phí: 2.500.000.000 đồng PHẦN I : MỞ ĐẦU I ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi nước ta có vai trị quan trọng nơng nghiệp phát triển kinh tế quốc dân, giá trị ngành chăn nuôi hàng năm chiếm tỷ lệ 30% tổng giá trị nông nghiệp Trong năm vừa qua chăn ni góp phần quan trọng chuyển đổi cấu kinh tế nông nghiệp, tăng thu nhập cải thiện đời sống cho nông dân Tốc độ phát triển chăn nuôi sản phẩm chăn nuôi hàng năm tăng bình quân từ 6-8% đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước ngày cao sản phẩm chăn nuôi Tổng sản lượng thịt sản xuất năm 2009 nước ta đạt 3,7 triệu thịt có tốc độ tăng trưởng bình qn năm đạt 6%/năm đưa bình quân sản lượng thịt đầu người lên 43kg/người/năm Phát triển chăn ni bị thịt, bị sữa gia súc ăn cỏ Bộ Nông nghiệp Nhà nước địa phương quan tâm đầu tư có sách khuyến khích phát triển từ năm cuối kỷ trước đầu kỷ XXI Quyết định số 167 Thủ tướng Chính phủ số biện pháp sách phát triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 minh chứng cho quan tâm Trong thời gian từ 2001 đến nay, thực Chương trình phát triển bị sữa theo Quyết Định 167 Thủ tướng Chính phủ, chăn ni bị sữa Việt nam thu nhiều kết tốt đẹp, phát triển cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày cao xã hội Tổng đàn bò sữa sản lượng sữa nước tăng từ 40.000 64.000 năm 2001 lên 140.000 290.000 năm 2010 Chăn ni bị sữa thực mang lại hiệu kinh tế xã hội cao nông nghiệp Việt Nam thời gian 2001-2010 Để có số lượng chất lượng bị sữa HF Việt Nam kết áp dụng khoa học kỹ thuật công nghệ sinh học lại tạo nhân giống bò sữa Việt Nam nhà khoa học suốt thời gian 50 năm Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo công nghệ phơi có kỹ thuật đơng lạnh tinh, phôi kỹ thuật sinh sản quan trọng áp dụng cải tiến nhân giống bò sữa HF Việt Nam Đối với bị thịt có nhiều tiến kỹ thuật áp dụng công tác lai tạo nhân giống, chăn ni bị thịt Việt Nam chưa đáp ứng kịp nhu cầu tiêu thụ thịt bị thị trường nơi địa số lượng chất lượng Hầu hết nhà hàng, khách sạn siêu thị cao cấp phải nhập thịt bò từ Mỹ, Australia, New Zealand Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trâu, bò đạt 330 ngàn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm thấp so với mức tiêu thụ 9-10 kg/năm nước khu vực Trung Quốc, Nhật Bản Để phát triển chăn ni bị thịt, thành ngành sản xuất hàng hoá, dự án Cải tiến nâng cao chất lượng giống bò thịt Việt Nam 2006-2010 Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg Thủ tướng Chính phủ ngày 16 tháng năm 2008 đặt mục tiêu tăng cường cấu giống bò lai, bò thịt chất lượng cao nhằm đạt tổng sản lượng thịt bò 310 ngàn vào năm 2015 425 ngàn năm 2020 Để đạt mục tiêu bò thịt bị sữa, việc cải tiến cơng nghệ sinh học sinh sản, cải tiến công nghệ tạo phôi ống nghiệm (TTON-in vitro fertilisation) từ tế bào trứng thu bò sống kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (hay gây siêu noãn) để tạo phôi in vivo, số kỹ thuật liên quan khai thác tối đa tiềm sinh sản bị cao sản góp phần tăng nhanh số lượng, chất lượng đàn bò hạt nhân biện pháp kỹ thuật then