sản xuất protease từ bacillus subtilis s5

sản xuất protease từ bacillus subtilis s5 tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...

B subtilis là trực khuẩn Gram dương có

kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội bào tử ở

trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm

Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên

và khi điều kiện sống gay go, chúng có khả

năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài Ở điều kiện 100oC, bào tử của B.subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại

Bacillus là vi khuẩn catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval

có khuynh hướng phình ra ở một đầu Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng

Hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là Bacillus anthracis (gây ra

anthrax) và Bacillus cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tương tự Staphylococcus) Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus subtilis và Bacillus coagulans B subtilis là một sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót trong độ nóng cùng cực thường thấy khi nấu ăn Nó chính là tác nhân làm cho bánh mì

hư B coagulans có thể phát triến đến tận mức và gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính acid mà bình thường có thể khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất) Ấu trùng Paenibacillus gây ra các chứng bệnh của ong mật ở ong mật

2/Giới thiệu chung về protease:

Cấu trúc của protease

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin

(-CO-Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase

Peptidase (Protease)(E.C.3.4)

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng, có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm

3/Đặc tính của enzyme protease chiết tách từ B.subtilis S5:

Khối lượng phân tử 20.000-30.000

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11

Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Có pHopt :6.0÷6.5, topt: 55oC và không bền ở nhiệt độ từ 60oC trở lên

Muối ăn có thể làm giảm hoạt tính của protease B.Subtilis S5 và nồng độ muối

ăn càng cao thì mứa độ giảm hoạt tính càng mạnh

Các chất làm giảm hoạt độ của protease DC (dịch chiết ) và CPE (chế phẩm enzyme ) là: Zn2+ , Cd2+ , Ba2+ , Cu2+ , Pb2+ , Hg2+ , CN- , H2O2, EDTA, trong đó Hg2+ và EDTA làm giảm tới trên 90%, còn Mg2+ và Mn2+ làm tăng nhẹ hoạt độ CPE, 2-

Mecraptoethanol và L-cystein làm tăng rõ rệt hoạt độ của protease CPE nhưng ảnh hưởng rất ít đến hoạt độ protease DC

Protease CPE tủa bởi ethanol nồng độ 75%

Protease B.Subtilis S5 kém bền với nhiệt so với các protease tứ thực vật và bển hơn protease nấm mốc

4/Phương pháp và điều kiện nuôi cấy:

a/Phương pháp:

Nuôi cấy bán rắn trong điều kiện có thông gió và giữ ẩm theo ba phương pháp:

 Phương pháp 1: bề mặt khay nuôi không phủ vải ẩm

 Phương pháp 2: bề mặt các khay nuôi được phủ vải ẩm

 Phương pháp 3: bề mặt khay nuôi phủ vải ẩm và sau bốn giờ nuôi phun hơi nước qua máy thổi khí vào phòng nuôi để tạo độ ẩm

Phương

pháp

Hoạt độ protease ( UI/g canh trường)

Trạng thái của canh trường

1 20.2 Bề mặt canh trường bị khô, nứt, vi khuẩn mọc trắng

phía dưới còn ở phía trên thì không mọc

3 28.2 Bề mặt canh trường không bị khô, khối canh trường

nóng, ẩm, mềm, vi khuẩn mọc trắng cả trên và dưới

Ảnh hưởng của phương pháp giữ ẩm tới hoạt độ protease B.Subtilis S5

thu được trong canh trường

Từ kết quả trên ta thấy phương pháp phủ vải ẩm trên bề mặt canh trường nuôi

và phủ vải ẩm là phương pháp thích hợp nhằm giữ ẩm cho canh trường nuôi B.Subtilis S5 để sản xuất protease

b/Điều kiện nuôi cấy:

Môi trường nuôi cấy: Bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc và khoáng chất như:NaCl, CaCO3, DAP

Nhiệt độ nuôi ban đầu là 30-32oC

Thông gió 28.6 Nhiệt độ canh trường nuôi tối đa lên tới 45oC, vi

khuẩn mọc trắng cả trên và dưới, canh trường dẻo dính

Ảnh hưởng của thông gió tới hoạt độ protease thu được.

Hoạt độ protease

( UI/g )

5.0 8.0 12.5 17.5 23.5 31.5 33.2 33.1 32.0 29.5

Ảnh hưởng của thời gian tới hoạt độ protease thu được.

Thời gian nuôi cấy 41 giờ trong điều kiện thông gió và giữ ẩm

pH: 7

II/QUY TRÌNH:

1/Quy trình:

Gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn nuôi cấy và giai đoạn tinh sạch

Giai đoạn nuôi cấy và thu canh trường Protease

Nước 80% so với nguyên liệu

Bột bắp+khô dầu lạc+cám gạo

Khoáng hỗn hợp

Hấp 100oCtrong 2 giờ

Làm nguộiđến 37oC

Đổ lên khay

Nuôi 41 giờ

ở nhiệt độĐánh tơi

Thu bột canhtrường chứaproteaseXay mịn

Chế phẩmenzyme thô đem

sử dụng

Bã

Thức ăn gia súc

Ethanol

75%

Enzyme bán tinh khiết

bột canh trường chứa protease

Quá trính tinh sạch enzyme

Chất trợ

nghiền

Giải thích quy trình:

a/nuôi cấy:

Nhân giống B.Subtilis S5: giống B.Subtilis S5 phân lập từ tự nhiên và được bảo quản ở 5oC trên môi trường giữ giống có thành phần: agar 2%, cao thịt 0,5%, peptone 0,5%, NaCl 0,25%

