ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN L1, E6 VÀ E7 CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN MỘT SỐ NHÓM ĐỐI TƯỢNG VÀ PHÁT TRIỂN BỘ MẪU CHUẨN CHO 14 TÝP NGUY CƠ CAO Ở VIỆT NAM. TT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG LƯU THỊ DUNG ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN L1, E6 VÀ E7 CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN MỘT SỐ NHÓM ĐỐI TƯỢNG VÀ PHÁT TRIỂN BỘ MẪU CHUẨN CHO 14 TÝP NGUY CƠ CAO Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022 CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU NÀY ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vân Trang GS TS Phan Thị Ngà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: GS TSKH Nguyễn Đăng Hiền PGS TS Nguyễn Quang Huy PGS.TS Lê Văn Bé Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Vào hồi …giờ …, ngày …tháng …năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen VAN Trang , Kiesha Prem , Zheng Quan Toh , Bui Thi Viet Ha , Pham Thi Ngoc Lan , Hau Phuc Tran , Quang Duy Pham , Nghia VAN Khuu , Mark Jit , Dung Thi Luu, LE Thi Khanh Ly , VAN Cao , Tam Duong LE Ha , Kathryn Bright , Suzanne M Garland , Dang Duc Anh , Kim Mulholland (2022) Prevalence and Determinants of Vaginal Infection With Human Papillomavirus Among Female University Students in Vietnam In Vivo, 36(1), pp.241-250 Chu Thi Ngoc Mai, Nguyen Van Chien, Luu Thị Dung, Tran Thi Nguyet Lan, Le Thi Khanh Ly, Dang Đuc Anh, Nguyen Van Trang (2021) Establishment of specifications of the multiplex real-time PCR kit (NIHERealtimePCR hrHPV) for the detection of high-risk HPV genotypes Vietnam Journal of Preventive Medicine, 31 (4), pp 28-36 Lưu Thị Dung, Chử Thị Ngọc Mai, Trịnh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Khánh Ly, Lê Anh Tuấn, Đoàn Hải Yến, Phan Thị Ngà, Nguyễn Vân Trang Đặc điểm phân tử chủng HPV68 phát phụ nữ Việt Nam Tạp chí Y học dự phòng, 2022, 32 (3), tr 9-22 Lưu Thị Dung, Vũ Thị Thu Hường, Đoàn Hữu Thiển, Đinh Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Tường An, Chử Thị Ngọc Mai, Phan Thị Ngà, Nguyễn Vân Trang Thiết lập mẫu chuẩn cho 14 týp HPV nguy cao để xây dựng đánh giá tiêu chí kỹ thuật cho sinh phẩm chẩn đoán HPV phương pháp Realtime-PCR Tạp chí Y học dự phịng, 2022, 32 (3), tr 23-33 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Human papillomavirus (HPV) vi rút gây 95% bệnh u nhú người Trong đó, ung thư cổ tử cung (UTCTC) bệnh ung thư phổ biến thứ tư phụ nữ toàn cầu, ước tính có khoảng 604.000 ca mắc 342.000 ca tử vong vào năm 2020 Hiện có 200 týp HPV xác định, 40 týp HPV lây lan trực tiếp qua đường tình dục chia thành nhóm, nhóm14 týp HPV nguy cao bao gồm HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 68 nhóm HPV nguy thấp Trong số này, HPV16 HPV18 nguyên nhân gây khoảng 70% UTCTC, týp HPV cịn lại gây số loại ung thư hậu môn (UTHM), hầu họng, dương vật, âm hộ âm đạo mụn cóc sinh dục nam nữ Sau nhiễm HPV từ 15 đến 20 năm, UTCTC phát triển phụ nữ có hệ miễn dịch bình thường nên việc xét nghiệm để phát sớm nhiễm HPV có ý nghĩa sàng lọc điều trị HPV có vật liệu di truyền ADN mạch