chốt cần quan tâm đầu tư nghiên cứu Căn vào mục tiêu yêu cầu cấp bách thịt sữa cho tiêu dùng nước năm vừa qua, Bộ Nông nghiệp PTNT phê duyệt cho phép tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ cơng tác tạo nhân giống bị” II MỤC TIÊU Đề tài xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học sinh sản tiên tiến phục vụ cho việc tạo nhân giống bò như:Công nghệ phôi, công nghệ đông lạnh tế bào sinh sản, để nâng cao xuất sinh sản chất lượng giống bị cách nhanh chóng hiệu Mục tiêu đề tài : Cải tiến ứng dụng thành công công nghệ sinh sản đại (công nghệ sản xuất phôi invivo, phôi invitrro, công nghệ đông lạnh tinh, đông lạnh phôi…) để nâng cao suất sinh sản chất lượng giống bò bò thịt, bò sữa PHẦN II TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU I CƠ SỞ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ CẤY TRUYỀN PHƠI BỊ 1.1 Kích thích nỗn bao phát triển đồng loạt tác động hormone Nhiều tác giả cho thấy tiềm sinh sản bò lớn nhiều so với khả sinh sản thực chúng Theo Erickson (1966) cho biết buồng trứng bị có 70.000 nỗn bao ngun thuỷ phát triển thành tế bào trứng để thụ tinh tạo phơi Nghiên cứu bị có chu kỳ động dục Danell(1987) cho biết trung bình s t bo trng 12636 bò không hoạt động có số tế bào trứng 10132, khác không rõ ràng (P>0,05) Nghiên cứu tế bào mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đà công bố bê tháng tuổi có 21000 bò già có 2500 tế bào trứng bò, chu kỳ rụng trứng, thụ tinh bê, đời bò sinh 7-8 bê thực tế số nỗn bào sử dụng hữu ích ít, đời cao sản thật lãng phí Nhiều nghiên cứu cho thấy mét chu kì bò thờng có đến đợt sóng nang phát triển cá biệt có tới đợt Sóng nang phát triển số noÃn bao ë cïng mét thêi gian Nghiªn cøu theo dâi sù ph¸t triĨn cđa nang trứng bng trøng bũ sng phong pháp siêu âm đợc nhiều tác giả công bố Đợt bắt đầu diễn sau rơng trøng vµo ngµy thø 3-9 cđa chu kì, đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba ngày 18-0 Mỗi đợt sóng nang huy động tới 15 nang kÝch th−íc tõ 5-7 mm ph¸t triĨn, sau có nang phát triển mạnh gọi nang tréi (nang khèng chÕ) KÝch th−íc cđa nang khèng chế đợt 1, 2, đạt 12-15 mm đỉnh kích thớc nang tơng ứng quan sát thấy vào ngày 6, 13, 21 (Dalin 1987, Monget 1993) Đặc điểm đợt phát triển nang phát triển có tính tự điều khiển cạnh tranh nang Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển phát triển nang lại bị kìm hÃm Tuy thể vàng tồn tại, nang khống chế nang lớn bị thoái hoá, có đợt cuối thể vàng không nang khống chế phát triển tới chín rụng Đây lí giải thích chu kì động dục bò có trứng chín rụng (cá biệt có trứng) Do đặc điểm đợt phát triển nang đợc gọi sóng nang phát triển Trong đợt sóng nh tồn nang nang khống chế dao động từ 5-6 ngày (Ireland 1987, Fortune cs 1988) Riêng nang khống chế phát triển nhanh sau ngày 18 chu kì, tốc độ phát triển nang khống chế vào thời điểm đạt 1,6mm ngày (Fortune cs.1988, Savio cs 1988) Trên sở nghiên cứu vÒ quy luật phát triển nang trờn bung trng v hiểu biết hormone điều khiển sinh sản, nhiều cỏc nh khoa hc đà tạo cho trứng rụng đồng loạt chu kì to đợc nhiu phôi có chất lợng vào điểm đợc xác định kỹ thuật gây rông trøng nhiều Kỹ thuật gây rụng trứng nhiều thu đợc nhiều kết khả quan Gây rụng trứng nhiều (GRTN) lần đầu tiờn c nghiên cứu chuột Engle (1927); bò cừu Col Miller (1933); Parker vµ Hammond (1940) vµ Casida vµ cs (1944) Các phơng pháp GRTN giai đoạn bớc đầu nghiờn cu chủ yếu sở mối tơng quan tuyến yên-buồng trứng phát hocmon ECG estrogen phụ nữ có thai ngựa chưa (Smith vµ Engle: 1927; Zondek vµ Aschheim: 1927) KÕt GRTN giai đoạn hạn chế tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi đạt từ 2-10% Nghiên cứu xây dựng phơng pháp GRTN cách hệ thống sở hiểu biết đầy đủ chế điều khiển phát triển nang rụng trứng bắt đầu thực từ năm 1970 Trong giai đoạn này, s phát triển công nghệ phôi quy mô lớn đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; phơng tiện nghiên cứu đại xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu âm đà đợc áp dụng phổ biến nghiên cứu sinh học sinh sản Những đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng phơng pháp GRTN giai đoạn đà đợc thực sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng vai trò thể vàng hoạt động chu kỳ tính buồng trứng Nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy rụng trứng xy nang đà phát triển tới độ chín cần thiết, bao gồm tăng tối đa kích thớc nang xoang chứa dịch nang, chín noÃn đợc thể qua tợng tan màng nhân, phân lập cầu cực 1, phân bố thể nhiễm sắc giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault 1985, Blerk Van bell, 1986) Điều kiện cần thiết để trình chín rụng trứng xẩy tăng cờng phân tiết LH tuyến yên máu ngoại vi Sự chín rụng trøng chØ xảy sau xt hiƯn ®Ønh LH Quan sát bò cho thấy chu kỳ bình thờng, tan màng nhân xuất khoảng sau đỉnh LH, hình thành nhiễm sắc thể M II xẩy khoảng 17-22 sau đỉnh LH, rơng trøng xảy 22 giê sau ®Ønh LH (Dieleman 1993) Vào thời điểm rụng trứng, tăng thể tiếp nhận LH đợc quan sát thấy nang khống chế dẫn tới tăng tổng hợp Progesterone PGF Các hocmon có tác động gây vỡ nang thông qua kích thích hoạt động co trơn nằm lớp màng buồng trứng (Akamura vµ cs 1972; Virutamanen 1972, Chaning vµ cs 1980) tăng tổng hợp enzym gây tan màng nang nh plasmin, hyaluronidaza (Beer 1975; Espey 1974) Những nghiên cứu góp phần đa dẫn vai trò phơng thức sử dụng LH hCG gây rụng trứng nhiều Ngoài ra, đà có nhiều tác giả nghiên cứu phơng pháp sử dụng loại hocmôn khác để GRTN bò cho phôi Theo Elsden cs (1974), gây rụng trứng nhiều PMSG PGF2 bò cho kết tốt Bò đợc tiêm PMSG vào chu kì động dục với liều 1500 2000 UI, sau 48h tiêm liều 1,9mg PGF2 cách 12 h Trong tổng sối 24 bò đợc tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục vòng ngày kể từ tiêm PGF2 Trong số có 14 bò động dục vào ngày thứ Bằng phơng pháp phẫu thuật để đánh giá kết cho thấy 24 bò có phản ứng mạnh có số trứng rụng bình quân 13,219, có 20 bò có noÃn bao không rụng bình quân 3,3 Thí nghiệm khác 35 bò với liều 2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 chu kì động dục, kết có 24 bò phát có phản ứng với PMSG phơng pháp khám lâm sàng qua trực tràng Khi mổ khám có bò số 29 bò không rụng trứng có u nang buồng trứng Trên 17 bò bình quân trứng rụng 8,01,5 có bò noÃn bao không rụng Một nghiên cứu đợc tiến hành 10 bò với kết hợp PMSG PGF2 đà phối giống thời gian ®éng dơc Trong tỉng sè 141 trøng rơng ®· thu đợc 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), có 88% phôi thụ tinh Từ kết thu đợc tác giả có nhận xét kết hợp PMSG với PGF2 cho kết tốt dùng PMSG để gây rụng trứng nhiều bò Boland cs 1978; Chupin Procureur, 1982; Newcomb cs 11976) cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN bò thờng kèm theo hạn chế ảnh hởng âm tính lên kết thụ tinh phát triển phôi nh thời điểm xuất động dục không xác, động dục kéo dài Trong trờng hợp tỷ lệ bò có phản ứng rơng trøng cao (89% có ph¶n øng), nh−ng chØ cã 44% bò có 5phôi/1 lần, có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt Trong thực tiễn khả gây rụng trứng nhiều lặp lại cá thể cho phôi Nguyn Th Thoa Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 Cố định bị, lấy hết phân, rửa ©m sát khuẩn cồn 700 Cho đầu giò siêu âm vào trực tràng, cố định buồng trứng phía mặt qt đầu giị Nhẹ nhàng xoay, đếm đo kích thước nang trứng có mặt buồng trứng qua hình máy siêu âm Q trình đo, đếm ph¶i thực tỉ mỉ xác - Siêu âm hút tế bào trứng VËn hµnh hệ thống siêu âm hút tế bào trứng, sử dụng kim cì 18G, dài 55 cm, mơi trường hút tế bào trứng (mDPBS Sigma) có bổ sung 50 iu/ml heparin 5% huyết bê kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100µl streptomycin/ml) trì nhiệt độ 370C máy ổn nhiệt Nhẹ nhàng cho đầu dị siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng cố định buồng trứng, đưa nang trứng vị trí mũi kim, quan sát nang trứng hình máy siêu âm chọc hút dịch nang trứng Dịch hút thu vào ống ly tâm 50ml trì nhiệt độ 370C máy ổn nhiệt Sau hút xong, đưa phịng thí nghiệm, lọc cốc lọc Emcol có đường kính lỗ lọc 20µm, khoảng 10ml dung dịch lại chuyển vào đĩa petri vơ trùng có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại tế bào trứng kính hiển vi soi Tế bào trứng sau đánh giá, phân loi c nuụi chớn mụi trng IVM Nuôi thành thơc tÕ abfo trøng èng nghiƯm (IVM) * Chn bị môi trờng - Lấy PBS, TCM 199, kháng sinh từ tủ lạnh để nhiệt độ phòng - Lấy huyết bê từ tủ lạnh sâu cho vào bể Êm 37oC Nguyễn Thị Thoa – Công nghệ phôi bũ 2007-2010 - Khử trùng vị trí thao tác cån ethanol 70% Pha m«i tr−êng nh− sau: - TCM 199 23,75 ml - HuyÕt bª 1,25 ml - Kháng sinh 25 àl - Bịt miệng ống đong thủy tinh parafin, nghiêng lắc 20 lần - Lọc microfilter vào chai 100 ml - Chuẩn bị đĩa giọt, giọt 100àl 4,5 ml dầu khoáng - Chuẩn bị hai đĩa rửa 2.5ml IVM ml dầu khoáng - Đặt vào tủ ấm trớc dùng * Nuôi thành thục tế bào trứng èng nghiƯm - Sau thu tÕ bµo trøng, rửa tế bào trứng lần đĩa rửa Sau chuyển tế bào trứng vào giọt IVM, giọt 20 tế bào đặt vào tủ ấm để nuôi thành thục tế bào trứng vòng 20- 24h CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG RỬA TRỨNG, RỬA TINH TRÙNG VÀ PHA LỖNG TINH TRÙNG Chn bÞ mơi trng gốc BO Môi trờng BO - Lấy ống đong thđy tinh lo¹i 100ml - Sodium piruvate 0,01375 g - Dung dÞch gèc BO A 76ml - Dung dÞch gèc BO B 24ml (sục khí CO2) 100 àl - Kháng sinh - Dán miệng ống đong parafin, nghiêng lắc nhẹ 20 lần Dung dịch rửa trứng ( Chai 50 ml) - BO solution 10ml Nguyễn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 - BSA (cristalised) 0,1g (100mg) - Để tan tự nhiên Dung dịch pha long tinh trïng (Chai 50 ml) - Dung dÞch BO solution 10ml - BSA (cristalised) 0,2g (200mg) Dung dÞch rưa tinh trïng (Bỏ 40 ml dung dịch BO ống, sử dụng 40 ml lại) - Dung dịch BO - Hypotaurinl - Novo Heparin 40ml 0,04364 g 160àl (tủ lạnh) - Dán miệng ống đong parafin, nghiêng lắc nhẹ 20 lần Dùng bơm tiêm loại 50ml để lọc dung dịch microfilter theo thứ tự sau: - Dung dịch rửa tinh trùng vào chai 50 ml - Dung dịch pha loÃng tinh trùng vào ống facol 50 ml - Dung dịch rửa trứng vào ống falcon 50ml Sau läc xong, cÊt dung dÞch rưa vµ pha lo·ng tinh trïng vµo tđ Êm + Chn bị đĩa rửa trứng, đĩa thụ tinh (loại ®Üa nunclon) + LÊy 3ml dung dÞch rưa trøng cho vào đĩa, không cần phủ dầu khoáng + Lấy àl dung dịch rửa trứng vào đĩa thụ tinh (4 giọt), phủ 4,5 ml dầu khoáng + Cất đĩa vào tủ ấm Xong công việc trên, chờ môi trờng ấm lên bắt đầu công việc xư lý tinh trïng CHUẨN BỊ GIẢI ĐƠNG TINH TRÙNG VÀ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM - pipet lo¹i 10 ml, pipet loại ml pipet loại ml để lên bàn sởi ấm Nguyn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 - èng tube falcon 15 ml ®Ĩ bĨ n−íc Êm 37oC - N−íc mi 3%, èng tube thủ tinh 15ml, buồng đếm tinh trùng Thoma - Máy li tâm, ống cân bằng, kéo cắt cọng rạ, cồn Tiến hành: - Lấy cọng rạ bình nitơ, để không khí giây thả vào bình nớc ấm giải đông - Lấy cọng rạ khỏi bể nớc ấm, lau kh«, lau khư trïng b»ng b«ng cån, dïng kÐo cắt để rót tinh trùng vào ống tube falcon ë b×nh n−íc Êm - LÊy ml dung dịch rửa tinh trùng cho vào ống falcon có tinh trïng - LÊy cèc n−íc bĨ n−íc Êm cho vào ống li tâm, đặt vào máy ly tâm khởi động máy - Lấy ml nớc muối cho vào ống thuỷ tinh, bỏ bớt 50àl - Chuẩn bị buồng đếm tinh trùng, dán chặt phiến kính vào buồng đếm tinh trùng - Ly tâm xong, bỏ ống tube ra, hút bỏ phần để lại khoảng 0.5 ml phần cuối - Cho ml dung dịch rửa tinh trùng cho vào ống tube trộn - Lấy lại nớc ấm vào ống li tâm, đặt ống tube có tinh trùng vào máy ly tâm khởi động máy - Ly tâm xong lấy ống tube hút bỏ phần trên, để lại khoảng 0.5 ml phÝa d−íi Dïng pipet thủ tinh 2ml ®Ĩ ®o lợng dung dịch thực tế ống tube - Lấy 50 àl dung dịch tinh trùng cho vào ống tube nớc muối, đặt lên votex - Nhỏ hai giọt dung dịch ống tube nớc muối lên buồng đếm Thoma ®Ĩ ®Õm mËt ®é tinh trïng (lÊy trung b×nh céng hai lần đếm) Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Tính dung dịch cần bổ sung theo công thức sau Mật độ tinh trùng /12.5 * thể tích lúc đầu (trừ 50àl) - V lúc đầu = (A) Bổ sung lợng (A) dung dịch rửa tinh trùng, trộn Lấy (A) + V lúc đầu = (B) Bổ sung lợng (B) dung dịch pha loÃng tinh trùng, trộn - Lấy 95àl dung dịch tinh trùng cho vào giọt thụ tinh Rửa tế bào trứng, chuyển vào giọt thụ tinh, đặt tủ ấm để thụ tinh tạo phôi NUễI PHễI INVITRRO (IVC) Chuẩn bị môi trờng nuôi phôI in vitro (IVC) CR1aa - Dung dịch gốc CR1aa A 76 ml - Dung dÞch gèc CR1 B ml - BEM essential aa (x50) 0,5 ml (nghiªng l¾c tr−íc lÊy) - MEM Nonessential aa (x100) 0,25 ml - L- glutamic acid - Kh¸ng sinh 0,25 ml 25 àl - Lắc bỏ 1,25 ml - Bỉ sung Hut bª 1,25 ml - BSA 0,075g (A7030) - Dán miệng ống đong parafin, chờ tan tự nhiên, nghiêng lắc - Lọc microfilter - Tạo giọt nuôi cấy + 4,5 ml dầu khoáng - Chuẩn bị đĩa rửa 2,5 ml + 2ml dầu khoáng - Cất vào tủ ấm trớc chuyển tế bào trứng vào nuôi cấy 10 Nguyn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 TÕ bµo trứng sau thụ tinh, đợc chuyển qua đĩa rửa để tách phần tế bào cumulus Sau rửa đĩa rửa chuyển hợp tử vào giọt nuôi cấy nuôi tủ ấm điều kiện 38,5˚C, 5%CO2, ®é Èm tèi ®a thêi gian ngày 6: Kiểm tra phát triển phôi Kiểm tra phân chia phôi ngày 2, 4, 6, 7, sau thô tinh, thu hoạch phôi ghi chép lại Iv Sơ đồ Minh hoạ quy trình sản xuất phôi invitro cải tiến Siêu âm thu tế bào trứng TIM TRNG V Nuôi trứng chín invitro Hoạt hoá tinh trùng tạo phôi in vitro 11 Nguyễn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT PHƠI IN-VIVO CẢI TIẾN TRÊN Bề SA I Những quy định chung 1.1 nh ngha: Sản xuất phơi invivo cải tiến bị sữa quỏ trỡnh rút ngắn khoảng cách tác động hócmon sinh sản để gây rụng trứng nhiều lặp lại (GRTN ) từ 2-3 tháng xuống 28-35 ngày, theo dõi động dục, phối giống cho bò, thu hoạch phôi vào ngày sau phèi gièng 1.2 Phạm vi áp dụng - Công nghệ phôi Việt Nam nên thực trang trại chăn nuôi lớn trờn ton quc, với mục đích tạo đàn giống hạt nhân, từ thông qua công nghệ nhân nhanh đàn giống sản xuất - Chúng ta có thĨ øng dơng c«ng nghƯ ph«i viƯc kiĨm tra suất sữa đực giống thông qua suất chị em gái, phơng pháp kiểm tra suất phù hợp với nớc phát triển nh Việt Nam chi phí thấp thời gian ngắn so với kiểm tra suất đực giống qua đời sau - Sản xuất phôi nớc thay cho việc phải nhập giống từ nớc ngoài, tránh đợc lây truyền bệnh tật, stress thay ®æi khÝ hËu ®ét ngét 1.3 Yêu cầu kỹ thuật quy trình Số lượng chất lượng phơi bị thu cao so với quy trình hành 1.4 Thiết bị dụng cụ hoá chất cần thiết cho việc sản xuất phôi invivo - CIDR, FSH, PRID, PGF2α, Estradiol - Mơi trưịng dội rửa thu hoạch phơi( PBS Ringer lactat bổ sung CS, môi trường lưu phôi (PBS+ 20% CS) Nguyễn Thị Thoa – Công nghệ phơi bị 2007-2010 - Dụng cụ đặt CIDR , PRID - Dụng cụ thu phôi: Catheter, hệ thống ống dẫn, lõi thép, nong tử cung, bơm tiêm, kim tiêm, bụng, cn, găng tay vô trùng, chai thu tinh trung tính 500ml đựng dung dịch dội rửa, bồn nước ấm ổn nhiệt, gióng giá cố định bị, phễu lọc phơi vụ trựng, phin lc 0,22àl, đa petri 90, ®ĩa petri ∅30, pipet 10 ml, pipet ml, micropipet, đầu hút phôi thuỷ tinh trung tính, đèn cồn, dao cắt đầu hút thuỷ tinh chuyên dụng II Sơ đồ quy trình sản xuất phôi invivo cải tiến LP K HOẠCH GÂY RỤNG TRỨNG NHIỀU CHỌN BỊ CHO PHƠI CHUẨN BỊ SỔ GHI CHÉP CHO MỖI BÒ GRTN CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ HĨC MƠN LỊCH GÂY RỤNG TRỨNG NHIỀU NGÀY 0: ĐẶT CIDR NGÀY 5: TIÊMM OESTRADIOL NGÀY 10: SÁNG TIÊM FSH + CHIỀU TIÊM FSH NGÀY 11: SÁNG TIÊM FSH + CHIỀU TIÊM FSH NGÀY 12: SÁNG TIÊM FSH RÚT CIDR;CHIỀU TIÊM FSH VÀ PGF2α NGÀY 13: SÁNG TIÊM FSH , CHIỀU TIÊM FSH NGÀY 14, NGÀY 15: PHÁT HIỆN ĐỘNG DỤC VÀ PHỐI GIỐNG Nguyễn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 NGÀY 21: THU PHƠI III QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT PHƠI IN-VIVO CI TIN * Lập kế hoạch gây rụng trứng nhiều (GRTN) Chn bò cho phôi: Bò cho phôi bò lai hớng sữa khỏe mạnh, đợc chọn từ đàn hạt nhân, suất sữa bình quân 4000-6000l/chu kỳ, có chu kỳ sinh dục bình thờng, sinh đẻ bình thờng, dị tật quan sinh dục, cổ tử cung phát triển bình thờng, dễ dàng thao tác dẫn tinh quản, dụng cụ giội rửa thu hoạch phôi, buồng trứng mềm, không mắc bệnh truyền nhiễm, có độ tuổi từ 3-6 năm Chuẩn bị mẫu ghi chép cho bò GRTN Mẫu ghi chép gồm thông tin sau: - Ghi chép tình trạng sinh sản quan sinh dục bò cho phôi (buồng trứng, tử cung phối giống) - Các thông tin GRTN (liều lợng thời gian tiêm FSH PGF2 , ngày động dục ngày phối giống, ngày thu hoạch phôi,) - Thông tin thu hoạch phôi (số hiệu bò, số phôi thu đợc, chất lợng phôi thu đợc) Chuẩn bị dụng cụ hormon, tinh bò đông lạnh cho tạo phôi - Chuẩn bị PRID, CIDR, FGF2 , Estradiol - Dụng cụ đặt PRID, CIDR, dầu nhớt, găng tay, bơm tiêm ml, kim tiêm 18G, Cồn 700, thấm nớc, giấy vệ sinh - Tinh trùng đực giống tốt có chất lựợng: ho¹t lùc sau đơng lạnh, giải đơng ≥ 45% Nguyễn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 Chó ý: - Tất hoocmon phải hạn sử dụng đợc bảo quản quy định nhà sản xuất Các dụng cụ phải đảm bảo vô trùng 4: Lch gây rụng trứng nhiều phối giống cho bò Ngày đặt PRID CIDR (ngày 0) Thời gian tiêm Liều tiêm FSH giảm dần (FSH super-ov) Ngày (đặt PRID CIDR 10 11 12 Sáng ml FSH ChiỊu ml FSH S¸ng 2.5 ml FSH Chiều 2.5 ml FSH Sáng 2ml FSH Rút PRID CIDR Chiều Tiêm 2ml FSH ml PGF2 13 S¸ng 1,5 ml FSH ChiỊu 1,5 ml FSH 14 ChiỊu §éng dơc -phèi gièng 15 S¸ng §éng dơc -phèi gièng 21 Sáng Thu hoạch phôi Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 Chú ý: Bảo đảm vệ sinh bé phËn sinh dơc c¸i, thao t¸c nhanh, nhẹ nhàng, phối giống thời điểm, (Bò động dơc sau tiªm PGF2α 42 - 48 giê, phèi gièng tèt 10 – 24 giê kĨ tõ chÞu đứng yên cho khác nhảy Lần phối tinh thứ chiều ngày thứ 14 lịch trình GRTN) Lần phối tinh thứ vào sáng ngày thứ 15 chơng trình GRTN Thu hoạch phôi Thu hoạch phôi sau phối giống ngày - Chuẩn bị thu hoạch phôi + Chuẩn bị mụi trũng di phụi (PBS hoc Ringer lactat b sung huyết bê kháng sinh, giữ ấm nhiệt độ 37C + Mụi trường lưu phơi (PBS+ 20% CS) gi÷ Êm ë nhiƯt ®é 37°C + Folley Catheter, hệ thống ống dẫn, lõi thộp, nong t cung, bơm tiêm, kim tiờm, bụng , cn, giy chuyờn dng, găng tay vô trùng, chai thu tinh trung tính 500ml đựng dung dịch dội rửa, bồn nước ấm ỉn nhiệt, gióng giá cố định bị + Cố định bò vào dóng giá, móc bỏ phân, vệ sinh âm hộ, gây tê khấu đuôi novocain (dao động từ 3-10ml tuỳ cá thể), tin hành khám buồng trứng qua trực tràng đếm số lượng thể vàng buồng trứng qua đánh giá số trứng rụng để dự đốn số lượng phơi thu c - Tiến hành rửa phôi: - Làm ớt Folley catheter dung dịch rửa, đa Folley catheter vào sừng tử cung, bơm khí vào bóng Folley catheter (lợng khí dao động từ 15-20 ml phụ thuộc vào kích cỡ sừng tử cung bò), vị trí bóng khí 1/3 phÝa d−íi sõng tư cung, rót lâi s¾t ra, nèi c¸c èng dÉn víi Folley catheter, më kho¸ èng dÉn cho Nguyễn Thị Thoa – Công nghệ phôi bũ 2007-2010 dung dịch chảy vào đồng thời vuốt nhẹ tõ chãp sõng tư cung xng th©n tư cung, høng dung dịch rửa vào chai - Sau rửa xong sừng tử cung bên này, thay Folley catheter tiếp tục tiến hành rửa sừng tử cung bên với bớc nh Rửa xong hai sừng, thụt rửa tử cung dung dịch sát trùng Lugol, Iodine kháng sinh, sau tiêm 5ml Lutalyse để phá thể vàng - Dung dịch thu đợc đợc a v phũng thớ nghim, tiến hành lọc phôi phễu lọc chuyên dụng soi tìm phôi kính hiển vi soi - Lọc dung dịch rửa phôi + Chuẩn bị dụng cụ lọc môi trờng lu phôi - Phễu lọc phơi vơ trùng - M«i tr−êng l−u phôi ( PBS 20% CS kháng sinh) - Mng lọc Microfinter ∅ 0,22µl lọc mơi trường lưu phơi, - Đa petri 90, a petri 30, kẻ ô vuông dới đĩa để giúp cho việc tìm phôi - Pipet 10 ml, pipet ml, Micropipet, - Đầu hút phôi chuyên dụng, đèn cồn, dao cắt chuyên dụng, bật lửa - KÝnh hiĨn vi soi nỉi - Ghi sè hiƯu bò vào thành đĩa đựng phôi + Tiến hành lọc phôi Lắc nhẹ chai dung dịch rửa phôi cho vào phễu lọc giữ lại khoảng 30-40ml dung dịch cho vào đĩa petri 90 (chú ý rửa chất nhầy bám đáy phễu lọc để tránh phôi sót bám dới đáy phễu) + Tìm lu phôi - Chuẩn bị ống hút phôi Đốt ống thuỷ tinh đèn cồn kéo dài dao cắt chuyên dụng để đờng kính ống vừa đủ cho hút phôi - Sau lọc phôi đa đĩa petri 90 lên kính hiển vi soi để tìm phôi Nguyễn Thị Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 - Dùng ống hút phôi chuyển phôi vào môi trờng l phôi( mPBS có chứa 20% CS) Phân loại phôi dới kính hiển vi soi - Phôi loại A: Rất tốt Đúng với giai đoạn phát triển, khối tế bào có hình cầu, tế bào liên kết chặt chẽ, màu sắc đặc trng - Phôi loại B: Tốt Đúng với giai đoạn phát triển, hình thái phôi tơng tự nh loại A (có khoảng dới 10 % tế bào thoái hoá) - Phôi loại C: Trung bình Đúng với giai đoạn phát triển, có số tế bào liên kết không chặt chẽ, có số túi nớc - Loại D: Xấu Kích thớc tế bào không đồng đều, có nhiều phôi bào đẩy ngoài, cã nhiỊu tói n−íc xt hiƯn cã 30-50% tÕ bµo tho¸i ho¸ Những phơi giai đoạn phát triển đạt tiêu chuẩn A, B sử dụng cho đông lnh v cy truyn Riêng phôi loại D sử dụng cho việc cấy phôi tơi mà không dùng cho việc đông lạnh phôi Sau thu hoạch phôi cho bò nghỉ 1-2 tuần ( sau 28-35 ngy k t đặt CIDR đợt trước) tiÕp tơc g©y rơng trøng nhiều thu phôi đợt Nguyn Th Thoa Cụng ngh phụi bũ 2007-2010 iV Sơ đồ Minh hoạ quy trình sản xuất phôi invivo cải tiến Bò sữa cao sản Đặt CIRD cho bò Kiểm tr bò động duc Thu hoạch phôi Chuẩn bị Hocmon Tiêm Hocmon Phối giống cho bò Soi tìm phôi Nguyn Th Thoa – Cơng nghệ phơi bị 2007-2010 Đánh giá phân loại phôi Phôi nang loại A Phôi chậm phát triển Phơi dâu loại A Phơi thối hố Trứng khơng thụ tinh