Chuyển giống B.Subtilis S5 vào môi trường hoạt hóa có thành phần: agar 2%, cao thịt 0,5%, pepton 0,5%, NaCl 0,25%, tinh bột 1% và nước chiết giá đậu

xanh(200g/lít) Sau khi hoạt hóa 48 giờ, cấy giống sang môi trường nhân giống có thành phần: dịch chiết cám 20%, dịch thủy phân khô dầu lạc 10%, NaCl 0,36%, MgSO4 0,05%, CaCO3 0,6%, pH = 7.Trước khi cấy giống, hấp và khử trùng môi trường nhân giống bằng hơi bão hòa ở áp suất 1atm trong thời gian 30 phút Quá trình nhân giống tiến hành trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, sau 24 giờ kiểm tra giống đang lắc cấytrên môi trường hoạt hóa sau 24 giờ thấy giống mọc tốt, đều không có khuẩn lạc là được Sau khi nhân giống ly tâm thu B.Subtilis S5 dùng để sản xuất enzyme

Sản xuất protease từ B.Subtilis S5:

Môi trường nuôi B.Subtilis S5 sản xuất protease (152,19kg/mẻ) có thành phần như sau: bột bắp xay mịn 70kg, cám gạo 30kg, khô dầu lạc (45% protein) 50kg, NaCl 540g, CaCO3 900g, DAP 750g, pH = 7 Khoáng DAP pha trong 80% nước so với nguyên liệu, điều chỉnh pH= 7, trộn với nguyên liệu sau đó hấp ở 100oC trong 2 giờ, làmnguội đến nhiệt độ 37oC và cấy giống theo tỉ lệ 5% so với nguyên liệu Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, mỗi khay khoảng 12

kg, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ Các giá đỡ này được thiết

kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn

bộ khối môi trường

Trong quá trình sản xuất bề mặt các khay nuôi được phủ vải ẩm và sau 4 giờ nuôi bắt đầu phun hơi nước để tạo độ ẩm cho phòng nuôi vào khoảng 90÷100% Nuôi trong điệu kiện thông gió với mục đích đuổi CO2, giải nhiệt và cung cấp oxy cho vi khuẩn

Sau 41 giờ nuôi ở nhiệt độ phòng thu canh trường chứa enzyme

b/thu nhận sản phẩm:

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được bột canh trường chứa enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym

ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường)

Để đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người

ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không) Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-40oC Enzyme protease của B.Subtilis sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70oC

Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.

Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV

c/Trích ly:

Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease Các loạienzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súcăn)

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này

d/Quá trình kết tủa enzym protease:

Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác

Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và

cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính

Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon

Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7oC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W)

Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương)

Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quantâm

Máy sấy phun sương

Máy sấy chân khônge/Tách enzyme:

Đã tách chế phẩm protease B.Ssubtilis S5 qua cột lọc gel sephadex G-75 thu được bốn đỉnh protein kí hiệu: I, II, III, IV và xác định đặc tính của protease tách được như sau:

Tóm tắt quá trình tinh sạch protease

Sau khi qua cột lọc gel thu được hai dỉnh chính có hoạt độ protease là P-I và P-II, trong đó P-II chiếm tới 84,3% hoạt độ lên cột và có độ tinh sạch gấp 15 lần DC ban đầu

Kết quả nghiên cứu cho thấy ion Ca2+ và Mg2+ ở nồng dộ 10-3 M làm giảm hoạt độP-I, nhưng Ca2+ lại không ảnh hưởng đén hoạt độ P-II Mn2+ không ảnh hưởng tới hoạt

độ P-I nhưng lại tăng hoạt độ P-II

P-II có pHopt là 6,0 và topt 55oC.Các chất làm giảm hoạt độ P-II là: Zn2+ , Cd2+ ,

Ba2+ , Cu2+ , Hg2+ , CN- , Fe2+ , H2O2 và EDTA, trong đó Hg2+ , H2O2 và EDTA làm giảm tương ứng tới 100%, 97,9% và 98,6% P-II có tính điển hình của proteinase thiol là: các

chất khử 2-Mecraptoethanol và L-cystein làm tăng hoạt độ P-II tới 200% và 189,7% đông của enzyme) Như vậy chứng tỏ P-II thuộc nhóm proteinase thiol (proteinase cystein)theo cách phân loại của Hartley.

Để tiếp tục tìm hiểu về đặc tính của P-II, tiến hành xử lí P-II bằng EDTA với nồng

độ trong hỗn hợp là 6x10-3 M ở 30oC trong thời gian 10 phút.Sau khi xử lí tái hoạt hóa enzyme bằng 2-Mecraptoethanol, Mg2+ và Mn2+. Kết quả cho thấy sau khi xử lí với EDTA hoạt độ của P-II gần như giảm hoàn toàn Nhưng nếu sau đó lại thêm 2-

Mecraptoethanol thì hoạt độ của P-II hồi phục tới 75%, còn nếu thêm Mn2+ hoặc hỗn hợp Mg2+ và Mn2+ thì hoạt độ enzyme chỉ phục hồi 25% hoạt độ ban đầu kết quả này cho thấy P-II cũng cần Mn2+ để hỗ trợ cho hoạt động của mình

2/Tách và làm sạch chế phẩm enzyme:

Một điều quan trọng là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa

(homogenizator)

Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate và chất detergent Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ

Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp ( dung dịch đệm Britton pH6, dung dịch đệm

phosphat pH6 ) hoặc các dung dịch muối trung tính

Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý Trước hết đó là nhiệt độ Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5oC) Các thao tác phải nhanh Một số chất điện

ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng của chúng cònphụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp