Bài báo cáo nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến lá Sake qua quá trình trích ly hàm lượng Polyphenol bao gồm: Các bước thực hiện, quy trình, các nguyên liệu cần chuẩn bị, công thức tính, ANOVA.... và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Vitamin
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG TRONG LÁ SAKÊ Tóm tắt Polyphenol có tiềm thành phần ứng dụng tốt chế biến thực phẩm, y học mỹ phẩm có tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng chống lão hóa cho người Trong báo cáo nhóm thực thí nghiệm trích ly polyphenol từ sakê thơng qua khảo sát bốn yếu tố ảnh hưởng nồng độ dung môi, tỉ lệ dung môi, nhiệt độ thời gian trích ly Khảo sát ethanol nồng độ (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 90%), tỉ lệ/dung môi (1:10, 1:20,1:30, 1:40, 1:50 (g/ml)), nhiệt độ (50 0C, 600C, 700C, 800C, 900C) thời gian (40, 50, 60,70,80 phút) Hàm lượng polyphenols mẫu trích ly xác định phương pháp dùng thuốc thử FolinCiocalteu Kết thí nghiệm đánh giá thơng qua hàm lượng TPC dịch chiết thu tốt nồng độ dung môi 80% cho hàm lượng polyphenol 19,749 ± 120,150e , tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:30 thu dịch polyphenol 8,864 ± 35,765b , nhiệt độ 80oC cho hàm lượng polyphenols 12,906 ± 250,980b mg/g thời gian 50 phút thu 8,569 ± 50,321 d mg/g Từ cho kết luận nồng độ, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi, nhiệt độ thời gian làm ảnh hưởng đến q trình trích ly hàm lượng polyphenols sakê Giới thiệu Sakê (Artocarpus altilis) thuộc họ dâu tằm, trồng khu vực nhiệt đới Đơng Nam Á đảo Thái Bình Dương, Sakê gỗ lớn, cao khoảng 1520m, Lá loại chứa nhiều polyphenol [1] Polyphenol biết chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa ngăn ngừa hình thành loại phản ứng peroxit hydro peroxyt (H2O2), vô hiệu hóa gốc tự cách bắt giữ gốc tự có khả chống tiểu đường, kháng khuẩn chống ung thư [2] Mức tiêu thụ polyphenol 1g/ngày cao gấp 10 – 100 lần so với vitamin E [3] Việc sử dụng chiết xuất sa kê 400 mg / kg BW có tác dụng chống lại tổn thương tụy tốt metformin Bảo vệ tuyến tụy chống lại ROS ảnh hưởng đến tiết insulin thích hợp [4] Do tiềm chúng chất bảo vệ sức khỏe chất bảo quản thực phẩm, cần phải tối đa hóa việc chiết xuất hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật Một số điều kiện chiết xuất, bao gồm kích thước hạt trà, nhiệt độ pha, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi, loại dung môi số lần chiết xuất nguyên liệu có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu chiết xuất thành phần chiết xuất.[5] Mục đích nghiên cứu : khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly polyphenol từ sakê - Ảnh hưởng nồng độ dung môi Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu dung môi Ảnh hưởng nhiệt độ Ảnh hưởng thời gian Hàm mục tiêu: - Hàm lượng polyphenol tổng - Khả kháng oxy hóa Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng Lá Sakê sử dụng thí nghiệm thu hái từ công viên Đồng Diều phường quận TP HCM 2.1.2 Hóa chất thiết bị Hóa chất Thuốc thử Folin-Ciocalteu (merck) Acid galic (acid 3,4,5-trihydroxybenzoic) Sodium carbonate (Na2CO3 7,5%) Etanol DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Vitamin C Thiết bị Máy sấy Máy đo Genesys 10S UV-Vis Cân phân tich cân kỹ thuật Tủ lạnh Bể ổn nhiệt 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu mẫu Lá sake sau thu mua đem lên phịng thí nghiệm rửa để khô, cho vào thiết bị sấy, sấy đến sake khơ sau đem xay nhuyễn thu hỗn hợp đồng Bảo quản sản phẩm túi zip để tránh hút ẩm trước tiến hành bước Lá sakê Sấy Nghiền Bột sakê 2.2.2 Phương pháp a) Phương pháp xác định ẩm Nguyên tắc: dựa nguyên tắc sấy đến khối lượng không đổi Cách thực hiện: Cân khối lượng đĩa nắp (mo) Sau cân 2g mẫu bột giàn bề mặt phần mẫu đĩa (giảm tối đa tiếp xúc với khơng khí) Đậy nắp cân khối lượng mẫu đĩa nắp (m 1), cho vào tủ sấy mở nắp đĩa sấy 1050C 90 phút, kết thúc thời gian sấy, đậy nhanh nắp đĩa đặt vào bình hút ẩm đến nguội, sau cân đĩa, nắp mẫu (m2) Tiếp tục sấy mẫu áp suất 105 oC 30 phút, để vào bình hút ẩm chờ nguội cân lại khối lượng sau sấy Lặp lại nhiều lần, lần sấy 30 phút, khối lượng không đổi Thí nghiệm lặp lại lần Cơng thức tính hàm lượng ẩm tính sau: H=(m 1−m2) × 100 % m 1−m Trong đó: m0: khối lượng đĩa rỗng nắp sấy, tính gam (g) m1: khối lượng đĩa với phần mẫu thử nắp trước sấy, tính gam (g) m2: khối lượng đĩa với phần mẫu thử nắp sau sấy, tính gam (g) Lấy kết trung bình cộng lần thí nghiệm b) Phương pháp xác định hàm lượng tro Cân 3g mẫu (m0), chuyển mẫu vào chén không nén chặt, đốt sơ chén bếp điện phần mẫu thử cacbon hóa hồn tồn Sau đó, đặt chén vào lị nung, dùng nhiệt độ cao 500-550 oC trì nhiệt độ cho Đặt chén với tro vào bình hút ẩm, cân (m1) Hàm lượng tro tính theo % khối lượng mẫu khơ tính cơng thức m1 × Trong đó: 100 100 × m0 100−H m0: Khối lượng phần mẫu thử (g) m1: Khối lượng tro sau nung (g) H: Độ ẩm mẫu Lấy kết trung bình cộng lần thí nghiệm c) Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC) Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng Nguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa thuốc thử Folin- Ciocalteu (hỗn hợp oxyda tungsten molybdenum) để tạo thành hợp chất có màu xanh Cường độ đậm màu tỉ lệ thuận với nồng độ phenolic có mẫu Sử dụng phương pháp so màu, đo độ hấp thu bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo acid gallic, ta suy hàm lượng tổng hợp chất phenolic có mẫu phân tích Cách thực hiện: - Tổng hàm lượng polyphenol (TPC) dịch sake xác định theo phương pháp Folin- Ciocalteu Thuốc thử Folin- Ciocalteu loãng, 10% (thể tích): dùng pipet chuyển 10 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu vào bình định mức vạch 100 ml Định mức nước cất đến vạch - Natri cacbonat 7,5%: cân 37,50 g natri cacbonat khan (Na 2CO3) cho vào bình định mức vạch 500 ml nước cất Lắc để hịa tan natri cacbonat Các mẫu thí nghiệm lặp lại ba lần - Đo độ hấp thụ mẫu bước sóng 760 nm Hàm lượng polyphenol tổng mẫu thể qua mg đương lượng acid gallic gam chất khô (mg GAE/g) - Số liệu trình bày dạng đồ thị thí nghiệm Dữ liệu phân tích thống kê theo phương pháp ANOVA với độ tin cậy 95%.Thí nghiệm lặp lại lần Đo hàm lượng polyphenol phương pháp dựng đường chuẩn acid galic - Từ dung dịch acid gallic gốc, tiến hành pha dãy chuẩn acid gallic (0 µg/ml,10 µg/ml, 20 µg/ml, 30 µg/ml, 40 µg/ml, 50 µg/ml) - Hút 0,2ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm - Cho vào ống nghiệm 1ml Foline- Ciocalteu Lắc để yên phút - Thêm 0,8 ml Na2CO3 7,5% Lắc - Mang ủ tối vòng 60 phút nhiệt độ thường, sau đo độ hấp thu bước sóng 760nm Thí nghiệm lặp lại lần d) Xác định hoạt tính kháng oxy hóa vitamin C Cơng thức cấu tạo DPPH Hình 1: (2-2)-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH Gốc tự DPPH •( màu tím) bị khử thành hydrazine ( màu vàng) phản ứng với chất cho hydro (chất chống oxy hóa) Nếu DPPH •( màu tím) + H-A → DPPH-H ( màu vàng) + A• DPPH gốc tự bền nhiệt độ phịng, nhận điện tử hay gốc hydro đê trở thành phân tử bền nghịch tù Vì DPPH có điện tử lẻ nên có màu tím đậm Ethanol hấp thu mạnh bước sóng cực đại 515 nm, điện tử lẻ ghép cặp độ hâp thu giảm kéo theo giảm màu tỉ lệ với số điện tử ghép cặp • Cách thực hiện: - Pha dung dịch chuẩn Vitamin C methanol nồng độ: 200; 400; 600; 800; 1000 µM Cho 150 µL dung dịch Vitamin C vào ống nghiệm - Thêm 2.85 mL dung dịch DPPH vào ống nghiệm, lắc Để nhiệt độ phịng bóng tối 30 phút - Mẫu chuẩn thực tương tự trên, thay dung dịch Vitamin C methanol Mẫu trắng methanol - Đo độ hấp thụ bước sóng 515 nm - Dựng đường chuẩn phần trăm bất hoạt (% I) theo nồng độ chuẩn • Cơng thức tính: %I = ( Ac−AcAt )× 100 Trong đó: Ac: Giá trị hấp thu quang phổ mẫu đối chứng At: Giá trị hấp thu quang phổ mẫu thử 2.2.3 Bố trí thí nghiệm: a) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi ethanol Bột Sakê:1g Trích ly Tỉ lệ: 1:20(g/ml) Nồng độ dung môi 0% 20% 40% 60% Nhiệt độ: 60oC Thời gian: 40 phút 80% 90% Lọc Đo OD Tỉ lệ tối ưu Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả sát nồng độ dung môi ethanol Cách thực hiện: - Cho hỗn hợp pha vào bể ổn nhiệt ủ nhiệt độ 60 oC để 40phút, sau 10 phút khuấy lần - Sau 40 phút, lấy hỗn hợp chiết khỏi bể ổn nhiệt để nguội đến nhiệt độ phịng Sau đó, cho vào máy ly tâm với số vòng quay 6000 vòng/phút 15 phút để tách bã - Hút 1ml dịch lọc vào bình định mức 100ml sau định mức tới vạch Hút 0.2ml dung dịch pha loãng vào 1ml dung dịch Folin-Ciocalteu loãng Sau bổ sung thuốc thử Folin-Ciocalteu lỗng vịng phút, dùng pipet lấy 0.8 ml dung dịch natri cacbonat vào ống, lắc để bóng tối 60 phút Sau tiến hành đo độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 760 nm b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu / dung mơi Bột Sakê:1g Trích ly Nhiệt độ: 60oC Thời gian: 40 phút Tỉ lệ (g/ml) 1:20 1:10 Nồng độ dung mơi: thí nghiệm 1:30 1:40 1:50 Lọc Đo OD Chọn tỉ lệ tối ưu Hình 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ dung môi Cách thực hiện: - Cho hỗn hợp pha vào bể ổn nhiệt ủ nhiệt độ 60 oC để 40phút, sau 10 phút khuấy lần - Sau 40 phút, lấy hỗn hợp chiết khỏi bể ổn nhiệt để nguội đến nhiệt độ phịng Sau đó, cho vào máy ly tâm với số vòng quay 6000 vòng/phút 15 phút để tách bã - Hút 1ml dịch lọc vào bình định mức 100ml sau định mức tới vạch Hút 0.2ml dung dịch pha loãng vào 1ml dung dịch Folin-Ciocalteu loãng Sau bổ sung thuốc thử Folin-Ciocalteu lỗng vịng phút, dùng pipet lấy 0.8 ml dung dịch natri cacbonat vào ống, lắc để bóng tối 60 phút Sau tiến hành đo độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 760 nm c) Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến q trình trích ly polyphenol Bột Sakê:1g Trích ly Tỉ lệ: thí nghiệm Thời gian: 40 phút Nhiệt độ trích ly 60oC 50oC Nồng độ dung mơi: thí nghiệm 70oC 80oC 90oC Lọc Đo OD Chọn nhiệt độ tối ưu Hình 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ Cách thực hiện: - Cho hỗn hợp pha vào bể ổn nhiệt ủ nhiệt độ 50, 60, 70, 80,900C để 40phút, sau 10 phút khuấy lần - Sau 40 phút, lấy hỗn hợp chiết khỏi bể ổn nhiệt để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó, cho vào máy ly tâm với số vịng quay 6000 vòng/phút 15 phút để tách bã - Hút 1ml dịch lọc vào bình định mức 100ml sau định mức tới vạch Hút 0.2ml dung dịch pha loãng vào 1ml dung dịch Folin-Ciocalteu loãng Sau bổ sung thuốc thử Folin-Ciocalteu lỗng vịng phút, dùng pipet lấy 0.8 ml dung dịch natri cacbonat vào ống, lắc để bóng tối 60 phút Sau tiến hành đo độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 760 nm d) Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến trình trích ly polyphenol Bột Sakê:1g Trích ly Nhiệt độ: 60oC Nhiệt độ: thí nghiệm 40 phút Thời gian trích ly Nồng độ dung mơi: thí nghiệm 50 phút 70 phút 60 phút 80 phút Lọc Đo OD Chọn thời gian tối ưu Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian Cách thực hiện: - Cho hỗn hợp pha vào bể ổn nhiệt ủ nhiệt độ ( thí nghiệm 3) để khoảng thời gian 40, 50, 60,70,80 phút, sau 10 phút khuấy lần - Sau thời gian khảo sát, lấy hỗn hợp chiết khỏi bể ổn nhiệt để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó, cho vào máy ly tâm với số vịng quay 6000 vòng/phút 15 phút để tách bã - Hút 1ml dịch lọc vào bình định mức 100ml sau định mức tới vạch Hút 0.2ml dung dịch pha loãng vào 1ml dung dịch Folin-Ciocalteu loãng Sau bổ sung thuốc thử Folin-Ciocalteu lỗng vịng phút, dùng pipet lấy 0.8 ml dung dịch natri cacbonat vào ống, lắc để bóng tối 60 phút Sau tiến hành đo độ hấp thụ máy đo quang phổ bước sóng 760 nm 2.2.4 Xử lý nguyên liệu qua vi sóng 2.2.4.1 Xử lý (nguyên liệu + dung mơi) qua vi sóng Cách thực hiện: - Sử dụng tỉ lệ nguyên liệu / dung môi( thí nghiệm 2) cho vào lị vi sóng bắt đầu gia nhiệt - Thời gian gia nhiệt :2 phút Thí nghiệm 5: Khảo sát hàm lượng polyphenol thu hỗn hợp (nguyên liệu+ dung môi ) qua xử lí vi sóng Thí nghiệm 5.1: Khảo sát ảnh hưởng cơng suất lị vi sóng Bột Sakê:1g Vi sóng Nồng độ: thí nghiệm1 Tỉ lệ: thí nghiệm Thời gian vi sóng: Cống suất 180W 360W 540W 720W 900W Trích ly Lọc Nhiệt độ: thí nghiệm Đo OD Thời gian: thí nghiệm Chọn cơng suất tối ưu Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát cơng suất lị vi sóng Cách thực hiện: - Xử lí mẫu thí nghiệm cơng suất khác (180W, 360W,540W, 720W, 900W) - Thời gian gia nhiệt: phút - Mỗi mẫu công suất tiến hành khảo sát khả trích ly thơng số xác định thí nghiệm 1,2,3,4 - Thực tương tự công suất nghiệm thức lặp lại lần Thí nghiệm 5.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lí vi sóng Bột Sakê:1g Vi sóng Nồng độ: thí nghiệm1 Tỉ lệ: thí nghiệm Cơng suất vi sóng: Thời gian 10s 15s 20s 25s 30s Trích ly Lọc Nhiệt độ: thí nghiệm Đo OD Thời gian: thí nghiệm Chọn thời gian tối ưu Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lị vi sóng Cách thực hiện: - Xử lí mẫu thí nghiệm mốc thời gian khác nhau: 10s, 15s, 20s, 25s, 30s với cơng suất cố định thí nhiệm 5.1 - Mỗi mẫu mốc thời gian tiến hành khảo sát khả trích ly thơng số xác định thí nghiệm 1,2,3,4 - Thực tương tự mốc thời gian nghiệm thức lặp lại lần - So sánh hàm lượng polyphenol thu trước sau xử lí vi sóng 2.2.5 Xử lý số liệu Tất thí nghiệm bố trí lặp lại lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA Số liệu phân tích ANOVA phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng STATGRAPHICS Centurion XV.I thực để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giá trị với mức ý nghĩa P< 0,05 Kết biện luận 3.1 Xác định độ ẩm Hàm lượng ẩm có bột sakê 13,29% 3.2 Xác định hàm lượng tro Hàm lượng tro có bột sakê 15,18% 3.3 Phương trình đường chuẩn Phương trình đường chuẩn acid gallic Đường chuẩn acid gallic dựng nhờ chương trình Microsoft Excel Với trục tung mật độ quang trục hoành nồng độ chất chuẩn Phương trình thể mối tương quang phenolic bước sóng 760 nm : y= 0.0113x- 0.0115 Trong x hàm lượng phenolic ( mgGAE/g), y giá trị OD 760 nm tương ứng Hệ số tương quan R2=0.9943 chứng tỏ mối liên quan x y chặt chẽ Tổng hàm lượng phenolic dịch chiết thu tính theo phương trình đường chuẩn minh họa hình 0.6 f(x) = 0.011332 x − 0.0115333333333334 R² = 0.994283431270931 Độ hấp thụ (OD) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 Nồng độ Acid garlic (mgGAE/g) Hình 8: Đồ thị đường chuẩn acid gallic Phương trình đường chuẩn Vitamin C 60 Đường chuẩn acid gallic dựng nhờ chương trình Microsoft Excel Với trục tung mật độ quang trục hoành nồng độ chất chuẩn Phương trình thể mối tương quang phenolic bước sóng 515 nm : y=0.3431x-1.3406 Trong x khả kháng oxy hóa ( mg VitC/g), y giá trị OD 515 nm tương ứng Hệ số tương quan R 2=0.9906 chứng tỏ mối liên quan x y chặt chẽ Tổng hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết thu tính theo phương trình đường chuẩn minh họa hình 35.000 f(x) = 0.343148507858026 x − 1.34057331214317 R² = 0.990627019160879 Độ hấp thụ (OD) 30.000 25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0.000 20 40 60 80 100 120 Nồng độ Vitamin C (mgVitC/g) Hình 9: Đồ thị đường chuẩn Vitamin C 3.4 Ảnh hưởng nồng độ trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (TPC ) hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết bột Sakê Ethanol dung mơi có khả hịa tan hoạt chất sinh học tốt Sử dụng ethanol nồng độ khác có hiệu q trình trích ly khác Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ dung mơi trích ly đến hàm lượng polyphenol trích ly hoạt chất chống oxy hóa Kết thu bảng sau: Bảng 1: Ảnh hưởng nồng độ dung mơi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (TPC ) hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết bột Sakê Hàm lượng Polyphenol (mg GAE/g) 3,637 ± 84,419a 8,186 ± 81,108b 15,295 ± 48,740c 17,035 ± 26,549d 19,749 ± 120,150e 17,035 ± 91,957d Nồng độ Hàm lượng polyphnol (mg GAE/g chất khô) 20 40 60 80 90 Hoạt tính chống oxy hóa (mg VitC/g) 65.347 ± 5.216a 73.810 ± 5.968ab 80.169 ± 4.230b 92.338 ± 6.424c 105.148 ± 1.820d 100.298 ± 6.424c 25.000 20.000 15.295 15.000 0.000 19.749 17.035 8.186 10.000 5.000 17.035 3.673 20 40 60 80 90 Hàm lượng gố c tự (m g VitC/g chất khô) Nồng độ dung môi (%) 120.000 100.000 80.000 60.000 65.347 73.810 80.169 20 40 92.338 105.148 100.298 80 90 40.000 20.000 0.000 60 Nồng độ dung mơi (%) Hình 10: Ảnh hưởng nồng độ dung mơi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (TPC ) hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết bột Sakê Chú thích: Trong cột, số trung bình theo sau chữ giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức ý nghĩa p