vòng kép, dài khoảng 7900 cặp bazơ, phân thành vùng mã hóa vùng khơng mã hóa Vùng mã hóa có khoảng đến khung đọc mở, mã hóa cho protein sớm (E) gồm gen E1, E2, E4-E7 protein muộn (L) gồm L1 L2 Các protein E6 E7 tác động đến chu kì tế bào chế chết theo chương trình, kết tăng sinh biến đổi gây ung thư Do E6 E7 đích cho thiết kế liệu pháp gen điều trị Trong đó, khung đọc mở L1 mã hóa protein capsid (55 kDa) tạo nên phần lớn vỏ capsid vi rút bề mặt tiếp xúc Vì vậy, phân tích đặc điểm đa hình vùng gen E6 E7 có ý nghĩa nghiên cứu chế bệnh học phân tử liên quan đến ung thư, đồng thời phân tích đa hình vùng gen L1 đặc biệt quan trọng phân loại phát triển vắc xin sử dụng công nghệ hạt giả vi rút Tại Việt Nam có vài nghiên cứu dịch tễ học phân tử nhóm đối tượng phụ nữ chưa có nghiên cứu thực nhóm đối tượng nữ sinh viên, phụ nữ bán dâm (PNBD) nam có quan hệ tình dục đồng giới (MSM) Vì vậy, chúng tơi tiến hành định týp HPV giải trình tự gen E6, E7 L1 14 týp HPV nguy cao phân lập từ mẫu bệnh phẩm nữ sinh viên, PNBD MSM số mẫu HPV lưu Việt Nam Từ đó, chúng tơi xác định tỷ lệ nhiễm liên quan đến số đặc điểm nhân học, phân tích đặc điểm đa hình nucleotit gen L1, E6 E7 để phân loại chủng HPV lưu hành Việt Nam Trong độ đặc hiệu phương pháp xét nghiệm HPV ADN xét nghiệm tế bào học (Pap smear) 94,1% 96,8%, độ nhạy phương pháp xét nghiệm HPV ADN 94,6% cao nhiều so với phương pháp tế bào học (55,4%) Chính vậy, phương pháp phát định týp ADN HPV mẫu bệnh phẩm phương pháp sử dụng nghiên cứu để đo lường gánh nặng bệnh HPV gây đánh giá tác động chương trình tiêm chủng Để có kết thống nhất, có ý nghĩa so sánh tất phịng thí nghiệm HPV phải sử dụng xét nghiệm sinh phẩm có xác, độ nhạy đặc hiệu phù hợp Do vậy, việc phát triển xây dựng mẫu chuẩn cho HPV tương ứng để đánh giá số kỹ thuật cho phương pháp xét nghiệm sinh phẩm chẩn đoán HPV cần thiết Dựa kết phân tích trình tự gen L1, E6 E7 thiết kế 14 plasmid tái tổ hợp cho 14 týp HPV nguy cao đồng thời lựa chọn mẫu lâm sàng người Việt Nam để thiết lập mẫu chuẩn cho việc đánh giá số kỹ thuật sinh phẩm chẩn đoán HPV Realtime-PCR Với mục tiêu đó, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 Human Papillomavirus số nhóm đối tượng phát triển mẫu chuẩn cho 14 týp nguy cao Việt Nam” Mục tiêu luận án - Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 Human Papillomavirus số nhóm đối tượng nam giới có quan hệ tình dục đồng giới, phụ nữ bán dâm nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 - Phát triển mẫu chuẩn nhằm đánh giá sinh phẩm chẩn đoán Realtime-PCR cho 14 týp Human Papillomavirus nguy cao Những đóng góp luận án - Nghiên cứu đưa tỷ lệ nhiễm HPV MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 phân bố týp HPV Việt Nam - Nghiên cứu đưa đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 134 mẫu dựng phát sinh chủng loại cho 14 týp HPV nguy cao - Nghiên cứu phát triển mẫu chuẩn từ 14 plasmid tái tổ hợp mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhằm đánh giá độ nhạy-độ đặc hiệu phân tích, độ nhạy-độ đặc hiệu lâm sàng độ xác sinh phẩm chẩn đốn Realtime-PCR phát 14 týp HPV nguy cao, ứng dụng mẫu chuẩn để đánh giá tiêu kỹ thuật cho sinh phẩm NIHE-Realtime PCR hrHPV Kit 4 Ý nghĩa luận án - Kết đề tài cung cấp thông tin tỷ lệ nhiễm HPV số nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam Phân tích số đặc điểm nhân học nhóm đối tượng Bên cạnh đó, đề tài cung cấp liệu trình tự gen 14 chủng HPV nguy cao lưu hành Việt Nam phát sinh chủng loại chủng Việt Nam so sanh với chủng chuẩn chủng giới Đề tài xây dựng mẫu chuẩn để đánh giá sinh phẩm RealtimePCR cho 14 týp nguy cao ứng dụng mẫu để đánh giá sinh phẩm NIHE-Realtime PCR hrHPV Kit Việc tạo mẫu chuẩn có ý nghĩa quan trọng cho việc xây dựng tiêu kỹ thuật, đánh giá quy trình chất lượng sinh phẩm chẩn đoán 14 týp HPV nguy cao Realtime-PCR Bố cục luận án: Luận án nghiên cứu có tất 150 trang bao gồm: Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu (3 trang), Chương 1: Tổng quan (32 trang), Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (21 trang), Chương 3: Kết nghiên cứu (57 trang), Chương 4: Bàn luận (34 trang), Kết luận kiến nghị (3 trang) Luận án có 198 tài liệu tham khảo có 11 tài liệu tiếng Việt 187 tài liệu tiếng anh Ngoài nội dung trình bày luận án có tất 31 bảng, 31 hình phụ lục kèm theo Chương Tổng quan 1.1 Tổng quan HPV HPV (Human papillomavirus) có kích thước khoảng 5255 nm, khơng có màng ngồi, cấu trúc đối xứng đa diện Protein chủ yếu lớp capsid pentamer cấu trúc L1, có cấu trúc khối từ đơn vị góc cạnh Hệ gen HPV phân tử ADN kép, mạch vòng, siêu xoắn dài khoảng 7200 - 8000 cặp nucleotit (bp), có khoảng đến khung đọc mở liên kết với nhiều phân tử protein kiềm histon Các khung đọc mở mã hóa tồn protein HPV Hệ gen HPV mã hóa cho 8-10 protein Hệ gen HPV phân thành vùng bao gồm vùng mã hóa vùng khơng mã hóa, cịn gọi vùng kiểm sốt dài (LCR) vùng điều hòa thượng nguồn (URR) Vùng mã hóa protein sớm (early – E) bao gồm gen từ E1, E2, E4, E5, E6 E7 protein muộn (late – L) gồm L1 L2 Các protein E6 E7 tác động đến chu kì tế bào chế chết theo chương trình, kết tăng sinh biến đổi (gây ung thư) 1.2 Hệ thống phân loại Danh pháp Papillomavirus cấp loài lồi xác định nhóm nghiên cứu Papillomavirus Ủy ban quốc tế phân loại vi rút (ICTV) Trong nghiên cứu trước đây, hệ thống phân loại HPV dựa trình tự khung đọc mở gen L1, điều đồng ý năm 1995 Hội thảo Papillomavirus tổ chức Quebec Hơn 200 týp HPV xác định phân týp thành chi: α-papillomavirus, βpapillomavirus, γ-papillomavirus, mu-papillomavirus nupapillomavirus Các loại HPV gây ung thư niêm mạc chi alpha nguyên nhân gây UTCTC, UTHM, ung thư sâm hộ, dương vật, âm đạo miệng Các chủng HPV thuộc chi khác có trình tự L1 giống khơng q 60% Các chủng HPV khác chi có trình tự L1 giống từ 60-70% Một chủng HPV xác định thuộc týp cần có khác biệt 10% so với loại HPV khác trước đó.Trình tự tồn hệ gen vi rút HPV sử dụng để phân loại dòng dịng, hai chủng vi rút thuộc týp phân thành dòng khác (A, B, C, D, E, F) có 1-10% nucleotit khác biệt phân thành dòng (A1, A2, B1, B2…) khác chúng có 0,5-1% nucleotit khác biệt (Burk cộng sự) 1.3 Dịch tễ học nhóm đối tượng Nhiễm HPV xảy nam nữ, lứa tuổi lứa tuổi trẻ, khỏe mạnh Dịch tễ học HPV đa dạng tình trạng nhiễm HPV khác nhiều quốc gia Tỷ lệ nhiễm cho thấy tỷ lệ khác đối tượng nhóm đối tượng có nguy cao MSM, PNBD thường cao so với nhóm phụ nữ trẻ Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm MSM khác Quốc gia khác Mỹ 60%, Vương Quốc Anh (17-45%), Trung Quốc (36,4%), Hàn Quốc (83,7%), Thái Lan (58,5%-80%), Đài Loan (74,2%) Tỷ lệ nhiễm tỷ lệ toàn giới 6,6% HPV PNBD trung bình 42,7%,với phụ nữ trẻ châu âu có tỷ lệ 50%, Trung Á (38%), Châu Úc Châu Á (21%), Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu MSM sinh viên, mà có số nghiên cứu nam mại dâm (6-59%) nhóm PNBD Hải Phịng 51,1% miền nam (85%) Vì vậy, liệu nghiên cứu HPV Việt Nam hạn chế cần bổ sung 1.4 Mẫu chuẩn (Panel chuẩn) 1.4.1 Khái niệm thuật ngữ Mẫu chuẩn chất/vật liệu sử dụng thước đo thử nghiệm để đánh giá chất lượng mẫu thử Mẫu chuẩn đặc trưng quy trình có hiệu lực đo lường nhiều tính chất quy định Bộ mẫu chuẩn (Bộ mẫu panel chuẩn) sử dụng sinh học phân tử tập hợp mẫu khẳng định đặc tính mẫu phương pháp chuẩn sinh phẩm lưu hành sử dụng đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán 1.4.2 Phân loại mẫu chuẩn Phân loại theo cấp độ: mẫu chuẩn gốc, mẫu chuẩn thứ cấp Phân loại theo phạm vi: mẫu chuẩn Quốc tế, mẫu chuẩn khu vực/mẫu chuẩn Quốc gia, mẫu chuẩn in-house (chuẩn nội kiểm) Phân loại theo mục đích nghiên cứu: mẫu chuẩn phân tích, mẫu chuẩn lâm sàng 1.4.3 Bộ Panel mẫu chuẩn HPV Viện Quốc gia sinh phẩm chuẩn (National Institute for Biological Standards and Control - NIBSC), Vương Quốc Anh phát triển mẫu chuẩn quốc tế Tổ chức y tế giới WHO ADN vi rút gây u nhú người (HPV) sử dụng xét nghiệm dựa công nghệ axit nucleic (NAT) để phát xác định kiểu gen HPV Tuy nhiên, số lượng mẫu chuẩn khả cung ứng có giới hạn cho phịng thí nghiệm Bên cạnh đó, mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp chứa tồn hệ gen HPV khơng thay panel mẫu chuẩn lâm sàng nghiên cứu, đánh giá 1.3.4 Thành phần mẫu chuẩn HPV - Bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy phân tích - Bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy lâm sàng - Bộ mẫu chuẩn sử dụng xác định độ đặc hiệu phân tích - Bộ mẫu chuẩn xác định độ đặc hiệu lâm sàng - Bộ mẫu chuẩn xác định độ xác 10 Chọn mẫu có chủ đích đủ cỡ mẫu cần thiết để đưa vào nghiên cứu tuyển chọn đủ số lượng mẫu để sử dụng để tạo mẫu chuẩn 2.2.3 Thiết kế nghiên cứu Hình Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.2.4 Phân tích xử lý số liệu Phân tích số liệu sử dụng phần mềm SPSS 20 Các trình tự nucleotit týp so sánh phần mềm Mafft multiple alignment (MAFFT) phiên để phân tích đa hình khung đọc mở E6, E7 L1 Cây phát sinh chủng loại dựa phương pháp maximum likelihood sử dụng phần mềm Geneious, phiên 11.11.5 2.2.5 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu phê duyệt đạo đức nghiên cứu y sinh học định số IRB-VN01057_01/2016 phê duyệt ngày 25/1/2019 13/HĐĐ phê duyệt ngày 5/9/2013 Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Các mẫu có phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu cho phép lưu mẫu để sử dụng cho nghiên cứu sau, với đồng ý hội đồng y đức Thông tin cá nhân đối tượng tham gia bảo