Phôi Soma

Phôi Soma tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vực kinh tế, kinh doan...

Mục lục

Phần 1: Giới thiệu chung

1 Định nghĩa phôi soma

2 Đặc điểm tế bào có khả năng sinh phôi

3 Sự hình thành phôi

4 So sánh phôi hữu tính và phôi vô tính(Phôi soma ) Phần 2: Sự sinh phôi từ tế bào soma

1 Định nghĩa sự sinh phôi từ tế bào soma

2 Các giai đoạn trong quá trình hình thành phôi soma

3 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh phôi Phần 3: Nuôi cấy phôi soma

Phần 4: Nhân giống cây cacao qua con đường tạo phôi soma 1.Giới thiệu chung

2.Qui trình

3.Giải thích qui trình

Phần 1: Giới thiệu chung

1.Định nghĩa :

Phôi soma là phôi được hình thành và phát triển từ các tế bào dinh dưỡng ,

mà các tế bào này có thể phân hóa thành những cấu trúc lưỡng cực, một cực hình thành rễ còn một cực tạo ra chồi, giống như phôi hợp tử

2.Đặc điểm phôi : Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào :

- Có tế bào chất đậm đặc

- Nhiều hạt tinh bột lớn

- Có hạch nhân khá lớn ăn màu phẩm nhuộm đậm

- Hàm lượng protein và RNA cao

3.Sự hình thành phôi:

Sự hình thành phôi(nói chung ) trải qua các bước:

- Sự biệt hóa các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi

- Sự phát triển những tế bào phôi mới hình thành qua các giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim, phôi hình cá đuối (hình thủy lôi)

Hình cầu

Hình trái tim

Hìnhcá đuối (Hình thủy lôi)

Sự sinh phôi từ tế bào soma:

- Giai đoạn 1 tạo mô sẹo :

Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng trưởng nhanh ,các tế bào trong môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất tính hữu cực

- Giai đoạn 2:

Mô sẹo sẽ đựợc chuyển vào môi trường có ít hoặc không có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối

Các giai đoạn trong quá trình phát sinh phôi soma

Tế bào đơn Phân chia Cụm tế bào nhỏ Giai đoạn

Có không bào lớn phôi hình cầu

Giai đọan phôi Giai đoạn phôi

cây con hình thủy lôi hình tim

4 So sánh phôi hữu tính và phôi vô tính (phôi soma )

 Phôi hữu tính : Được hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục : sau khi sự thụ tinh đôi xảy ra: một tinh trùng thụ tinh với trứng và thành lập hợp tử lưỡng bội, một loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi (cây bào tử thực vật mới )

 Phôi soma : Phôi soma là phôi được phát triển từ những tế bào dinh dưỡng ,chúng được tạo ra từ những tế bào của cơ thể thực vật, nhưng chúng hành động như một hợp

tử, trải qua một quá trình phát triển như một cấu trúc phôi

5.Ứng dụng phôi soma

Nhân giống sinh dưỡng nhanh các kiểu di truyền mong muốn – hữu ích cho các kiểu di truyền làm vườn , dòng trên những vụ mùa khô cằn và các thực vật chuyển gen

Sự phân phối trực tiếp thực vật nuôi cấy mô tới cánh đồng – đặc biệt hữu ích cho loài giao phấn cùng giống dị hợp tử hoặc cho những loài cây trồng rừng

Nhân giống kiểu di truyền giống cha hoặc mẹ cho sự sản xuất các thế hệ lai F1 hoặc tổng hợp các thế hệ có giới hạn

Nguồn của các chất chuyển hóa mới – hạt dạng lipid như cocoa butter, sáp lỏng từ các cây jojoba hay acid linolenic

Phần 2: sự sinh phôi từ tế bào soma

1 Định nghĩa: Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình ,qua đó một vài tế bào soma,trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật ), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi,theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử 2.Các giai đoạn trong quá trình phát sinh phôi soma :có 4 pha

- Pha thứ nhất bắt đầu khi những tế bào đơn hình thành những cụm tế bào có khả năng sinh phôi trên môi trương auxin (tương ứng với giai đoạn tạo mô sẹo ở phần giới thiệu )

- pha thứ hai xảy ra khi cụm tế bào có khả năng sinh phôi này được chuyển sang môi trường không có auxin Trong pha này các tế bào tăng sinh chậm và dường như không có biệt hóa

- pha thứ ba có sự phân bào xảy ra nhanh ở một số cụm tế bào dẫn đến việc hình thành những phôi hình cầu

- Pha thứ tư cây con invitro phát triển từ phôi hình cầu qua giai đoạn phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối

3.Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh phôi

-Tính toàn năng

Tính toàn năng của tế bào thực vật là một trong các chức năng đặc trưng nhất của tế bào thực vật và sự sinh phôi của tế bào soma được xem là một kiểu của tính toàn năng Sự sinh phôi từ tế bào soma giúp cho việc nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hóa của thực vật cũng như những cơ chế biểu hiện của tính toàn năng tế bào thực vật.Gần đây sự sinh phôi từ tế bào soma đã được các nhà công nghệ sinh học chú ý bởi vì đây là một trong những phương tiện hữu hiệu trong công nghệ gen

ở thực vật và các thao tác ở mức tế bào(Komamine, 1992)

Thuyết tế bào khái quát khái niệm về tính toàn năng tế bào thực vật được định nghĩa như khả năng khiến cho một tế bào thực vật đã phân hóa và còn sống có thể bước vào phản phân hóa ,phân chia, và cho một cây trưởng thành bình thường qua các giai đoạn của sự phát triển phôi

Có nhiều công trình được thực hiện thành công,dẫn đến sự thừa nhận hiện tại rằng phần lớn các tế bào thực vật dù ở mức độ chuyên hóa nào đều có khả năng phân hóa để trở về trạng thái phôi Ở trạng thái này một tế bào được gọi là có khả năng sinh phôi hay tế bào sinh phôi,có thể nuôi trong điều kiện thích hợp để cho một phôi theo một quá trình gọi là sự phát sinh phôi soma

- Các chất điều hào sinh trưởng thực vật : (Sẽ nói rõ hơn ở phần nuôi cấy )Đặc biệt là auxin có vai trò trong sự thành lập các tế bào có khả năng sinh phôi là do chúng ảnh hưởng lên tính lưỡng cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng sau đó Nếu không có auxin ở giai đoạn tạo mô sẹo thì tế bào sẽ kéo cài

ra và khồng có khả năng biệt hóa thành phôi ,do ở môi trường không có auxin thì

tế bào sẽ bị mất tính toàn năng.Tính toàn năng của tế bào được thể hiện khi tế bào được cấy trên môi trường có auxin,sau đó chuyển sang môi trường không có auxin

để biệt hóa thành phôi với tần số cao

- sự thành lập tính hữu cực như là bước đầu tiên trong sự sinh phôi.Quá trình phá vỡ tính cân xứng căn bản của tế bào cần thiết cho sự phát triển của một cấu

trúc phôi lần lượt xảy ra bởi sự phân lập một trụ, sau đó là sự phân hóa của cực chồi và cực rễ và sau đó là sự tượng các lá

Phần 3: Nuôi cấy phôi soma

1.Chọn mẫu cấy

Mẫu có thể là :

- Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành

- Các tế bào sinh sản không phải là tế bào sinh dục

- Trục hạ diệp hay tử diệp của phôi hợp tử mà cây con không thông qua sự phát triển từ mô sẹo

2.Khử trùng mẫu

Người ta thường sử dụng các dung dịch khử trùng thông thường như Ca-hypochlorite , Na-Ca-hypochlorite , thủy ngân clorur…Ngoài ra người ta còn dụng thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxol

4.Môi trường nuôi cấy phôi

Phôi được tách ra hoàn toàn đang trong tình trạng tự dưỡng

Như vậy môi trường nuôi cấy phôi cần được cung cấp đầy dủ chất dinh dưỡng thích hợp để có thể thực hiện được khả năng phát sinh phôi

Vai trò của các chất điều hòa sinh truởng thực vật trong sự sinh phôi soma -Auxin: Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau đến những giai đoạn khác nhau trong quá trình sinh phôi.Sự hiện diện của auxin cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm các tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào cô lập Tuy nhiên auxin lại cản sự sinh phôi ở các pha tiếp theo.Ở pha đầu tiên nếu như trong môi trường không có auxin thì các tế bào cô lập không thể phân hóa thành phôi do không thành lập được tính hữu cực, tiếp theo sự loại bỏ auxin giúp cho thành lập tính hữu cực và tính hữu cực này tác động đến sự sắp xếp bộ xương tế bào dẫn đến sự phân chia không cân xứng tạo ra một tế bào lớn và một tế bào nhỏ,đây là bước đầu tiên trong sự tạo phôi

Trong quá trình nuôi cấy thực hiện trên những loại mô khác nhau, các chất điều hào sinh trưởng thực vật,đặc biệt auxin hay auxin liên kết với 1 cytokinin cần thiết cho sự hình thành phôi thế hệ.Một số loài có thể được cảm ứng tạo phôi bởi nhiều loại auxin khác nhau như trường hợp daucus carota, nhưng trên một số thực vật khác thì việc sử dụng auxin có giới hạn hơn như trường hợp của các loài ngũ cốc thì chỉ có một loài auxin mới có thể tác động ví dụ như 2,4-D.Đối với một số loài thực vật chỉ cần một loại auxin để tạo mô sẹo, duy trì huyền phù tế bào và cảm ứng tạo phôi nhưng cũng có những loài khác thì các giai đọan kể trên cần đến các loại auxin khác nhau và khác nhau ở mỗi loài thực vật

- Cytokinin: là chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết cho sự sinh phôi soma ở một số loài Nhu cầu về cytokinin có tính chuyên biệt đối với từng loại

thực vật cũng như từng giai đoạn.Nồng độ cytokinin cũng thay đổi khác nhau trong quá trình nói trên

- Gibberellin: Gibberellin thường ít khi được sử dụng phối hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác trong quá trình phát sinh phôi soma.Tuy nhiên người ta cũng chứng minh được rằng gibberellins cũng có vai trò trong một số trường hợp giúp cho sự tăng trưởng của phôi hoặc kích thích sự ra rễ và những tăng trưởng về sau cho cây, hoặc gibberellins giúp cho phôi thoát ra khỏi trạng thái hữu miên

- vai trò của nguồn carbohydrate: Sucrose là loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn carbohydrate cho sự phát sinh phôi soma, bên cạnh đó một số đương đôi, đương đơn khác cũng có thể được áp dụng thành công.Ở một số trường hợp các loại đường khác như glucose hay loại khác lại có hiệu quả hơn trên những đối tượng thực vật khác.Đôi khi người ta cũng kết hợp 2 loại đường khác nhau đế giúp cho sự thành lập phôi soma

- Ảnh hưởng của các thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy: Thành phần các chất khoáng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi soma ở thực vật và sự ảnh hưởng này khác nhau ở từng loài thực vật

5.Điều kiện nuôi cấy phôi

- Ánh sánh :Sự tạo phôi soma có thể tạo ra trong những điều kiện sang tối khác nhau,có những loại cần ánh sang nhưng có những loài sự hình thành phôi soma xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn.Người ta cũng chứng minh rằng chiếu một tia đỏ xa trong một thời gian ngắn sẽ thúc đẩy sự sinh phôi từ

tế bào soma

- Nhiệt độ: Sự tạo phôi xảy ra trong khoảng nhiệt độ 20-30 ◦c,nhiệt độ còn tùy thuộc vào từng loại cây muốn tạo phôi

Phần 4: Nhân giống cây cacao qua con đường tạo phôi soma

1.Giới thiêu chung:

Cây ca cao trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới.Hột cacao là nguồn cung cấp bột cacao và bơ.Bột cacao là thành phần chủ yếu trong chocolate,bánh kẹo, bơ cacao được dung trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm.Theo thống kê hàng năm

có khoảng 2,76 triệu tấn hột cacao khô được sản xuất Cacao được nhân giống chủ yếu bằng hột,nhưng theo cách này sẽ thu được những thế hệ cacao có tỷ lệ gen dị hợp tử cao và không xác định.Những cải tiến trong nhân giống vô tính cacao đến nay vẫn còn ít.Cây cacao khó có thể tái sinh chồi và vi nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống vô tính qua con đường phát sinh phôi soma là một phương pháp được lựa chọn để nhân giống cây cacao invitro Phôi soma hình thành do sự phát triển lưỡng cực của các tế bào soma ,do đó cây được hình thành qua sự tái sinh phôi soma sẽ mang những đặc tính của cây mẹ và mang đặc tính tăng trưởng giống như cây trồng có hột

2.Qui trình:

3.Giải thích qui trình

- Vật liệu nuôi cấy:

Vật liệu nuôi cấy là nhị lép được thu từ những chồi hoa chưa trưởng thành của cây cacao trong vương ươm.Những nụ hoa chưa trưởng thành dài 4-5mm được thu vào buổi sang sớm

- Khử trùng:

Khử trùng bề mặt nụ hoa bằng cách nhúng vào và để yên trong hypochlorite calcium nồng độ 1% trong 20 phút.sau đó rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng làm khô nụ hoa bằng giấy thấm vô trùng.Nụ hoa được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/3 từ dưới gốc lên.Nhị được lấy ở phần trên và cấy vào môi trường tạo mô sẹo

- Tạo mô sẹo:

Môi trường tạo mô sẹo ban đầu (PCG: primary callus growth ) là môi trường cơ bản DKW (driver và kuniyuku, 1984, tulecke và Mcgranahan, 1985) có

bổ sung 2,4-D 9 µM, TDZ (thidiazuron) với các nồng độ khác nhau (22,7; 45,5; 113,6; 227,3; và 454,5 nM), glutamine 250 mg/l, myo-inositol 200 mg/l,

thiamine-Vật liệu nuôi cấy Khử trùng mẫu

Rửa sạch,lau khô Tạo mô sẹo

Tạo phôi soma

Tái sinh cây

Trồng cây trong chậu đất

HCl 2 mg/l, acid nicotinic 1 mg/l, glycine 2 mg/l, glucose 20 g/l và phytagel 2 g/l.Mẫu được cấy trong các đĩa petri 100×15mm có chứa 30ml môi trường Mẫu cấy được nuôi trong tối,ở nhiệt đọ 25◦c trong 14 ngày

Sau tuần nuôi cấy đầu tiên, mẫu cấy trong môi trường PCG sẽ tăng thể tích gấp 2-3 lần so với ban đầu.Tiếp theo là trên mẫu cấy xuất hiện những mô sẹo chắc.TDZ nồng độ 22,7 nM kích thích sự tạo mô sẹo chắc trên suốt bề mặc mẫu nuôi cấy.Trong khi đó trên môi trường không có TDZ mô sẹo chỉ hình thành ở vị trí vết cắt, còn trên môi trường có TDZ nông độ 45,5 nM thì mô sẹo chỉ xuất hiện ở phần gốc của mẫu cấy và phàn còn lại của mẫu bị hóa đen và chết

Sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường mô sẹo ban đầu,mẫu cấy được chuyển sang môi trường tạo mô sẹo thứ 2 (SCG: secondary callus growth).Môi trường này gồm các thành phần khoáng cơ bản theo công thức nuôi cấy cây thân

gỗ của McCown (Lloyd và McCown, 1980 ),thành phần vitamin theo Gamborg (Gamborg, 1966), 2,4-D 9 µM, kinetin 1,4 µM,nước dừa 50ml/l, glucose 20g/l và phytagel 2,2 g/l.Mẫu cấy tiếp tục được nuôi trong 14 ngày trong điều kiện như trên .Nước dừa được lấy từ trái dừa còn non và lọc qua 2 lớp giấy lọc Whatman số 4, chình giữa có than họat tính

Tốc độ tăng trường của mô sẹo sẽ chậm lại khi được chuyển sang môi trường SCG Tuy nhiên, sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường này,có sự xuất kiện những cụm mô sẹo hình cầu trên tòan bộ mẫu cấy

-Tạo phôi soma:

Mô sẹo tạo ra từ môi trường SCG được cấy chuyền sang môi trường vào môi trường cảm ứng phôi (ED: embryo development ) Thành phần môi trường ED gồm có: khoáng DKW, myo-inositol 100 mg/l, thiamine-HCl 2 mg/l, acid nicotinic 1mg/l, glycine 2 mg/l, sucrose 30g/l, glucose 1g/l và phytagel 2g/l Mô sẹo được nuôi trong tối, ở 25◦c và được cấy chuyền sau mỗi 14 ngày.Các phôi soma phát triển đến giai đoạn hình cá đuối sẽ được tách ra khỏi mô sẹo và tiếp tục nuôi trên môi trường ED trong điều kiện tương tự

Sự tạo phôi soma xảy ra sau khi chuyển mô sẹo sang môi trường ED được 2 tuần.Đầu tiên trên bề mặc mô sẹo xuất hiện những chỗ phồng lên, sau đó những cấu trúc này phát triển thành phôi hình cầu Sau 4 tuần ( có khi đến 2 tháng ) nuôi cấy trên môi trường ED, trên toàn bề mặt mẫu nuôi cấy mẫu xuất hiện những phôi

ở giai đoạn hình trái tim

-Tái sinh cây:

Sau 2 tháng nuôi cấy,những phôi soma trưởng thành được chuyển sang môi trường tái sinh cây (PR: plant regeneration ) gồm có khoáng DKW 1/5, myo inositol 100 mg/l, thiamine-HCl 2 mg/l, acid nicotinic 1 mg/l, glycine 2 mg/l, glucose 10 g/l, sucrose 5 g/l, KNO3 0,2 g/l và phytagel 1,7 g/l.Mẫu cấy được nuôi cấy dưới cường độ ánh sang 50 µmol m-2s-1 ,16 giờ/ngày và được cấy chuyền sang môi trường mới có thành phần tương tự sau mỗi 14 ngày

Sau khoảng 1 tháng nuôi cấy trên môi trường PR, chồi với các lá màu xanh, nhỏ bắt đầu xuất hiện

-Trồng cây trong chậu đất:

Cây cacao con có khoảng 3 lá và bộ rễ khỏe mạnh dài khoảng 4cm sẽ được chuyển ra trồng ở các chậu plastic đường kính 10cm có chứa hồn hợp đất, phân vô trùng nuôi trong nhà kính ở nhiệt độ 27-30◦c , ẩm độ 70%.Sau 2 tháng cây được chuyển sang chậu plastic đường kính 38 cm có chứa hỗn hợp đất và phân.Cây được tưới bằng nước có độ pH 5,5-6,0 và tưới phân 2 tuần 1 lần.Sau 10 ngày kể từ ngày đưa ra vườn ươm,cây cao khoảng 1,5 m,có khoảng 50-60 lá, phát sinh khoảng

5 chồi bên và có các đốt thân ngắn.Những cây con được tạo ra qua con đường phát sinh phôi soma cũng có sự phát triển tương tự như cây trồng từ hột theo từng giai đoạn