Đánh giá sự phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ SỰ PHỐI HỢP TÁC NHÂN VI KHUẨN, VIRUS TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG NHẬP VIỆN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ SỰ PHỐI HỢP TÁC NHÂN VI KHUẨN, VIRUS TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG NHẬP VIỆN Chuyên ngành: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÝ VĂN XUÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu chúng tơi chưa cơng bố cơng trình khác Các tài liệu trích dẫn, số liệu nghiên cứu hoàn toàn trung thực theo yêu cầu luận văn Thạc sĩ Tác giả Lê Thị Huệ MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương viêm phổi mắc phải cộng đồng 1.2 Dịch tễ học nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng .7 1.3 Các kỹ thuật xác định nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng 13 1.4 Các cơng trình nghiên cứu có liên quan 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu .24 2.4 Các biến số định nghĩa biến số 32 2.5 Xử lý số liệu 32 2.6 Kiểm soát sai lệch 33 2.7 Vấn đề y đức 33 Chương 3: KẾT QUẢ .34 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 34 3.2 Tác nhân vi khuẩn, virus gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 36 3.3 Mối liên quan nhóm tuổi giới tính với tác nhân phối hợp gây viêm phổi mắc phải cộng đồng .42 Chương 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 46 4.2 Tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn với vi khuẩn, vi khuẩn với virus virus với virus bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng phát bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR 48 4.3 Mối liên quan nhóm tuổi giới với phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus gây viêm phổi mắc phải cộng đồng .60 4.4 Hạn chế nghiên cứu tính ứng dụng đề tài 61 KẾT LUẬN 62 KIẾN NGHỊ .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ Ý nghĩa AFB Acid Fast Bacillus Trực khuẩn kháng acid CAP Community-acquired pneumonia Viêm phổi mắc phải cộng đồng CAP/COPD Viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh nhân COPD CMV Cytomegalovirus PVL Panton-Valentin Leucocidin Staphylococcus aureus sinh độc tố PVL COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng kháng Methicillin MRSCN Methicillin-Resistant Staphylococci Coagulasenegative Tụ cầu coagulase âm kháng Methicillin MRSE Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis S epidermidis kháng Methicillin PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi RSV Respiratory syncitalvirus Virus hợp bào hô hấp VK Vi khuẩn VKCĐ Vi khuẩn cộng đồng VKKĐH VI khuẩn không điển hình VKBV Vi khuẩn bệnh viện VPMPCĐ Viêm phổi mắc phải cộng đồng VR Virus World Health Organization WHO Tổ chức y tế giới i DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 34 Bảng 3.2 Tỷ lệ tác nhân phát kỹ thuật multiplex real-time PCR 36 Bảng 3.3 Tỷ lệ phân bố đơn tác nhân tỷ lệ phối hợp vi khuẩn, virus bệnh nhân VPMPCĐ 39 Bảng 3.4 Tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus phân lập bệnh nhân VPMPCĐ 40 Bảng 3.5 Mối liên quan nhóm tuổi với tác nhân phối hợp vi khuẩn – vi khuẩn gây VPMPCĐ 42 Bảng 3.6 Mối liên quan nhóm tuổi với tác nhân phối hợp vi khuẩn – virus gây VPMPCĐ 42 Bảng 3.7 Mối liên quan nhóm tuổi với tác nhân phối hợp virus – virus gây VPMPCĐ 43 Bảng 3.8 Mối liên quan giới tính với tác nhân phối hợp vi khuẩn – vi khuẩn gây VPMPCĐ 44 Bảng 3.9 Mối liên quan giới tính với tác nhân phối hợp vi khuẩn – virus gây VPMPCĐ 44 Bảng 3.10 Mối liên quan giới tính với tác nhân phối hợp virus – virus gây VPMPCĐ 45 i DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 34 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo tuổi giới tính 35 Biểu đồ 3.3 Phân bố tác nhân vi khuẩn virus tổng số tác nhân vi sinh phân lập 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát 24 Hình 2.2 Quy trình xét nghiệm real-time PCR đàm 25 Hình 2.3 Bệnh phẩm đàm 26 Hình 2.4 Đánh giá độ tin cậy bệnh phẩm đàm 27 Hình 2.5 Đánh giá tác nhân vi khuẩn tiêu nhuộm Gram 28 Hình 2.6 Quy trình multiplex real-time PCR phát tác nhân vi sinh gây VPMPCĐ 29 Hình 2.7 Biểu đồ khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang 31 Hình 2.8 Các tác nhân phát kỹ thuật multiplex real-time PCR 32 Hình 3.1 Sự phân bố tác nhân vi khuẩn, virus gây VPMPCĐ 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh thường gặp nguyên gây tử vong giới Cho đến nay, có nhiều tiến chẩn đốn điều trị viêm phổi mắc phải cộng đồng xếp hàng thứ tư số 10 nguyên hàng đầu gây tử vong toàn cầu vào năm 2010 [48] Viêm phổi mắc phải cộng đồng tình trạng viêm phổi xảy bệnh viện 48 đầu sau nhập viện [18], bệnh lý thường gặp phổ biến lứa tuổi Tỷ lệ mắc viêm phổi mắc phải cộng đồng nước phát triển cao gấp lần so với nước phát triển Ở Việt Nam, viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh lý nhiễm khuẩn thường gặp bệnh nhiễm khuẩn thực hành lâm sàng, chiếm 12% bệnh phổi [4] Năm 2018, tỷ lệ mắc viêm phổi nước ta 698,7/100.000 người dân, đứng hàng thứ hai sau tăng huyết áp, tỷ lệ tử vong viêm phổi 1,15/100.000 người dân, đứng hàng thứ hai nguyên nhân gây tử vong sau đái tháo đường [1] Các nguyên gây viêm phổi thường gặp Streptoccocus pneumoniae, Haemophilius influenzae, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydophila pneumoniae loại virus Rhinovirus, Parainfluenzavirus 1-3, Influenzavirus A, Respiratory syncital virus …[11], [19], [22] Các nguyên gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng phân bố khác tuỳ thuộc nước khu vực địa lý Từ dịch SARS xuất vào năm 2003, sau dịch cúm gia cầm A/H5N1 (2005), đại dịch cúm A/H1N1 (2009), đến đại dịch SARS Cov (2019), virus biến thể liên tục xuất coi tác nhân gây bệnh quan trọng viêm phổi mắc phải cộng đồng Chúng thường gây diễn biến nặng, nhanh dẫn đến tử vong Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC ĐÁNH GIÁ MẪU ĐÀM [18] Mẫu đàm gồm có đàm chất có chứa đàm dịch hút đàm khí quản qua đường mũi, dịch hút phế quản qua nội soi… ❖ Đánh giá đại thể mẫu đàm: Ghi nhận tính chất đại thể mẫu đàm, bao gồm: - Có nhiều nước bọt khơng? - Có mủ (purulent) khơng, màu xanh hay vàng đục? - Có mủ nhầy (muco-purulent) khơng? - Có nhầy (mucoid) khơng? Mẫu có lẫn nhiều nước bọt mẫu khơng thích hợp để khảo sát ni cấy PCR ❖ Khảo sát vi thể: - Dùng que tre/gỗ, vịng cấy hay pipette Pasteur lấy đàm từ vùng nhầy mủ, trải thành phết 2x3 cm lam kính Để khơ tự nhiên, sau tiến hành nhuộm Gram (Phụ lục 2) - Khảo sát kính hiển vi quang trường 100x Tìm vùng nhầy nhớt ghi nhận số lượng tế bào vẩy (squamous cells) tế bào có góc cạnh tế bào bạch cầu hay tế bào mủ (leukocyte hay purulent cells) tế bào tròn nhỏ bắt màu đậm tồn tế bào - Mẫu khơng thích hợp mẫu có số lượng tế bào vẩy > 25 tế bào/1 quang trường 100x Mẫu tin cậy mẫu có nhiều bạch cầu hay tế bào mủ, > 25 tế bào quang trường 100x Nói chung, mẫu tin cậy mẫu có nhiều tế bào bạch cầu (≥ 25 tế bào), tế bào vẩy (≤ 10 tế bào), tỷ lệ tế bào bạch cầu/tế bào vẩy tốt ≥ 2,5 - Để dễ dàng khách quan, dùng thang điểm Barlett đánh giá mẫu đàm, kết hợp quan sát đại thể lẫn vi thể điểm: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ❖ Sử dụng thang điểm Barlett để đánh giá mẫu đàm: - Số lượng bạch cầu/quang trường x100: • < 10 bạch cầu điểm • 10 – 25 bạch cầu + điểm • > 25 bạch cầu + điểm - Nhầy mủ + điểm - Số lượng tế bào vẩy/quang trường x100: • 10 – 25 tế bào - điểm • > 25 tế bào - điểm Thang điểm để đánh giá cộng tất điểm ghi nhận từ mẫu đàm quan sát ghi nhận: • ≤ điểm: khơng tin cậy • – điểm: tin cậy vừa • ≥ điểm: đáng tin cậy Trong nghiên cứu chọn mẫu đàm đánh giá đáng tin cậy để tiến hành xét nghiệm đánh giá Sau đánh giá mẫu đàm: Quan sát vùng nhầy nhớt quanh tế bào bạch cầu để ghi nhận diện vi khuẩn theo bảng đây: Tính chất Cầu khuẩn Gram (+) xếp thành chùm Cầu khuẩn Gram (+) xếp chuỗi Trực khuẩn Gram (-) nhỏ Cầu khuẩn Gram (+) xếp đôi Cầu khuẩn Gram (-) xếp đôi Trực khuẩn Gram (-) lớn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Nghi vi khuẩn đích Stapphylococci Streptolococci Haemophilus Pneumococci M catarrhalis Trực khuẩn Gram (-) dễ mọc Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC QUY TRÌNH NHUỘM GRAM ĐÀM Theo Hướng dẫn thực hành kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng (Ban hành kèm theo Quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017 Bộ trưởng Bộ Y tế) Nguyên tắc Vi khuẩn bắt màu Gram âm hay Gram dương khác thành phần, cấu trúc vách tế bào vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều acid teichoic, chúng khơng bị ảnh hưởng tẩy màu cồn, giữ nguyên màu tím ban đầu vách tế bào không bị ảnh hưởng yếu tố tuổi, tác dụng kháng sinh Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ protein màng ngoài, lớp màng dễ bị phá hủy cồn tẩy màu, phức hợp tinh thể tím gentian - iod khơng bền, bị tẩy màu màu thay thuốc nhuộm khác Trang thiết bị, vật tư ❖ Trang thiết bị: - Tủ an toàn sinh học (ATSH) cấp - Kính hiển vi quang học - Máy ly tâm - Máy trộn, lắc - Ống vô trùng có nắp đậy - Đèn cồn, que cấy, lam kính, kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu - Pipet Pasteur vô trùng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ❖ Sinh phẩm hóa chất: - Bộ thuốc nhuộm Gram: + Methanol + Tinh thể tím: Hucker cải tiến, tinh thể tím Kopeloff + Dung dịch tẩy màu (Nhẹ nhất: Ethanol 95%; Trung bình: Cồn acid; Mạnh nhất: Aceton) + Hóa chất nhuộm lần 2: Safranin ❖ Carbon Fuschin: - Fuschin - Safranin Kopeloff - Dung dịch nước muối sinh lý vô trùng 0,9% Đảm bảo chất lượng - Các hóa chất dùng để nhuộm soi phải kiểm tra theo quy trình kiểm tra chất lượng, hóa chất, lưu lại kết sau kiểm tra - Cần có chủng chuẩn làm chứng: + Staphylococcus aureus ATCC 25923: cầu khuẩn Gram dương bắt màu tím đậm + Escherichia coli ATCC 25922: trực khuẩn Gram âm bắt màu hồng An toàn thực - Thực thao tác với mẫu bệnh phẩm tủ ATSH - Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân Nội dung thực a) Làm tiêu bản: - Chuẩn bị lam kính sạch, khơng xước vỡ, nhúng vào dung dịch ethanol 95% - Sử dụng kẹp gắp lam kính, để cồn, hơ lam kính lửa đèn cồn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Dán nhãn ghi thơng tin mẫu bệnh phẩm - Dùng bút viết kính khoanh trịn, đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm, mặt lam kính - Dàn tiêu theo hình xốy trơn ốc từ ngồi hình zíc zắc - Đối với bệnh phẩm dịch não tủy, dịch rửa phế quản dịch khác: + Ly tâm bệnh phẩm 3000 - 4000 vòng 10 phút, chắt bỏ nước + Dùng pipette Pasteur nhỏ - giọt bệnh phẩm lên lam kính, khơng dàn tiêu - Với bệnh phẩm nước tiểu: Lắc ống nước tiểu, lấy 10 µl bệnh phẩm phết lên lam kính, khơng dàn tiêu - Với bệnh phẩm từ tăm (que gịn): + u cầu lấy tăm bơng (que gịn) riêng + Trường hợp có tăm bơng (que gịn) bệnh phẩm, rũ tăm bơng (que gịn) nước muối sinh lý canh thang vô trùng, lăn tăm bơng (que gịn) vùng đánh dấu lam kính - Những bệnh phẩm mủ đặc: Làm mỏng tiêu lam kính khác + Đặt lam kính thứ hai lên lam kính phết tiêu + Kéo nhẹ nhàng lam kính thứ hai lam kính ban đầu + Nếu tiêu chưa đủ mỏng, tiếp tục lặp lại với lam kính khác - Trường hợp bệnh phẩm, bệnh phẩm khơ, hịa lỗng nước muối sinh lý, dàn tiêu - Bệnh phẩm mô, mảnh sinh thiết: Nghiền, cắt nhỏ bệnh phẩm, dàn tiêu - Bệnh phẩm từ môi trường nuôi cấy lỏng, nhỏ - giọt lên lam kính, dàn tiêu - Bệnh phẩm từ khuẩn lạc (khóm): Pha huyền dịch vi khuẩn, dàn tiêu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh b) Cố định tiêu bản: - Để tiêu khô tự nhiên tủ ATSH làm khô 60°C - Cố định tiêu bản: + Để lam kính lên máy sấy lam 60°C đến tiêu khô + Cố định nhiệt: Đưa tiêu ngang qua lửa đèn cồn – lần, lần – 10 giây + Để tiêu nguội + Cố định hóa chất: Nhỏ methanol phủ kín nơi dàn tiêu bản, để khô phút, không hơ lửa c) Phủ thuốc nhuộm - Phương pháp Hucker cải tiến: + Nhỏ dung dịch tím Gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, trì phút Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu vịi nước chảy nhẹ + Nhỏ dung dịch lugol, trì 30 giây Đổ dung dịch lugol, rửa tiêu vòi nước chảy nhẹ + Tẩy màu: Nhỏ cồn 90° lên tiêu bản, nghiêng nghiêng lại cồn chảy từ cạnh sang cạnh kia, màu tím lam kính