Giáo án đông lạnh phôi
Đông lạnh phôiI. Tổng quan.1. Khái niệm.Từ khi đứa trẻ đầu tiên được thụ tinh trong ống nghiệm ra đời (1978) cho đến nay, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ngày càng được áp dụng rộng rãi, mang lại niềm hy vọng cho các cặp vợ chồng vô sinh. Sự áp dụng các loại thuốc kích thích buồng trứng nhằm tăng số lượng phôi hình thành đã giúp cho tỷ lệ thành công của một quá trình điều trị gia tăng đáng kể. Người ta thường chọn những phôi có chất lượng tốt nhất trong số các phôi có được để chuyển vào buồng tử cung (chuyển phôi tươi). Tuy nhiên trong số phôi còn lại vẫn còn một số phôi có chất lượng tốt, có khả năng làm tổ cao. Những phôi này có thể được trữ lạnh để sử dụng trong các lần chuyển phôi tiếp theo. Trường hợp có thai đầu tiên từ phôi người trữ lạnh được báo cáo tại Monash, Úc bởi Trounson và Mohr vào năm 1983. Từ đó đến nay, trữ lạnh phôi đã trở thành một trong những kỹ thuật không thể thiếu ở bất kỳ một trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm nào trên thế giới. Công nghệ đông lạnh phôi này ra đời có ý nghĩa trong việc nghiên cứu của các nhà khoa học, nó đã mở ra một hướng mới trong công nghệ hỗ trợ sinh sản, đặt biệt trong thụ tinh trong ống nghiệm.Vậy thế nào là đông lạnh phôi?Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cục thấp (-196oC) trong nitơ lỏng sẽ làm ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển … giúp lưu giữ chúng trong thời gian rất dài, mà sau khi rã đông những phôi này vẫn phát triển bình thường.2. Các phương pháp.- Đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh chậm.- Đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh nhanh (phương pháp thủy tinh hóa).II. Nguyên tắc chung.Để trữ tế bào sống trong một thời gian dài thì tất cả hoạt động chức năng bên trong tế bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196oC) hầu hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian như ngừng trôi đối với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ lạnh là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế yếu tố này không quan trọng và một nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi rã đông, và chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến thành công của trữ lạnh chính là giai đoạn làm lạnh và rã đông.Các bước cần tiến hành trong việc đông lạnh phôi:- Chọn phôi: phôi được chọn để trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót và phát triển thai tốt sau khi giải đông. Theo Kennedy và cộng sự vào năm 1983, chất lượng phôi được xếp thành 5 mức độ khác nhau: phôi loại một tốt nhất và phôi loại 5 suy thoái. - Môi trường đệm: cũng giống như trong nuôi cấy tế bào động vật, trong đông lạnh phôi cũng cần có môi trường đệm. Đối với phôi của những loài động vật khác nhau thì môi trường đệm cũng khác nhau. Ví dụ: PBS chứa 20% huyết thanh bê là môi trường đệm thường dùng cho việc trữ lạnh phôi bò. Ở các loài động vật khác thì môi trường đệm thường dùng là HEPES với 10-15% huyết thanh bê. Ở người, môi trường đệm là HEPES 20mM thay thế cho hệ đệm bicarbonate và có thể thêm 0,5-1% HAS hay 10-15% huyết thanh của chính người nhận.- Chất bảo quản lạnh: Glycerol, DMSO, ethylene glycon, polyvinyl pyrolydine (PVP) và sucrose thường được sử dụng bổ sung như các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi. PVP và sucrose sẽ khử nước tự do bên trong tế bào nhưng chúng không xâm nhập vào tế bào. Trong khi đó, Glycerol và DMSO, ethylene glycon khử nước tự do trong nội bào và tế bào giúp bảo vệ cytoplasm đi vào trongỞ người, chất bảo quản phôi thường được sử dụng là 1,2-propanediol (PROH) và dimethyl sulfoxide DMSO.Khả năng sống sót của phôi liên quan đến nồng độ các chất bảo quản đông lạnh được thêm vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà tại đó được thêm vào và cuối cùng là thời gian cân bằng. - Dụng cụ chứa phôi trong đông lạnh: có thể là các ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay các cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng (0.25ml hay 0.5ml).- Thiết bị làm lạnh và đông: Trong phương pháp làm lạnh và đông, có thể sử dụng ancohol đặt vào vật chứa như là một môi trường làm lạnh, sau đó đưa vào đá khô hay nitơ lỏng. Trong các thiết bị chuyên dùng chất làm lạnh chủ yếu là nitơ lỏng, nhưng nguồn điện cũng thường được sử dụng để hạ nhiệt. Một số thiết bị hiện đại có thể được chương trình hóa tốc độ giảm nhiệt nên việc đông lạnh trở nên dễ dàng và hiệu quả cao.- Tốc độ làm lạnh: Dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên, những phác đồ trữ phôi được đưa ra và hoàn chỉnh dần. Hai phác đồ được sử dụng rộng rãi hiện nay áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi nang) và cho giai đoạn muộn (phôi nang). 1. KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH HẠ NHIỆT ĐỘ CHẬM( SLOW FREEZING) Dựa vào nguyên tắc của đông lạnh phôi chúng ta có thể trữ lạnh phôi vào các giai đoạn khác nhau: 1.1 Trữ phôi giai đoạn sớm Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay cho giai đoạn này là 1,2 propanediol (PROH). Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) là loại chất bảo quản lạnh được sử dụng thành công đầu tiên ở người nhưng phác đồ dùng DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh cũng như rã đông nên ít được dùng hơn. Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản bên ngoài tế bào. Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phôi có bổ sung 20% huyết thanh. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và sucrose trong từng môi trường là: • Làm lạnh 1: 1,5M PROH (15 phút) • Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (5 phút) Sau đó phôi được cho vào các ống trữ thể tích khoảng 0,25ml và trữ theo chương trình: • Từ nhiệt độ phòng xuống -7oC: giảm 1-2oC/phút • Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước khi chạm vào thành ống trữ phôi • Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30oC: giảm 0,3oC/phút • Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50oC/phút, hoặc có thể cho trực tiếp vào nitơ lỏng Ðến lúc này phôi được giữ liên tục trong nitơ lỏng. Chỉ đến lúc sử dụng phôi mới được rã đông. Với chất bảo quản lạnh là PROH, ống chứa phôi có thể được làm rã đông bằng cách giữ trong không khí trong 30 giây, sau đó nhúng vào nước ấm 37oC trong 60 giây. Ngược với trước khi làm lạnh, sau khi rã đông, phôi lại được chuyển lần lượt qua các môi trường khác nhau để rửa sạch chất bảo quản lạnh vốn có thể gây độc cho phôi. PROH có nồng độ giảm dần để tránh sự thoát nước quá nhanh ra khỏi phôi. Thời gian phôi được giữ trong mỗi môi trường rã đông là 5 phút: • Rã đông 1: 1M PROH - 0,2M sucrose • Rã đông 2: 0,5M PROH - 0,2M sucrose • Rã đông 3: 0,25M PROH - 0,2M sucrose • Rã đông 4: 0M PROH - 0,2M sucrose Sau môi trường rã đông 4, phôi được cho trở lại vào môi trường cấy. Chất lượng phôi sau khi rã đông được kiểm tra sau 1 giờ. Ở một số trung tâm, phôi sau khi rã đông được nuôi cấy 1 ngày để xem khả năng phát triển của phôi trước khi chuyển trở lại vào buồng tử cung.1.2 Trữ phôi giai đoạn muộn Các bước trữ phôi cũng tương tự như trữ phôi giai đoạn sớm. Tuy nhiên chất bảo quản lạnh là Glycerol. Nồng độ glycerol dùng trước khi làm lạnh là:• Làm lạnh 1: Glycerol 5% (10 phút) • Làm lạnh 2: Glycerol 9% trong môi trường chứa sucrose (10 phút) Môi trường sau khi rã đông là:• Sucrose 0,5M (10 phút) • Sucrose 0,2% (10 phút) 1.3 Đánh giá hiệu quả trữ phôi Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng sống của phôi sau khi rã đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy và cấp độ thứ ba là khả năng phát triển của phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ. Ở cấp độ 1, phôi được đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống (survival index) tính bằng tỷ lệ tế bào còn sống trên tổng số tế bào. Cấp độ 2 đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống trên tổng số phôi được rã đông. Cấp độ 3, cũng là cấp độ quan trọng nhất, là tỷ lệ phôi làm tổ sau khi chuyển. So với trữ phôi giai đoạn sớm, trữ phôi giai đoạn muộn có tỷ lệ sống sau trữ lớn hơn do thể tích tế bào trong phôi nhỏ hơn. Tuy nhiên khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang (blastocyst). Để đạt được điều này, một mặt bệnh nhân phải có nhiều phôi, mặt khác quy trình nuôi cấy phôi phải thật tốt. Hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu đối chứng đủ mạnh để so sánh hiệu quả của trữ phôi giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Thực tế cho thấy ở những quốc gia không cho phép trữ phôi giai đoạn muộn như Đức, việc trữ phôi ngay cả ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus) vẫn có giá trị lâm sàng. 1.4 Ưu, khuyết điểm của phương pháp 1.4.1 Nhược điểm Tỷ lệ phôi sống không cao, mất nhiều thời gian, cần sử dụng máy khi trữ lạnh, sử dụng nhiều nitơ, chương trình không ổn định. Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá. Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh. Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng. Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm.Khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang(blastocyst).1.4.2 Ưu điểm Do sử dụng chất bảo quản ở nồng độ thấp nên ít gây tổn thương về cấu trúc tế bào. 2. KỸ THUẬT THỦY TINH HOÁ (VITRIFICATION) 2.1 Khái niệm Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh.Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình đông lạnh. Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 – 8M), mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm. Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 2000 – 25000C / phút.2.2 Kỹ thuật: 2.2.1 Chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) Nhìn chung, các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm 1 hoặc 2 chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và 1 chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. Chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol,propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH). Chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose. Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol và 1 chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. 2.2.2 Dụng cụ Lưới đồng (copper grid): kỹ thuật thủy tinh hóa sử dụng lưới đồng trong đông lạnh phôi được thực hiện đầu tiên. Kích thước giọt môi trường chứa phôi rất nhỏ và phần lớn lượng môi trường này đều đi qua các lỗ nhỏ trên bề mặt lưới, chỉ còn tế bào trứng hoặc phôi được giữ lại bên trên mặt lưới một cách an toàn. Các lưới đồng chứa trứng/phôi được bảo quản trong những tube nhỏ chứa đầy nitrơ lỏng trước khi đưa vào thùng lưu trữ. OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw có đường kính trong nhỏ hơn rất nhiều so với đường kính nguyên thủy của các loại straw 0,25ml thường dùng trong đông lạnh chậm. Người ta tạo ra OPS bằng cách làm nóng chảy straw 0,25ml và kéo dãn bằng tay, sau đó cắt bằng 1 lưỡi dao rất mỏng, sao cho đường kính và bề dày của thành straw bằng khoảng ½ so với ban đầu, bảo đảm lượng môi trường có chứa trứng/phôi khi được hút vào trong OPS chỉ khoảng 1µl, đầu OPS chứa môi trường và trứng/phôi được bảo vệ bằng 1 straw 0,5ml; đầu còn lại được gắn một nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị nổi lên bề mặt khi thả vào nitơ lỏng. OPS là loại dụng cụ được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật đông lạnh cực nhanh hiện nay. Cryoloop: dụng cụ này bao gồm một vòng tròn rỗng bằng nhựa mềm, gắn với một cán nhựa hoặc kim loại. Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng mỏng trong phần rỗng của vòng tròn và phôi/trứng được đặt ngay trên lớp màng mỏng này, sau đó toàn bộ dụng cụ có chứa trứng và phôi được làm lạnh trong hơi nitơ lỏng. Nilon mesh: một dạng kết hợp giữa lưới đồng và cryoloop, được làm bằng nhựa dẻo. Và chỉ được sử dụng chủ yếu trong đông lạnh trứng/phôi của động vật nuôi bằng kỹ thuật thủy tinh hóa. Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới được phát minh trong một vài năm gần đây (2000) nhưng được xem là dễ sử dụng và có hiệu quả sau rã đông cao nhất. Dụng cụ bao gồm một bản phim trong mỏng được bảo vệ bởi một nắp nhựa, gắn với 1 cán cầm bằng nhựa. Trứng/phôi được đặt trên bề mặt bản phim với một lượng môi trường rất nhỏ và toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. Ngoài ưu điểm dễ thao tác, tốc độ làm lạnh và rã đông khi sử dụng cryotop nhanh hơn rất nhiều so với OPS, điều này giúp tăng tỉ lệ sống của trứng/phôi sau khi rã đông. 2.2.3 Thao tác Thao tác đơn gian nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa là đầu tiên mẫu trứng/phôi được cân bằng với môi trường có chứa chất bảo vệ đông lạnh có nồng độ rất cao (4 – 8M) để khử toàn bộ nước bên trong tế bào. Sau đó, trứng/phôi được cho vào những dụng cụ chứa, toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp trong nitơ lỏng và chuyển vào bình lưu trữ. Thời gian cho toàn bộquy trình đông lạnh chỉtốn 15 – 20 phút. Hiện nay, ở một số trung tâm, người ta sử dụng nitơ ở dạng sệt (nitrogen slush) thay thế cho nitơ lỏng trong kỹ thuật thủy tinh hóa. Ưu điểm của dạng nitơ này là tránh sự bay hơi và thay đổi nhiệt độ ở vùng bề mặt khi nhúng trực tiếp dụng cụ chứa mẫu vào trong nitơ lỏng. 2.2.4 Rủi ro thường gặp nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực hiện phải thuần thục và chính xác trong kỹ thuật cao. Sự thay đổi nhiệt độ do ngẫu nhiên hay “tai nạn” trong quá trình lưu trữ và di chuyển mẫu đã đông lạnh là rủi ro thường gặp nhất. Do thể tích môi trường xung quanh trứng/phôi rất nhỏ, chỉ một vài thay đổi nhiệt độ nhỏ cũng làm ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông. Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây. Điều này có thể gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống của trứng/phôi. Đặc biệt là ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc của trứng sau khi được rã đông. Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, những tế bào nhạy cảm như trứng/phôi có thể bị tổn thương chất liệu di truyền, nhưng cho đến nay, chưa có một bằng chứng nào cho thấy những em bé được sinh ra từ kỹ thuật đông lạnh trứng/phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao hơn phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Trứng/phôi sau khi được cho vào những dụng cụ chứa, thường tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng mà không được bảo vệ. Do đó, dễ dẫn đến nguy cơ lây truyền các vi sinh vật gây bệnh giữa các mẫu trứng / phôi với nhau qua trung gian nitơ lỏng. Tuy nhiên, đây chỉ là một trong những nguy cơ có thể xảy ra đối với kỹ thuật này. Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một báo cáo về trường hợp lây nhiễm liên quan đến việc chuyển phôi trữ lạnh được công bố. Ngoài ra, phương pháp chứa phôi trong cọng rạ (straw) cũng không loại trừ hoàn toàn việc tiếp xúc với nitơ lỏng. 2.2.5 Ưu, khuyết điểm của phương pháp 2.2.5.1 Ưu điểm Ưu điểm vượt trội của nó là thời gian trữ lạnh nhanh, tỷ lệ phôi sống và nguyên vẹn đạt đến 99%. Tỷ lệ thụ thai từ kỹ thuật này đạt tỷ lệ 50%, gấp đôi phương pháp cũ. Do đó, đông lạnh phôi cực nhanh với kỹ thuật thủy tinh hóa sẽ khắc phục được rất nhiều nhược điểm của phương pháp cũ, đồng thời giảm thiểu chi phí điều trị, giảm nguy cơ biến chứng, gia tăng tỷ lệ thành công cho những người hiếm muộn. Chi phí đầu tư cho trang thiết bị thì không cần nhiều. Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn. Kết quả là không có sự hình thành thể đá bên trong tế bào, nhờ đó mà tế bào có thể tránh được những tổn thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra. Phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông của phôi và trứng cao hơn rất nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm. 2.2.5.2 Khuyết điểm Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực hiện phải thuần thục và chính xác trong kỹ thuật cao. Sự thay đổi nhiệt độ do ngẫu nhiên hay “tai nạn” trong quá trình lưu trữ và di chuyển mẫu đã đông lạnh là rủi ro thường gặp nhất. Do thể tích môi trường xung quanh trứng/phôi rất nhỏ, chỉ một vài thay đổi nhiệt độ nhỏ cũng làm ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông. Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây. Điều này có thể gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống của trứng hoặc phôi. Đặc biệt là ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc của trứng sua khi rã đông. Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, những tế bào nhạy cảm như trứng/ phôi có thể bị tổn thương vật liệu di truyền. nhưng cho đến nay chưa có một bằng chứng nào cho thấy em bé được sinh ra rừ kỹ thuật đông lạnh trứng/ phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao hơn phương pháp đông lạnh chậm trước đây.3. SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁPSo sánh giữa 2 phương pháp đông lạnh cũ và mới: Hạ nhiệt độ chậm Thủy tinh hóa Thời gian hoàn tất Khoảng 2 giờ 15-20 phút Hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng cần không cần Lượng nitơ lỏng sửdụng cho 1 lần thực hiện 10 lít 0,5 lít Môi trường Cần nhiều loại môi trường cho các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi Một loại môi trường cho tất cả các giai đoạn phát triển của phôi Thời gian phôi ở ngoài tủ cấy dài ngắn Tổn thương mang trong suốt có thể không Tỷ lệ phôi sống sau rã đông 70%-80% 95%-100% Thành tựuNgày 18/2/2003, đứa bé đầu tiên ở Việt Nam ra đời từ phôi trữ lạnh là một bé gái, cân nặng 3,1kg. Chị N., 30 tuổi, mẹ của bé, đã làm thụ tinh trong ống nghiệm tại bệnh viện Phụ sản Từ Dũ và được chuyển phôi tươi vào tháng 4/2002. Sau chuyển phôi chị còn 4 phôi có chất lượng tốt để trữ lạnh. Tháng 6/2002, chị được chuyển các phôi trữ lạnh thành công và sinh lúc thai 38 tuần tuổi.Thành tựu của kỹ thuật hỗ trợ sinh sản tại Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ TP HCM: 1998: Thực hiện thành công ca thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên ở Việt Nam1999: Em bé đầu tiên từ kỹ thuật ICSI (tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương trứng) tại Việt Nam ra đời2000: Thực hiện thành công kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm - xin trứng2001: Em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm - mang thai hộ2002: Triển khai kỹ thuật ICSI với tinh trùng sinh thiết từ mào tinh 2003: Em bé sinh ra từ phôi người đông lạnh đầu tiên ở Việt Nam [...]... 0.5ml). - Thiết bị làm lạnh và đông: Trong phương pháp làm lạnh và đơng, có thể sử dụng ancohol đặt vào vật chứa như là một môi trường làm lạnh, sau đó đưa vào đá khơ hay nitơ lỏng. Trong các thiết bị chuyên dùng chất làm lạnh chủ yếu là nitơ lỏng, nhưng nguồn điện cũng thường được sử dụng để hạ nhiệt. Một số thiết bị hiện đại có thể được chương trình hóa tốc độ giảm nhiệt nên việc đông lạnh trở nên dễ... quả cao. - Tốc độ làm lạnh: Dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên, những phác đồ trữ phơi được đưa ra và hoàn chỉnh dần. Hai phác đồ được sử dụng rộng rãi hiện nay áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi nang) và cho giai đoạn muộn (phơi nang). 1. KỸ THUẬT ĐƠNG LẠNH HẠ NHIỆT ĐỘ CHẬM( SLOW FREEZING) Dựa vào nguyên tắc của đơng lạnh phơi chúng ta có thể trữ lạnh phôi vào các giai đoạn... chất bảo quản phôi thường được sử dụng là 1,2-propanediol (PROH) và dimethyl sulfoxide DMSO. Khả năng sống sót của phơi liên quan đến nồng độ các chất bảo quản đông lạnh được thêm vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà tại đó được thêm vào và cuối cùng là thời gian cân bằng. - Dụng cụ chứa phơi trong đơng lạnh: có thể là các ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay các cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng... thể trữ lạnh phôi vào các giai đoạn khác nhau: 1.1 Trữ phôi giai đoạn sớm Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay cho giai đoạn này là 1,2 propanediol (PROH). Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) là loại chất bảo quản lạnh được sử dụng thành công đầu tiên ở người nhưng phác đồ dùng DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh cũng như rã đông nên ít được dùng hơn. Với PROH, kết quả đạt được tốt... bào. Mơi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có mơi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phơi có bổ sung 20% huyết thanh. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và sucrose trong từng môi trường là: • Làm lạnh 1: 1,5M PROH (15 phút) • Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (5 phút)... 0,25ml và trữ theo chương trình: • Từ nhiệt độ phịng xuống -7 o C: giảm 1-2 o C/phút • Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước khi chạm vào thành ống trữ phơi • Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30 o C: giảm 0,3 o C/phút . mà sau khi rã đông những phôi này vẫn phát triển bình thường.2. Các phương pháp.- Đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh chậm.- Đông lạnh phôi bằng phương. đặt biệt trong thụ tinh trong ống nghiệm.Vậy thế nào là đông lạnh phôi? Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cục thấp (-196oC) trong nitơ lỏng sẽ làm