SẢN XUẤT AMYLASE TỪ BACILLUS ƯA NHIỆT SP. BCC 02150 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BIỂN

Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp. BCC 02150 được 4 phân lập từ môi trường biển 4 Tóm tắt: 4 1. Giới thiệu: 4 2. Nguyên liệu và phương pháp 5 2.1. Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase 5 2.2. Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria 6 2.3. Kiểm tra hoạt tính amylase 6 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6 2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 7 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu 7 2.7. Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau 7 2.8. Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau 7 2.9. Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy trắng 7 2.10. Phân tích thống kê 8 3. Kết quả và thảo luận 8 3.1. Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase 8 3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase 8 Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp. BCC 02150 được 4 phân lập từ môi trường biển 4 Tóm tắt: 4 1. Giới thiệu: 4 2. Nguyên liệu và phương pháp 5 2.1. Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase 5 2.2. Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria 6 2.3. Kiểm tra hoạt tính amylase 6 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6 2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 7 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu 7 2.7. Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau 7 2.8. Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau 7 2.9. Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy trắng 7 2.10. Phân tích thống kê 8 3. Kết quả và thảo luận 8 3.1. Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase 8 3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase 8

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o -

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC: CÔNG NGHỆ LÊN MEN

SẢN XUẤT AMYLASE TỪ BACILLUS ƯA NHIỆT SP BCC 021-50

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BIỂN

Sinh viên thực hiện:

Phạm Cẩm Duyên 1610531Nguyễn Tú Anh 1610089Nguyễn Xuân Uyên 1614048Phạm Thị Mai Hương 1611470Giáo viên hướng dẫn: Hoàng AnhHoàng

Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp BCC 021-50 được

phân lập từ môi trường biển

Tóm t t: ắ

Thiết bị lên men có chi phí cao là một trong những rào cản kỹ thuật trongsản xuất amylase từ các nguồn vi sinh vật Amylase được sử dụng trong một sốquy trình, ngành công nghiệp Ví dụ, trong ngành công nghiệp thực phẩm, đườnghóa, và trong ngành công nghiệp tẩy rửa và dệt may Trong nghiên cứu này, các visinh vật biển đã được phân lập để xác định vi sinh vật sản xuất amylase duy nhấttrong môi trường thạch Hơn 50 chủng vi khuẩn có hoạt tính amylase dương tính,được phân lập từ nước biển và đất, được sàng lọc để sản xuất amylase trong môi

trường thạch Bacillussp BCC 021-50 được tìm thấy là chủng sản xuất amylase tốt

nhất trong môi trường thạch và trong điều kiện lên men chìm Tiếp theo, điềukiện lên men được tối ưu hóa cho sự phát triển của vi khuẩn và sản xuấtenzyme Nồng độ amylase cao nhất là 5211 U/mL thu được sau 36h ủ ở 50 ° C, pH8.0, sử dụng 20 g/L mật rỉ đường làm nguồn năng lượng và 10 g /L peptone làmnguồn nitơ Từ quan điểm ứng dụng, amylase thô được đặc trưng về nhiệt độ và

pH Hoạt tính amylase tối đa được ghi nhận ở 70°C và pH 7.5 Tuy nhiên, kết quảcho thấy những ưu điểm rõ rệt cho sự ổn định của enzyme trong môi trườngkiềm, nhiệt độ cao và độ ổn định khi có mặt chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩytrắng

1 Giới thiệu:

Các enzyme Amyloglucosidase tham gia vào quá trình thủy phân các nguyênliệu tinh bột thành các oligosaccharides và sản phẩm cuối cùng là các đơn phânglucose Amylase có ba loại, bao gồm α-amylase thủy phân liên kết α-1,4 và bỏ

qua các liên kết nhánh, β-amylase phá vỡ α-1,4 và không thể bỏ qua các liên kếtnhánh α-1,6 và tạo ra maltose làm sản phẩm, γ-amylase (glucoamylase) thủy phânα-1,4 và α-1,6, do đó giải phóng monosaccharides là sản phẩm cuối cùng Amylaseđược áp dụng trong một số quy trình công nghiệp, bao gồm đường hóa củanguyên liệu tinh bột, dược phẩm, thực phẩm, và các chất tẩy rửa và công nghiệpdệt Amylase được sản xuất từ tất cả các nguồn tự nhiên (thực vật, động vật, visinh vật) và nhu cầu sản xuất liên tục tăng lên do có nhiều ứng dụng trong côngnghiệp Do đó, các nguồn vi sinh vật được khai thác cho một số sản phẩm sinh họccông nghiệp quan trọng Trong số các vi sinh vật, các chủng vi khuẩn được ưu tiênhơn các chủng nấm để sản xuất enzyme và các sản phẩm giá trị gia tăng khác.

Một số vi sinh vật trên cạn đã được sử dụng để sản xuất enzyme, ví dụ,protease, xylanase, amylase, chitinase, cellulase, lipase và inulinase Tuy nhiên, có

ít các nghiên cứu đề cập đến lĩnh vực sản xuất α-amylase từ các chủng vi sinh vậtbiển Hơn nữa, vi sinh vật biển được nghiên cứu để sản xuất các enzyme có tínhchất công nghiệp quan trọng, chẳng hạn như ổn định ở nhiệt độ cao và điều kiện

pH kiềm Những đặc tính của vi khuẩn có vai trò quan trọng đối với việc sản xuấtamylase bằng cách sử dụng các nguyên liệu có hiệu quả về kinh tế làm nguồnnăng lượng

Chi phí của môi trường lên men cao là một trong những mối quan tâmchính trong sản xuất amylase từ các nguồn vi sinh vật Nhu cầu amylase liên tụctăng lên và các nhà nghiên cứu đang cố gắng thiết lập các quá trình lên men cótính kinh tế Một số phụ phẩm của ngành công nghiệp và nông nghiệp đã được sửdụng cho sản xuất amylase Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các chủng vi sinhvật mới để tạo ra các enzym amylase với các đặc tính phù hợp với ngành côngnghiệp Ví dụ, amylase ổn định pH kiềm, ổn định nhiệt và chất hoạt động bề mặt

ổn định Ngoài ra, những vi sinh vật này nên sử dụng nguồn nguyên liệu phế thảinông nghiệp làm nguồn cacbon và nitơ để đạt hiệu quả về chi phí Do đó, trongnghiên cứu này, các vi sinh vật biển đã được phân lập và sàng lọc để sản xuấtamylase

Nghiên cứu hiện tại đã được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho

sự phát triển của Bacillus sp BCC 021-50 và sản xuất nồng độ amylase cao từ

chủng vi khuẩn biển được phân lập và có thể đóng vai trò hiệu quả trong quá trìnhthương mại hóa sản xuất amylase

2 Nguyên liệu và phương pháp

2.1 Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase

Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ đất biển và nước gần bờ biển đểsản xuất amylase Bước sàng lọc để có được các chủng tốt nhất cho việc sản xuấtamylase bằng cách cấy trong môi trường thạch tinh bột Môi trường chứa tinh bộthòa tan (20 g /L), peptone (20 g /L), thạch agar (20 g /L) và các đĩa được ủ trong48h Sau 48h ủ, các đĩa được đổ ngập dung dịch iốt để quan sát sự hình thànhvùng ức chế do thủy phân tinh bột Một số chủng vi khuẩn đã được sàng lọc vàkích thước của các vùng ức chế là 12-40 mm Các chủng cho thấy kích thước vùng

32, 35 và 40 mm được chọn cho các thí nghiệm lên men Bacillussp BCC 021-50

được xác định và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo là chủng tốt nhất dựa trênhình thái (nhuộm đơn và nhuộm gram) và phản ứng sinh hóa (catalase và Voges-Proskauer)

2.2 Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria

Trong bước đầu tiên, chủng được kích hoạt trên môi trường LB chứa 10 g /Ltryptone, 5 g /L cao nấm men, và 10 g /L NaCl Sau đó, các tế bào vi khuẩn được ủ

ở 37°C trên máy lắc trong 24 giờ ở 150 vòng/phút 10% v/v ( thể tích chất

tan/100ml dd) nuôi cấy đã được chuyển sang môi trường nuôi cấy cơ bản (basalmedium : không cần ưu tiên cho một loại tế bào nào phát triển) dùng để nuôi tiếptheo hay dùng để tạo dòng: (glucose (20 g /L), cao nấm men (10 g /L),MgSO 4·7H 2 O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L) ), CaCl 2 (2 g/L), và KH2PO 4 (2 g/L)), và ủ ở

120 vòng/phút, ở 37°C trong 18h Cuối cùng, 2% v/v cấy được sử dụng trong môi

trường để sản xuất enzyme (glucose (20 g/L), chiết xuất men (10 g/L),MgSO 4·7H 2O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L), CaCl 2 (2 g/L), và KH2PO 4(2 g/L)) và được ủ ở37°C trong 120 giờ trên máy lắc Các mẫu được thu nhận trong khoảng thời gianđều đặn là 12 h và OD được đo ở 600 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS Môitrường nuôi cấy được ly tâm trong 10 phút để thu thập phần nổi trên mặt khôngchứa tế bào cho hoạt tính α-amylase Tất cả các dụng cụ đã được khử trùng ở 115

° C trong 20 phút trước khi cấy

2.3 Kiểm tra hoạt tính amylase

Hoạt tính amylase được kiểm tra dựa trên việc xác định lượng đường khử:Cho vào ống nghiệm 1.0 mL mẫu và môi trường (1.0% w / v tinh bột), lắc

kĩ, ủ ở 37ºC trong 15 phút trong nồi cách thủy Sau 10 phút, phản ứng được dừng

lại bằng cách thêm 2,0 mL thuốc thử DNS rồi giữ trong nước sôi trong 5 phút Làmnguội đến nhiệt độ phòng và đo OD 540 nm, dùng môi trường để set blank Cácthuốc thử khác được thêm vào cùng nồng độ.

Đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme thủy phân 1 µmol glucose dướiđiều kiện thí nghiệm tối ưu

2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sản xuất amylase được kiểm tra ở các nhiệt độ khác nhau:

Chất cấy đã được chuẩn bị trước đó 24 giờ với nồng độ 2% (v/v) được chovào 50ml môi trường lên men trong bình tam giác 250ml Erlen được lắc trên máylắc ở những nhiệt độ khác nhau từ 30 đến 60ºC pH ban đầu 7,0 Ly tâm ở 11,300

× g trong 10 phút ở 10°C Xác định hoạt tính amylase từ dịch nuôi cấy.

2.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bacillus sp BCC 021-50 được nuôi trong erlen 250 ml chứa 50 mL môi

trường lên men, bổ sung 20 g / L nguồn carbon bao gồm glucose, siro, rỉ đường,

fructose, tinh bột, maltose và galactose 2% v/v chất cấy được cấy vào mỗi bình

và nuôi cấy ở nhiệt độ 50°C trong 36 h Ly tâm dịch nuôi cấy (11,300 × g trong 10

phút ở 10 ° C) thu nhận mẫu và bảo quản ở 4°C

2.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu

Các chất nitơ hữu cơ và vô cơ được đánh giá là nguồn nitơ cho sản xuấtamylase Môi trường lên men được bổ sung với nitrate amoni, amoni clorua,amoni sulfat, urê, cao nấm men, casein, tryptone, cao thịt và peptone ở nồng độ

10 g/L

Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp amylase được xác định ở các giá trị pHban đầu khác nhau từ 5,0 đến 11,0 Quá trình lên men và phân tích sinh hóa đượcthực hiện như mô tả ở trên

2.7 Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau

pH 6.0-11.0 được dùng để đánh giá hoạt động tối đa amylase bằng cách

sử dụng các dung dịch đệm khác nhau: đệm phosphat pH 6.0–7.5; dung dịchđệm Tris – HCl pH 8,0–8,5 và dung dịch đệm glycine – NaOH pH 9,0–11,0

Độ ổn định được xác định bằng cách ủ các enzyme trong các dung dịchđệm trên trong 1 giờ ở 40°C và sau đó hoạt tính amylase được kiểm tra trongcác điều kiện khảo nghiệm

2.8 Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau

Ảnh hưởng của nhiệt độ trên amylase thô được nghiên cứu bằng cách ủphản ứng ở các dải nhiệt độ khác nhau (30-85 °C) trong dung dịch đệm glycine-NaOH (pH 7,5) trong 1 giờ Khả năng chịu nhiệt được xác định bằng cách ủ trướcenzyme trong 1 giờ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-85 ° C

2.9 Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy trắng

Để ứng dụng amylase thô trong các quá trình công nghệ sinh học “đặcbiệt trong các công nghiệp chất tẩy rửa”, tính ổn định được xác định bằng chấthoạt động bề mặt và chất tẩy trắng Tính ổn định của amylase được thử nghiệmvới sự có mặt của Triton X-100, Tween 20 và 40, Sodium dodecyl sulfate (chấthoạt động bề mặt) và sodium hypochlorite (chất tẩy trắng) trong điều kiện thínghiệm tối ưu (pH 7,5 và 40°C trong 1 giờ) Hoạt tính amylase với việc bổ sungcác hợp chất khác nhau được đo bằng phần trăm hoạt tính tương đối so với đốichứng 100% (không có chất phụ gia)

2.10 Phân tích thống kê

Thí nghiệm được làm lại 3 lần T-test được thực hiện tại p <0,05.

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase

Chi phí môi trường lên men là một trong các yếu tố quan trọng trong sảnxuất enzyme từ vi sinh vật và việc sử dụng chất thải nông nghiệp-công nghiệp cóthể đóng vai trò đáng kể trong sự cắt giảm chi phí Việc phân lập các chủng vi sinhvật có tại địa phương và các chất nền giá rẻ có thể tạo ra amylase có giá thấp vàgiảm chi phí sản xuất enzyme Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cố gắng thiết

lập các quá trình lên men có tính kinh tế với chủng Bacillus sp BCC 021-50

Trước đây, sản xuất amylase đã được thực hiện từ một số chủng vi khuẩn và

nấm, bao gồm Bacillus megaterium [ 12 ], Bacillus amyloliquefaciens 04BBA15

[ 13 ], chủng Bacillus cereus BRSC-S-A26MB [ 14 ], Bacillus sp RKY3[ 15 ], Penicillium expansum MT-1 [ 16 ], và Aspergillus fumigatus [ 17 ] Vì việc sửdụng amylase ngày càng tăng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, nhiều nhóm nghiêncứu quan tâm đến việc phân lập và sàng lọc các chủng siêu sản xuất amylase từnhiều nguồn khác nhau Trong quá trình nghiên cứu hiện tại, hơn 50 chủng vikhuẩn đã được phân lập từ một bờ biển địa phương Các chủng này được sàng lọccho hoạt động thủy phân tinh bột bằng môi trường thạch tinh bột Một số chủngcho thấy kết quả dương tính với hoạt tính amylase với sự hình thành vùng rõ ràng

và một vài trong số chúng được chọn để xác nhận thêm hoạt tính amylase ngoại

bào trong môi trường lên men Loại tốt nhất được xác định là Bacillus sp BCC

021-50 theo định danh Bergey BCC 021-50 có thể tạo ra các enzyme ngoại bào vàđiều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa cho hiệu suất amylase cao nhất có thể

3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase

Điều kiện lên men của vi khuẩn Bacillus sp.được tối ưu hóa về thời giannuôi cấy, nhiệt độ, nguồn cacbon, nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu đếntăng trưởng và nồng độ α-amylase cao nhất.Biểu đồ thời gian sản xuất amylase và

sự tăng trưởng của BCC 021-50 được thể hiện trong Hình 1.Nồng độ amylasetrong môi trường nuôi cấy tăng theo thời gian, lên đến 1634 U/mL, sau 36h vàgiảm sau đó.Từ đó cho thấy rằng sản xuất amylase phụ thuộc vào tăng trưởng của

vi sinh vật.Sự giảm nồng độ amylase trong thời gian ủ thêm có thể là do sự tăngtrưởng của tế bào, sự thiếu hụt chất dinh dưỡng và sự thay đổi pH [ 18 ]

Trong các nghiên cứu trước đây, sản xuất amylase cao nhất từ Bacillus

licheniformis sau 36 h dưới quá trình lên men trạng thái rắn, nguồn carbon sử

dụng là trấu [ 19 ], nhưng 20% nồng độ phần trăm thể tích chất cấy được dùng để

so với việc sử dụng 2% nồng độ phần trăm thể tích Việc nồng độ chất cấy cao hơn

có thể hiệu quả về chi phí nếu thời gian xử lý giảm đáng kể cho sản xuất amylasequy mô lớn Một nghiên cứu khác [ 20 ] đạt được nồng độ amylase cao nhất

từ Bacillus amyloliquefaciens sau 42 giờ khi cám lúa mì và bánh dầu lạc được bổ

sung làm nguồn carbon Elhalem và cộng sự [ 21 ] thu được sản lượng amylase tối

đa từ Bacillus amyloliquefaciens sau 48 h ủ trong điều kiện lên men ngập

nước Ngược lại, Bozic và cộng sự [ 22 ] thu được năng suất amylase tối đa

từ Bacillus licheniformis sau 72 giờ trong điều kiện bình lắc Ackan và cộng

sự [ 23 ] tìm thấy năng suất amylase tối đa từ Bacillus subtilis RSKK96 sau 72 giờ

ủ Hoạt tính amylase được kích thích bởi các ion canxi (Ca 2+ ) [ 24 ], và hầu hết cácα-amylase là các metalloenzyme, do đó, CaCl2 là nguồn nitơ tốt nhất cho môitrường lên men

Hình 1 Đồ thị lên men mẻ trong sản xuất amylase và sự sinh trưởng của Bacillus sp BCC 021-50 trong môi trường tổng hợp chứa (g / L) glucose (20), chiết xuất nấm men (10), MgSO4 ⋅7H2O (1.0), NaCl (10), CaCl2 (2.0) và KH2PO4 (2.0), ủ trong một thiết bị ủ dạng lắc ở 37 °C với pH ban đầu là 7.0 Các thí nghiệm được thực hiện trong ba lần và dữ liệu được trình bày trong hình là trung bình của ba thí nghiệm song song Thanh lỗi được hiển thị cho độ lệch chuẩn.

Hình 2 thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên men trong quá trình tổnghợp amylase từ Bacillus sp BCC 021-50 (30-60oC ), khi phát triển trong môitrường lên men có chứa 20g/L glucose, 10g/L dịch chiết nấm men và ủ trong 36h,

pH ban đầu 7.0 Nồng độ enzyme tăng khi tăng nhiệt độ, và năng suất amylase tối

đa được ghi nhận ở 50oC (3314 U/mL ) Nhiệt độ tăng thêm làm giảm hoạt tínhamylase, có thể là do sự tăng trưởng của vi sinh vật và sự biến tính của enzyme ởnhiệt độ cao hơn Như đã báo cáo trước đây, nồng độ amylase cao nhất thu được

từ chủng Bacillus ở 45oC trên môi trường thạch tinh bột, và Bozic và cộng sự thuđược sự sản xuất amylase tối đa từ Bacillus licheniformis ở 37oC, tìm được mộtchuẩn độ amylase tối đa từ Bacillus subtilis RSKK96 ở 37oC sau 72h ủ trong điềukiện lên men chìm Vi sinh vật ưa nhiệt được yêu cầu cho sản xuất amylasethương mại để giảm thiểu nguy cơ bị nhiễm và thu được các enzyme chịu nhiệt.Kết quả của chúng tôi cho thấy tính chất ưa nhiệt và tăng trưởng của chủng mớiđược phân lập đã đạt được trong điều kiện lên men trong bình lắc để sản xuấtamylase Các thí nghiệm khác được thiết kế dựa trên kết quả thu được để thực

hiện sản xuất amylase mở rộng có thể tiết kiệm chi phí và năng lượng khử trùng.Ngoài ra, amylase thô sẽ được áp dụng làm nguyên liệu thủy phân tinh bột vàđường lên men có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm sinh hóa cuối cùng.

Trong bước tiếp theo, ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau, baogồm glucose, date syrup, mật đường, fructose, tinh bột và galactose, được kiểmtra nồng độ amylase; các kết quả được hiển thị trong Hình 3 Hàm lượng amylaseảnh hưởng rất lớn bởi các nguồn carbon và năng suất enzyme cao nhất là4827U/mL thu được khi 20g/L mật đường được bổ sung làm nguồn carbon so vớicác loại đường khác Trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, mật đường vàdate syrup được đánh giá là nguồn carbon có hiệu quả chi phí cho sản xuấtprotease, pectinase và alkaline phosphate Tuy nhiên, dư lượng công nghiệp nôngnghiệp, mật đường và date syrup được sử dụng trong môi trường lên men để sảnxuất amylase từ Bacillus sp BCC 021-50