vừa phai hết rửa nước ngay, loại bỏ hết cồn vòi nước chảy nhẹ + Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin safranin carbon fuchsin lên tiêu bản, trì khoảng 30 giây đến phút Đổ dung dịch, rửa vòi nước chảy nhẹ - Phương pháp Kopeloff cải tiến: + Nhỏ dung dịch tím Gentian phủ kín nơi dàn đồ phiến, sau thêm khoảng giọt Na2CO3, nghiêng nghiêng lại tiêu để trộn dung dịch, trì 15 – 20 giây, để đến phút + Nhỏ dung dịch Iod Kopeloff trì phút Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh + Nghiêng tiêu bản, tẩy màu tiêu hóa chất tẩy màu, rửa tiêu vòi nước chảy - Làm khô tiêu trước soi kính Diễn giải kết báo cáo a) Quan sát tiêu vật kính x10 x40 - Đánh giá tiêu tẩy màu chưa - Tùy theo mẫu bệnh phẩm mà màu tiêu khơng màu có màu Gram âm Nếu có mặt bạch cầu đa nhân (BCĐN), BCĐN phải bắt màu Gram âm hoàn toàn - Nếu quan sát thấy hình ảnh tế bào, xác định số lượng trung bình tế bào BCĐN tế bào biểu mô 20 – 40 vi trường Bỏ qua vi trường khơng có tế bào vi khuẩn khơng tính số lượng trung bình cho vi trường bỏ qua b) Chuyển sang vật kính dầu quan sát hình ảnh vi khuẩn tế bào - Với lam nhuộm trực tiếp từ bệnh phẩm quan sát 10 vi trường với bệnh phẩm nước tiểu, 20 - 40 vi trường với bệnh phẩm khác - Quan sát hình thể vi khuẩn vật kính dầu (x100) + Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn, + Kích thước: To/nhỏ, đồng đều/đa hình thái,… + Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím) + Cách xếp: Đứng đơn lẻ, xếp thành cặp, xếp thành chuỗi, xếp thành đám,… + Đếm số lượng mô tả loại tế bào vi khuẩn sau + Gram dương: • Cầu khuẩn xếp đơi (và chuỗi) • Cầu khuẩn xếp đám • Trực khuẩn lớn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • Trực khuẩn nhỏ • Trực khuẩn chia nhánh • Trực khẩn Coryneform + Gram âm: • Song cầu • Trực khuẩn • Trực khuẩn chia nhánh (hoặc đa hình thái) • Trực khẩn Coryneform Hình thể trung gian: Cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn + Tế bào nấm nảy chồi + Sợi giả + Bán định lượng kết nhuộm soi đánh giá dựa bảng sau: Tế bào biểu mô bạch cầu đa Vi khuẩn nấm nhân Số lượng*/Vật kính Mơ tả Số lượng*/Vật kính (x10) Mơ tả 1+ (hiếm) 30 Không quan sát thấy vi khuẩn/nấm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh * Số lượng đánh giá dựa trung bình số lượng tế bào/vi khuẩn/nấm từ 20 - 40 vi trường, không áp dụng tiêu nhuộm từ khuẩn lạc (khóm) Lưu ý (cảnh báo) - Tiêu không dày, không mỏng - Bắt màu rõ ràng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN VI SINH GÂY BỆNH TRONG MẪU ĐÀM HOẶC BỆNH PHẨM CĨ CHỨA ĐÀM [17] • Biểu đồ khuếch đại real time PCR: Trong kỹ thuật rea-time PCR, người làm xét nghiệm quan sát q trình nhân DNA ống phản ứng qua biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ có trục tung cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích, trục hoành chu kỳ nhiệt Mỗi chu kỳ khuếch đại gồm giai đoạn: (1) Giai đoạn ủ: số lượng DNA đích nhân thành chưa đủ để chất phát quang nhận ánh sáng kích thích, ánh sáng huỳnh quang phát khơng đủ cường độ để máy ghi nhận (2) Giai đoạn lũy thừa: cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt số lượng DNA đích tăng gấp đơi sau chu kỳ (3) Giai đoạn bình nguyên : mức tăng cường độ huỳnh quang ống phản ứng chậm dần đạt đến bình nguyên, phản ứng cạn dần dNTP enzyme Taq polymerase nên DNA đích khơng cịn tăng số lượng theo cấp số nhân Sau hoàn tất chu kỳ nhiệt thấy thông số quan trọng kèm với chu kỳ ngưỡng Ct (Threshold cycle) Thiết bị real-time PCR ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu gọi chu kỳ Lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang nên gọi đường (base line) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chu kỳ ngường trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diễn khuếch đại Hình Một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống nhận ánh sang kích thích sau chu kỳ nhiệt • Kỹ thuật real-time sử dụng Tagman probe làm chất phát huỳnh quang: Thành phần cho phản ứng real time PCR gồm: cặp mồi, Tag polymerase có hoạt tính 5-3_exnuclease, dNTP, PCR buffer, MgCl2, chất phát quang DNA đích Chìa khóa kỹ thuật phương pháp real time PCR chất huỳnh quang thêm vào real-time PCR mix - Chất phát huỳnh quang (chất nhuộm): chèn vào sợi đổi DNA phát huỳnh quang Chất phát huỳnh quang thường dùng Ethidium bromide - Probe đặc hiệu có gắn chất huỳnh quang (Tagman probe) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Probe đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa nguyên tắc có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ống phản ứng có bắt cặp probe lên trình tự đặc hiệu sản phẩm khuếch đại R: khuếch đại Khi có bắt cặp có phát huỳnh quang từ ống phản ũng nhờ nhận nguồn sáng kích thích Có nhiều loại probe, sau chế hoạt động Tagman probe real-time PCR Hình Tóm tắt chế phát huỳnh quang Taqman probe real-time PCR Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI KHUẨN, VIRUS Tác nhân N (%) Tác nhân N (%) Đơn VK Phối hợp VR-VR SP CMV, EBV HI EBV, CMV MC EBV, FluA AB CMV, Flu A, EBV MRSE EBV, Flu A, CMV MRSCN EBV, CMV, Flu A Đơn VR Phối hợp VK-VR 95 Rhino VR - VKCĐ 22 RSV EBV SP, EBV CcV 1 Rhino Para 3, SP SP, Rhino, CMV Phối hợp VK-VK 20 SP, EBV, CMV VKCĐ - VKCĐ EBV, SP, RSV SP, HI SP, EBV, Flu A HI, SP EBV, SP, Para 1 VKCĐ - VKBV SP, AB 17 SP, HI, EBV HI, Rhino, SP SP, MRSE MC, SP, RSV SP, KLP SP, MRSE, EBV 1 HI, Eco HI, EBV, CMV SP, AB, PSA SP, Hib, EBV, Adeno HI, KLP, AB SP, Para 3, EBV, CMV SP, MRSA, AB, MRSE SP, HI, KLP, MRSE EBV, SP, HI, CMV, Adeno VR - VKBV 1 15 HI, SP, AB, KLP EBV, AB SP, MRSE , GBS, MRSA KLP, CcV, Provi SP, B cepacia, MRSE EBV, CMV, E faecalis SP, HI, Eco, KLP, MRSCN EBV, Rhino, Eco SP, KLP, MY, MRSE, AB, MRSA EBV, Eco, CMV SP, Provi, Eco, KLP, MRSE, AB SP, HI, KLP, MRSA, E aerogenes, Eco EBV, KLP, MRSE 1 EBV, AB, Para 3, CMV KLP, Provi, SP, HI, MRSE, MRSA EBV, PSA, KLP, CMV SP, HI, Eco, KLP, AB, Hib AB, Eco, EBV, MRSCN Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn EBV, SP Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tác nhân N (%) Eco, KLP, PSA, E cloacae, EBV EBV, Sma, B cepacia, KLP, CMV Tác nhân N (%) 1 PSA, SP, EBV, AB, CMV EBV, SP, HI, Eco, MRSE Flu A, EBV, CMV, KLP, AB, MRSA SP, HI, Para 3, PVL, MRSA EBV, MRSE, AB, KLP, CMV, Para HI, SP, Provi, Flu A, CMV KLP, Sma, PSA, MRSA, Mmo, CMV, EBV SP, CMV, EBV, HI, Rhino, VZV SP, PSA, AB, MRSCN, EBV 1 EBV, KLP, Sma, CMV, PSA, B cepacia, AB VR – VKCĐ - VKBV 53 PSA, SP, CMV 1 Para 3, SP, CMV, EBV, MRSE AB, SP, Sma, EBV, KLP 1 SP, HI, Provi, EBV, MRSA SP, HI, GBS, EBV, MRSCN SP, CMV, AB SP, Sma, AB, KLP, EBV, CMV SP, KLP, EBV SP, GBS, EBV, B cepacia, MRSE HI, KLP, EBV SP, Eco, AB, KLP, CMV, EBV SP, EBV, AB, Flu A 1 SP, KLP, Eco, MRSE, AB, EBV 1 SP, PSA, EBV, MRSE SP, EBV, KLP, CMV Provi, EBV, Hib, PSA, CMV, MRSE SP, AB, EBV, CMV KLP, Eco, SP, E faecalis, Hib, CMV EBV, SP, CMV, MRSE HI, SP, Provi, EBV, PSA, Rhino SP, KLP, Flu A, MRSE SP, PSA, EBV, B cepacia PSA, SP, AB, KLP, EBV, Sma 1 SP, EBV, KLP, CMV SP, HI, EBV, CMV, KLP, Eco, A, MRSE, E aerogenes Sma, SP, EBV, PSA SP, B cepacia, CMV, EBV 1 SP, EBV, Eco, KLP, Sma, AB, MRSCN HI, PSA, EBV, MRSE SP, EBV, Provi, CMV, MRSE HI, EBV, MRSA, PVL SP, HI, KLP, EBV, MRSE Eco, KLP, SP, EBV, AB, MRSE, MRSA SP, HI, CMV, Flu A, Eco AB, EBV, SP, KLP, CMV EBV, SP, MRSA,có men PVL, MRSE, CMV, Provi, Hib, Provi, EBV, SP, Eco PSA, SP, EBV, AB, CMV SP, KLP, AB, Eco, Sma, E faecium, CMV, EBV SP, EBV, Provi, CMV, MRSE EBV, SP, HI, Eco, MRSE SP, Provi, KLP, EBV, AB, MRSE, Hib, MRSA SP, HI, Para 3, PVL, MRSA 1 SP, GBS, HiB, Eco, KLP, EBV, AB, CMV, MRSA SP, HI, CMV, Flu A, Eco HI, EBV, Sma, SP, AB, B cepacia, RSV, PSA, CMV AB, EBV, SP, KLP, CMV 1 Sma, HI, AB, SP, Hib, E cloaceae, MRSCN, KLP, CMV, MRSE HI, EBV, MRSA, PVL SP, HI, KLP, EBV, MRSE Hib, Provi, EBV, SP, Eco Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tác nhân PSA, MRSA, E aerogenes, MRSE, GBS, Sma, Flu A EBV, AB, Eco, KLP, Sma, E faecalis, RSV, GBS, MRSA, GAS, Flu C VR – VKCĐ - VKKĐH - VKBV SP, PSA, EBV, MY SP, Flu A, Provi, MY, MRSE, MRSA N (%) Tác nhân EBV, SP, HI, KLP, MY, MRSE, AB, Flu A N (%) 1 EBV, HI, SP, Provi, MY, Flu A, MRSA, MRSE Xét nghiệm (+) 136 Xét nghiệm (-) 1 VK: vi khuẩn, VR: virus, HI: H influenzae, Hib: H influenzae type B, SP: S pneumoniae, MC: M catarrhalis, GAS: S pyogenes; GBS: S agalactiae, MY: Mycoplasma, MP: M pneumoniae, Eco: E coli, Efas: E faecalis, Efam: E faecium, Eclo: E cloaceae, Eaer: E aerogenes, MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSE: Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis, MRSCN: MethicillinResistant Staphylococci, Có PLV: S aureus có PLV (Panton-Valentin Leucocidin), KLP: K pneumoniae, PSA: P aeruginosa, AB: A baumannii, FN: F nucleatum, BC: B cepacia, Sma: S maltophilia, Mmo: M.morganii, Provi: Providencia, Rhino: Rhinovirus, Adeno: Adenovirus, FluA/FluC: Influenzavirus A, Influenzavirus C, Para3: Parainfluenzavirus 3, RSV: Respiratory syncitalvirus, CMV: Cytomegalovirus, EBV: Epstein-Barr Virus, CcV: Common-cold Virus Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn