Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft Word 1 53 doc 0 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT *** *** CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN Đ[.]
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -*** - BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT -*** - CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN (Mã số: CNSH.ĐT.07-10) Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS Đào Đức Thà Viện Chăn ni 8249 Hà Nội - 2010 BỘ NƠNG NGHIỆP VÀ PTNT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Viên Chăn Nuôi Độc lập - Tự - Hạnh phúc Hà nội, ngày 20 tháng 09 năm 2010 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài/dự án: “ Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo nhân giống lợn” Mã số đề tài: CNSH ĐT Thuộc: “Chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020’’ Chủ nhiệm đề tài/dự án: Họ tên: Đào Đức Thà Ngày, tháng, năm sinh: 1/3/1955 Nam/Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sỹ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Phó Bộ mơn Sinh lý-Sinh hóa tập tính vật ni Điện thoại: Tổ chức: 0438385940 Nhà riêng: 0437222293 Mobile: 09032222229 Fax: 0438389775…… E-mail: bacsitha@yahoo.com Tên tổ chức công tác: Viện Chăn nuôi Địa tổ chức: Thuỵ phương- Từ Liêm-Hà nội Địa nhà riêng: Nhà số 30, ngõ 267, Hoàng Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Chăn Ni Điện thoại: 0438389267 Fax: 0438389775 E-mail: niah@netnam.vn Website: http://www.vcn.vnn.vn Địa chỉ: Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Hoàng Văn Tiệu Số tài khoản: 301010051 Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Huyện Từ Liêm - Hà Nội Tên quan chủ quản đề tài: Bộ Nông Nghiệp PTNT II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực đề tài/dự án: - Theo Hợp đồng ký kết: Từ tháng năm 2007 đến tháng 12 năm 2010 - Thực tế thực hiện: Từ tháng năm 2007 đến - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … 2 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2500…tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: …2500….tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: 0…….tr.đ + Tỷ lệ kinh phí thu hồi dự án (nếu có): ………… + Kinh phí bổ xung từ nguồn kinh phí nghiệp khoa học Chương trình Công nghệ sinh học nông nghiệp cho nội dung tăng cường trang thiết bị: 122tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Số Theo kế hoạch Ghi Thực tế đạt Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) 2007 700 2007 700 700 2008 800 2008 922 922 2009 900 2009 900 900 2010 100 2010 100 100 TT c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài Số Nội dung TT khoản chi Đơn vị: Triệu đồng Theo kế hoạch Tổng SNKH 600,15 600,15 Thực tế đạt Nguồn khác Tổng SNKH 600,15 600,15 Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguồn khác Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa 1429,13 1429,13 1429,13 1429,13 145,155 145,155 145,155 145,155 70 70 70 70 Chi khác 365,14 365,14 365,14 365,14 Tổng cộng 2622 2622 2622 2622 nhỏ - Lý thay đổi (nếu có) Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban TT hành văn Tên văn Số 3876 QD/BNN- Quyết định phê duyệt, tổ chức, mục tiêu, ĐKHCN ngày dự kiến kết quả, kinh phí thời gian thực 19/12/2006 đề tài thực từ năm 2007 “Chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020” Số 2135 BNN- Thông báo kế hoạch vốn nghiệp khoa KHCN ngày học đợt năm 2007 19/4/2007 Ghi Số 3451 BNN- Thông báo điều chỉnh đề tài thuộc chương KHCN ngày trình CNSH năm 2006 2007 3/7/2007 Số 3502 QĐ-BNN- Quyết định tổ thẩm định đề tài, dự án thực KHCN ngày năm 2008 thuộc “Chương trình trọng 7/11/2007 điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020” Số 6592 BNN- Thông báo bổ xung kế hoạch khoa học KHCN ngày công nghệ năm 2008 7/11/2008 Số 2620 QĐ-BNN6 Quyết định phê duyệt kế hoạch đấu thầu “ TC ngày 13/11/2008 Tăng cường trang thiết bị năm 2008 Viện Chăn Nuôi Quốc gia Số 3730 QĐ-BNN- Quyết định phê duyệt danh mục đề tài, KHCN ngày dự án khoa học công nghệ cấp Bộ 26/11/2008 Tổ chức phối hợp thực đề tài, dự án: Số Tên tổ chức Tên tổ chức Nội dung TT đăng ký theo tham gia tham gia Thuyết minh thực chủ yếu Phịng Thí Phịng Thí Nghiệm Trọng Nghiệm Trọng Điểm-VCN Điểm-VCN Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* Gây động dục đồng pha Công nghệ phục vụ lấy phôi cấy phôi invivo phôi Tạo phôi lợn invitro thụ tinh ống nghiệm, đông lạnh phôi invivo, invitro Bộ môn sinh Bộ môn sinh sản TTNT - sản TTNT - VCN VCN Công nghệ Đã nghiên cứu phối chế tinh 500 lít mơi trường pha lỗng bảo tồn dài ngày (5-7) ngày) Có tinh lợn đông lạnh dạng cọng rạ hoạt lực > 35% 59 lợn sinh từ phối giống tinh đông lạnh Trung tâm Trung tâm Quản lý Công nghệ phôi invitro N/C bảo tồn N/C bảo tồn chăm sóc Đã quản lý chăm sóc tốt vật ni-VCN- vật ni-VCN- lợn thí đàn lợn thí nghiệm Trung tâm Trung tâm nghiệm, theo dõi lợn sinh từ giống vật nuôi giống vật nuôi theo dõi cấy phôi - Hà Nội - Hà Nội lợn sinh Trường ĐH Trường ĐH Tạo phôi Tạo phôi lợn thụ tinh KHTN TP KHTN TP invitro ống nghiệm tinh tươi Hồ Chí Minh Hồ Chí Minh - Lý thay đổi (nếu có) Cá nhân tham gia thực đề tài, dự án: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân Nội dung đăng ký theo tham gia tham gia Thuyết minh thực Sản phẩm chủ yếu Ghi đạt chú* Th.S Nguyễn Th.S Tạo phôi Phôi lợn invivo cho Thị Thoa Nguyễn Thị invivo, cấy phôi, phôi lợn Thoa invitro thụ tinh ống nghiệm, đông lạnh phôi invivo invitro T.S Đào Đức T.S Đào Đông lạnh Tinh lợn đông lạnh Thà Đức Thà tinh dạng cọng rạ lợn sinh từ phối giống tinh đông lạnh Th.S Lưu Cơng Th.S Lưu Cấy phơi Có lợn sinh Khánh Công Khánh từ cấy phôi T.S Nguyễn T.S Nguyễn Gây động Có lợn động dục Văn Lý Văn Lý dục đồng đồng pha đạt tiêu pha phục vụ chuẩn lấy phôi lấy phôi cấy phôi cấy phôi Th.S Đỗ Hữu Th.S Đỗ Mơi trường Hoan Hữu Hoan lợn dài ngày pha lỗng bảo tồn 500 lít mơi trường dài ngày (7-10) ngày) T.S Phan Văn T.S Phan Thử nghiệm Có lợn sinh Kiểm Văn Kiểm phối giống từ môi trường lợn môi trường dài ngày tinh lợn dài đông lạnh ngày, tinh đông lạnh Th.S Th.S Tạo phôi Phôi lợn invivo cho Nguyễn Khánh Nguyễn invivo, cấy phôi, phôi lợn Vân Khánh Vân invitro thụ tinh ống nghiệm, đông lạnh phôi invivo invitro Th.S Phan Kim Th.S Phan Tạo phôi Tạo phôi lợn thụ Ngọc invitro tinh ống nghiệm Kim Ngọc tinh tươi T.S Đỗ Kim C.N Đỗ Văn Gây động Tuyên Hương Có lợn động dục dục đồng đồng pha đạt tiêu pha phục vụ chuẩn lấy phôi lấy phôi cấy phôi cấy phôi 10 T.S Phạm Công T.S Phạm Ni dưỡng Có lợn đạt tiêu Thiếu Cơng Thiếu lợn thí chuẩn thí nghiệm nghiệm - Lý thay đổi (nếu có) Tình hình hợp tác quốc tế: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa Ghi TT điểm, tên tổ chức hợp tác, số điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, chú* đoàn, số lượng người tham gia ) số lượng người tham gia ) - Đoàn 02 người -Học tập thụ tinh ống nghiệm, -Học tập thụ tinh ống cấy truyền phôi đông lạnh nghiệm, cấy truyền phôi tinh dịch lợn đông lạnh tinh dịch lợn -Từ 18/6/2007 đến 06/7/2007 -Từ 18/6/2007 đến 06/7/2007 -Tại Trung tâm nhân giống quốc -Tại Trung tâm nhân giống gia Nhật Bản quốc gia Nhật Bản -Kinh phí:97,85 triệu đồng -Kinh phí:97,85 triệu đồng -02 người - Đoàn 01 người -02 người Thực tập Cộng hồ Pháp 01 -Thực tập cơng nghệ sinh sản người Kinh phí:103,22 triệu lợn đồng -Từ 02/11/2008 đến 10/11/2008 -Tại Trung tâm bảo tồn tế bào gốc quốc gia Đài loan -Kinh phí:103,22 triệu đồng Lý thay đổi (nếu có): Theo kế hoạch Kế hoạch Thực tập Cộng hồ Pháp 01 người khơng đủ kinh phí Trung tâm bảo tồn tế bào gốc quốc gia Đài Loan có đủ điều kiện để thực tập theo nội dung đề (có định Bộ đồng ý thay đổi địa điểm) Trứng sau ni chín NCSU-37/PFF(IVM1,IVM2) chọn tế bào trứng chín cho thơ tinh èng nghiƯm 2.2 Hoạt hoá tinh trùng - Pha M 199 Earl-salts nước cất khử ion, bổ sung NaHCO3 Hepes, Dglucose, Calcium lactacte, PFF hc CS kháng sinh - Lấy 8ml môi trường 199cho vào ống Falcon (1), - Lấy 200 µl mơi trường ống Falcol (1) cho vào ống Falcon(2), ủ ấm ống nước ấm 37˚C - Lấy cọng rạ tinh đông lạnh khỏi bình nitơ cho vào nước ấm 37˚C 30 giây, cắt đầu cọng rạ cho tinh trùng vào ống Falcol (1) ly tâm 2000v/phút phút, hút bỏ phần lấy phần cặn Bổ sung 60µl 199- ống Falcon (2) cho vào ống Falcon (1) trộn đều, lấy 60 µl cho vào đĩa θ 35mm phủ dầu khoáng cho vào tủ incubator ủ 15 phút - Tính nồng độ tinh trùng cần cho thụ tinh, đếm số lượng tinh trùng buồng đếm Thoma, pha loãng tinh trùng môi trường Pig-FM điều chỉnh số lượng tinh trùng (1.000.000 tinh trùng/ 1ml ) 2.3 Thụ tinh in vitro - Môi trường thụ tinh ống nghiệm Pig-FM có bổ sung caffeine anhydrous BSA (fatty acid free - Sigma) - Trứng sau nuôi chứng invitro dội rửa lần mơi trường Pig-FM, sau chuyển sang giọt (Pig-FM) cho vào tủ ni cấy 38,5˚C có 5% CO2 ẩm độ tối đa - Lấy 10µ dung dịch tinh trùng hoạt hoá cho vào giọt thụ tinh (Pig-FM có tế bào trứng) - đ tinh trùng trứng 38,5˚C có 5% CO2, ẩm độ tối đa 172 - Sau giờ, rửa hợp tử giả định lần môi trường IVC1 (IVCPyruvat lactac) để loại bỏ tế bào cumulus tinh trùng bám vào màng suốt 2.4 Nuôi cấy phôi in vitro - Sau hợp tử loai bỏ tế bào cumulus chuyển hợp tử giả định vào môi trường IVC1 (NCSU-37 - 0,17 mM Na pyruvate 2,73 mM Na Lactate) nuôi tủ 38,5˚C cú 5% CO2, ẩm độ tối đa ngày (48 tiếng) - Sau ngày chuyển phôi sang môi trường VC2 (NCSU-37 - 5,55 mM D-Glucose) nuôi tủ 38,5˚C cú 5% CO2, ẩm độ tối đa ngày Ngày thứ thu hoạch phôi Sơ đồ minh hoạ tạo phôi ống nghiệm( in-vitro) 1.Thu trứng 4.Hoạt hố tinh trùng tạo giọt ni trứng ni trứng chín Thụ tinh ống nghiệm Ni phụi ng nghim 173 Phơng pháp TO PHễI LN IN-VIVO Chọn lợn cho phụi - Con cho phụi cần phải thoả mãn tất yêu cầu kiểm soát bệnh tật di truyền cho việc sử dụng phơi chúng - Con cho phải có sinh lý phù hợp để chịu phối giống Đặc biệt chân sau phải khoẻ mạnh - Con cho cần phải thoả mãn tất yêu cầu để gây động dục - Con cho phải đủ khoẻ để thực phẫu thuật Gây động dục cho lợn cho phôi Tiêm eCG hCG cho lợn - Tiêm tiêm da eCG (1000 UI) - Tiêm tiêm da hCG (500 UI) 72 sau tiêm eCG Theo dõi động dục, phối giống Theo dõi dấu hiệu động dục chịu đực lợn nái gây động dục phối giống tự nhiên hay dẫn tinh - Chuẩn bị tinh trùng Nếu thụ tinh nhân tạo phối giống tự nhiên, phải chọn đực giống tốt có lý lịch rõ ràng đảm bảo tất yêu cầu kiểm soát bệnh tật di truyền cho việc sử dụng tinh trùng chúng Khi phát lợn chịu đực vào buổi sáng cho lợn nhảy trực tiếp hay dẫn tinh lần thứ thực buổi sáng lần thứ hai vào cuối buổi chiều ngày Khi phát lợn chịu đực vào cuối buổi chiều cho lợn đực nhảy trực tiếp hay dẫn tinh lần thứ nên thực lần thứ hai vào buổi sáng ngày hôm sau 174 Nếu lợn nái tiếp tục chịu đực, cho lợn nhảy trực tiếp hay dẫn tinh lần thứ ba 4.Thu hoạch phôi Thu phôi lợn vào ngày thứ sau phối giống 4.1 Chuẩn bị dụng cụ hoá chất cần thiết Tên Hộp nhựa tổng hợp Mục đích phương pháp sử dụng Để vận chuyển ống dẫn trứng tử cung phịng thí nghiệm Túi nhựa Để đựng ống dẫn trứng tử cung Dán tên lợn nái…lên túi nhựa Kéo Để cắt ống dẫn trứng tử cung Dụng cụ làm ấm Được làm ấm để hộp vận chuyển để giữ ống dẫn trứng tử cung ấm lúc vận chuyển Găng tay phẫu thuật Để cắt tỉa ống dẫn trứng tử cung Kimwipe Để rửa ống dẫn trứng tử cung Khay Để đựng ống dẫn trứng tử cung Giá thép (3 chân, loại lớn) Treo tử cung giá lúc dội rửa Được trang bị kẹp phận giữ phễu lọc Emcon (xem hình mơ tả bài) Panh (3 chiếc) Để treo tử cung lúc dội rửa Bơm tiêm 50ml Để bơm dung dịch dội rửa Catheter PP Để dội rửa ống dẫn trứng Tổng chiều dài 14,5cm, cắt khoảng 5cm trước dùng Dung dịch dội rửa PBS bổ xung huyết hay BSA Cốc lọc Emcon Dùng bước cuối dung dịch dội rửa để thu phôi từ dung dịch Chậu Đặt cốc lọc Emcon Đĩa 90 x 20mm Dùng để tìm phơi Trước dùng, kẻ vng đáy Kính hiển vi soi Dùng để tìm phơi Buồng vơ trùng Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tủ nuôi cấy CO2 Để nuôi cấy phôi Môi trường nuôi cấy Để nuôi cấy phôi 175 Phin lọc vô trùng Bơm tiêm 10ml Pippete thao tác phơi Đĩa nhiều giếng Dầu khống Cồn 70% Sổ ghi chép Để lọc vô trùng môi trường nuôi cấy Để lọc vô trùng dung dịch Để rửa phôi Làm từ pipptet pasteur Để nuôi cấy phôi Để ngăn môi trường nuôi cấy bay Để lau bàn thí nghiệm, dụng cụ… Để ghi chép 4.2 Thu phôi ống dẫn trứng tử cung - Ngay sau lợn nái mổ thịt, nhanh chóng lấy buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung âm đạo (vị trí cắt khơng quan trọng) đặt chúng vào túi nhựa Đặt túi nhựa vào hộp nhựa tổng hợp, bảo quản ấm - Cắt tỉa ống dẫn trứng tử cung, ghi chép số lượng thể vàng Sau quan sinh sản đưa phịng thí nghiệm, lấy chúng khỏi túi nhựa đặt chúng lên khăn Kimwipe trải sẵn khay Rửa qua máu cắt phần không cần thiết cho trình dội rửa Xem xét buồng trứng ghi chép số thể vàng… - Dội rửa ống dẫn trứng Chỉ cắt ống dẫn trứng, đặt catheter PP (cắt bớt khoảng 5cm) qua hình phễu vào ống dẫn trứng, giữ ngón tay để ngăn dung dịch rị rỉ Bơm khoảng 20ml dung dịch(PBS bổ sung kháng sinh) dội rửa qua catheter PP, thu phôi trực tiếp vào đĩa 90mm - Dội rửa tử cung - Sử dụng panh, giữ thân tử cung màng treo tử cung gần ống dẫn trứng treo quan sinh dục lên giá đỡ thép - Tạo vết cắt tử cung cắt tỉa phần đừờng thẳng Sau lau máu, cắt tử cung gần thân tử cung Trong giữ chỗ cắt để 176 ngăn dung dịch từ tử cung ngồi, đặt chỗ cắt vào cốc lọc Emcon, cốc lọc đặt bên giá đỡ - Bơm 20ml dung dịch qua hình phễu Chỉ dội rửa ống dẫn trứng, sử dụng catheter PP cắt với độ dài thích hợp Hình dạng tử cung ngoằn ngèo, nên xoa sừng tử cung từ phía đầu phía tử cung dung dịch dội rửa chảy xuống Thu dung dịch qua cốc lọc Emcon Tiếp theo, sử dụng kéo để tạo vết cắt phần sừng tử cung, sử dụng bơm tiêm để bơm 20ml dung dịch dội rửa trực tiếp vào sừng tử cung Thu dung dịch trực tiếp vào đĩa 90mm - Tìm phơi: Tìm phơi kính hiển vi soi chuyển phôi vào môi trường nuôi nhanh tốt Sơ đồ tóm tắt phương pháp tạo phụi lợn in-vivo Lập kế hoạch gây động dục cho lợn cho phôi Chọn lợn cho phôi Gây động dục Theo dõi động dục Phối giống hay dẫn tinh Thu hoạch phôi 177 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN LOẠI PHƠI Việc đánh giá phõn loại chất lượng phơi lợn cần thiết dùa hỡnh thỏi kớch thước giai đoạn phát triển phụi Hiện để đánh giá chất lượng phơi lợn th«ng dơng dùng kính hiển vi để kiểm tra tình trạng để đánh giá chất lượng I DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT Tên dụng cụ Kính hiển vi soi Mục đích phương pháp sử dụng Sử dụng với độ phóng đại tối đa (40x-50x) để đánh giá chất lượng Kính hiển vi đảo ngược Để đánh giá chất lượng Kính hiển vi chụp ảnh Để chụp ảnh tình trạng phơi Đĩa sưởi ấm kính hiển vi Để giữ ấm phơi chúng kính hiển vi Máy ổn nhiệt Để giữ ấm phôi chúng bàn phịng thí nghiệm Buồng vơ trùng Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Sử dụng để nuôi cấy Tủ nuôi cấy CO2 Môi trường nuôi cấy Sử dụng để nuôi cấy Phin lọc vô trùng Bơm tiêm 10ml Pippete thao tác phơi Đĩa nhiều giếng Dầu khống Cồn 70% Sổ ghi chép Để khử trùng mô trường nuôi cấy thông qua áp suất lọc Dùng cho phin lọc để lọc vô trùng dung dịch Để rửa phôi Làm từ pippete pasteur Để nuôi cấy phôi Để ngăn môi trường nuôi cấy bay Để hộp, dùng để lau bàn thí nghiệm, dụng cụ… Để ghi chép II PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN LOẠI 2.1 Các giai đoạn đặc điểm phát triển phôi lợn Số ngày Giai đoạn phát tuổi triển Đặc điểm 178 1 tế bào Phải phân biệt với trứng không thụ tinh Tế bào chất có chiều giọt lipid, làm cho phơi có màu đen Nếu thể cực tìm thấy, chắn trứng thụ tinh 2 tế bào 4-8 tế bào Phân chia đồng Phân chia đồng Phôi di chuyển xuống tử cung thời điểm Phôi dâu chặt Ở lợn, co chặt tế bào diễn giai đoạn 4-8 tế bào Điều dẫn đến giai đoạn phôi nang sớm Phôi nang Trong giai đoạn từ hình thành xoang phơi bào đến xoang chiếm nửa thể tích phơi, phơi nang gọi phôi nang sớm Từ thời điểm đến tế bào lấp đầy toàn khoảng trống màng suốt màng nỗn hồng gọi phôi nang Phôi nang dãn nở Ở giai đoạn này, xoang giãn nở màng suốt giảm độ dày Phơi đơi khỏi màng suốt đầu giai đoạn Phơi nang Giai đoạn bắt đầu sau phơi màng khỏi màng suốt Phôi đạt đến giai đoạn sử dụng cho cấy truyền để đề phòng lây truyền bệnh tật 2.2 Đánh giá phân loại theo chất lượng Loại A (rất tốt) Khơng có bất thường hình dạng phơi hay khơng 179 có tế bào riêng rẽ Phát triển bình thường Loại B (tốt) 10-20% tế bào nhơ ngồi hay thối hố Loại C (trung bình) 30-50% tế bào nhơ ngồi hay thối hố Loại D (kém) Phơi bị biến hình dạng, phát triển chậm, 50% tế bào bất bình thường Loại E (không thụ Trứng không thụ tinh, trứng thối hố, khơng có tinh, nhiều mạnh vụn) bên màng suốt Ảnh 1: Tế bào trứng thụ tinh tế bào (1 ngày tuổi) 180 Ảnh 2: Phôi tế bào (2 ngày tuổi) Ảnh 3: Phôi 4-8 tế bào (3 ngày tuổi) Ảnh 4: Phôi dâu chặt (4 ngày tuổi); Một số bắt đầu hình thành xoang Ảnh 5: Phơi nang (5 ngày tuổi) Ảnh 6: Phơi nang giãn nở màng (6 ngày tuổi) 181 Ảnh 7: Phôi nang giãn nở màng (6,5 ngày tuổi) Ảnh 8: Phơi nang màng (7 ngày tuổi) Ảnh 10: Phân chia khơng bình thường (thu ngày sau động dục, tinh trùng tìm thấy Ảnh 9: Phơi nang kéo dài (15 ngày màng suốt Đây coi mảnh vụn) tuổi) 182 Ảnh 11: Phơi thối hố PHƯƠNG PHÁP ĐƠNG LẠNH, GIẢI ĐƠNG PHƠI LỢN (Phương pháp đông lạnh với glyerol sử dụng làm chất bảo vệ lạnh) I CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ DỤNG CỤ 1.1 Chuẩn bị môi trường đông lạnh 1) Dung dịch A PBS + 20% Huyết bê +0,01% Kháng sinh 2) Dung dịch B: 3M glyceril Lấy 7,4ml dung dịch A + 2,1 ml Glycerol 3) Dung dịch C: 1M Sucarose 183 Lấy 3,423 g Sucarose + 10 ml PBS 4) Môi trường đông lạnh: 2ml Môi trường B + 1ml Môi trường A + 1ml Môi trường C Tất môi trường phải lọc vô trùng Microfiltre 1.2: Chuẩn bị máy móc, thiết bị - Chọn chương trình đơng lạnh cài đặt máy - Rót nitơ lỏng vào bỡnh chứa nitơ, cẩn thận đậy nắp buồng đông lạnh đạt vào bể chứa nitơ - Nối buồng đông lạnh với máy đông lạnh CL-2000 - Bật phận kiểm soỏt nhiệt nốt hold - Nối phận kiểm soát nhiệt vào tới nguồn điện bật điện - Ấn nút Reset để cài đạt CL-2000 bắt đầu chương trỡnh chọn phận kiểm soỏt nhiệt đưa buồng đông lạnh nhiệt độ bắt đầu trỡ đến chọn Run - Khi buồng đơng lạnh đạt tới nhiệt độ bắt đầu mong muốn (-6,5˚C) đổ nitơ lỏng đến mức đầu cọng rạ - Máy tự động chạy đến -35˚C ( để 11 phút) lấy cọng rạ cho vào bỡnh nitơ lỏng – 196 ˚C bảo quản lâu dài II ĐƠNG LẠNH PHƠI LỢN 2.1 Đưa phơi cọng rạ Lựa chọn phôi lợn tốt loại A,B với giai đoạn phát triển để đông lạnh Sử dụng bút đánh dấu để viết thông tin cần thiết lên phần cọng rạ Rửa bên cọng rạ 2-3 lần dung dịch đông lạnh Hãy đảm bảo dung dịch đông lạnh không chạm vào nút chận cotton Sau hút dung dịch đơng lạnh vào cọng rạ hình 184 Hình 1: Sắp xếp dung dịch đông lạnh cọng rạ Hút phôi (10-20 phôi/cọng rạ) từ đĩa dung dịch đông lạnh chứa phơi nhiệt độ phịng (khoảng 200C) Sau gắn cọng rạ bột cọng rạ hay polysealer hay chất khác 2.5 Đông lạnh phôi Khi phôi bắt đầu chuyển vào dung dịch đông lạnh, sử dụng đồng hồ để theo dõi thời gian bắt đầu đông lạnh (5 phút sau phôi để cọng rạ) Đặt cọng rạ vào máy đông lạnh, nhiệt độ máy đơng lạnh – 6,50C Ngay sau đó, bật chương trình đơng lạnh, chương trình cài đặt trước Trong vịng phút sau cọng rạ có phơi đặt vào buồng đơng lạnh – 6,50C, tiến hành tạo đá Việc tạo đá phải thực nhanh cách sử dụng panh làm lạnh trước cách nhúng vào nitơ lỏng, dùng panh để cặp phần cọng rạ có phơi, sau theo dõi để kiểm trả phát triển tinh thể đá Cọng rạ giữ –6,50C 10 phút, sau hạ nhiệt độ xuống –350C với tốc độ 0,30C/phút Khi nhiệt độ hạ xuống –35, giữ nhiệt độ thêm 11 phút trước chuyển cọng rạ có phơi vào bình nitơ lỏng -1960C Q trình đơng lạnh kết thúc 185 III PHƯƠNG PHÁP GIẢI ĐƠNG PHƠI (Giải đơng loại bỏ glycerol thơng qua pha lỗng nhiều bước) - Dung panh để lấy cọng rạ khỏi bình nitơ lỏng - Để giải đơng phơi, giữ cọng rạ khơng khí khoảng giây, - Sau đặt cọng rạ vào nước ấm (20-300C) - Sử dụng hay vải mềm để lâu nước bề mặt cọng rạ - Sử dụng kéo cắt cọng rạ phần cọng rạ hàn, sau cắt phần nỳt bụng phơi cọng rạ chảy vào đĩa petri dung dịch đông lạnh - Tiếp theo chuyển phôi vào thứ tự dung dịch pha loãng bước, bước phút để loại bỏ glycerol Sau rửa phơi lần dung dịch PB1 + 10% FCS - Sau loại bỏ gltcerol, chuyển phôi vào môi trường nuôi cấy để cấy cho lợn nái nhận Sơ đồ tóm tắt q trình giải đơng 0,75M Glycerol + 0,3 M sucrose 0,3 M sucrose 0,15 M sucrose PB1 + 10% FCS Xác nhận quan Chủ trì đề tài nhánh Th.S.Nguyễn Thị Thoa 186