mật 11 Chương Kết 3.1 Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 số nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 3.1.1 Tỷ lệ nhiễm HPV số nhóm đối tượng Việt Nam, 2017-2018 Tỷ lệ nhiễm HPV 2989 đối tượng nghiên cứu gồm có 799 MSM, 699 PNBD 1491 nữ sinh viên đại học Hà Nội 29,8%, 26,3% 4,2% Đa nhiễm chiếm tỷ lệ cao gấp 2-4 lần đơn nhiễm Bên cạnh đó, tỷ lệ nhiễm HPV nguy cao xác định nhóm đối tượng nghiên cứu gồm MSM, PNBD nữ sinh viên đại học Việt Nam 24,0%, 17,6 % 3,4% Trong đó, tỷ lệ nhiễm HPV16/18 ghi nhận 10,6% nhóm MSM, 4,0% cho nhóm PNBD 0,7% nhóm sinh viên (Bảng 3.1) Bảng Tỷ lệ nhiễm HPV nhóm đối tượng 12 3.1.2 Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 HPV số nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 134 mẫu phân tích cho thấy đặc điểm dịch tễ học phân tử týp HPV lưu hành Việt Nam Trong đó, týp phân nhánh HPV18 (chủ yếu lưu hành dịng A1, có quan hệ gần gũi với nguồn từ Nhật Bản, Thái Lan), 39 (A2 – Đài Loan), 68 (C2 – Đài Loan, Trung Quốc), 52 (B2 – Nhật Bản, Thái Lan, Trung Quốc) Các týp chủ yếu thuộc lồi alpha có nguồn gốc Đông Á Các týp phân nhánh nhiều bao gồm HPV16, 58, 51, 56, 66, Các týp chủ yếu thuộc loài alpha chủng thuộc alpha khác có kiểu gen giống với chủng nhiều nơi giới, bao gồm quốc gia thuộc châu Á, Mỹ La Tinh Bảng Đa dạng di truyền týp HPV α7 Việt Nam 13 Bảng 3 Đa dạng di truyền týp HPVα9 Việt Nam Bảng Đa dạng di truyền týp HPVα khác Việt Nam 14 3.2 Phát triển mẫu chuẩn nhằm đánh giá sinh phẩm chẩn đoán Realtime-PCR cho 14 týp HPV nguy cao Bảng 3.3 cho thấy kết xây dựng panel mẫu chuẩn tạo từ 14 mẫu plasmid tái tổ hợp tương ứng với 14 týp HPV nguy cao quy trình nhân dịng tạo plasmid chứa đoạn gen đích L1 E6-E7 mẫu bệnh phâm lâm sàng dương tính âm tính sàng lọc PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu PGMY09/PGMY11 định týp sinh phẩm HPV Genotypes 14 Real TM Quant (Sacace, Ý) Genoflow HPV array test kit (Diagcor, Hong Kong) Nồng độ ADN HPV mẫu thành viên xác định Digital PCR (Biorad, Hoa kỳ), panel mẫu chuẩn xây dựng bao gồm 20 mẫu/mỗi panel mẫu chuẩn Các mẫu chuẩn thành viên panel mẫu chuẩn thiết lập đặc tính kỹ thuật, đánh giá độ ổn định lưu trữ điều kiện thích hợp để bảo quản lâu dài (Bảng 3.3) Bảng Danh mục panel mẫu chuẩn phát triển 15 Chương Bàn luận 4.1 Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 HPV số nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm HPV số nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Tỷ lệ nhiễm HPV MSM, PNBD nữ sinh viên 29,8%, 26,4% 4,2% Việc nhiễm týp nguy cao tương ứng với 24,0%, 17,6% 3,4% Trong đó, HPV16/18 tỷ lệ nhiễm nhóm 10,6%, % 0,7 % Tỷ lệ nhiễm HPV MSM tương đồng với Trung Quốc (36,4%) thấp so với Thái Lan (58,5-80%) Đài Loan (74,2%) PNBD cho thấy tỷ lệ thấp so với nghiên cứu trước Việt Nam Nhóm sinh viên cho thấy tỉ lệ nhiễm thấp hẳn so với nước Châu Âu (50%), Châu Á Châu Úc (21%) ½ so với số liệu trung bình nhiễm giới (6,6%) 4.1.2 Đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 HPV số nhóm đối tượng MSM, PNBD, nữ sinh viên Trong nghiên cứu này, tồn 134 trình tự gen L1 (59 mẫu), E6 E7 (75 mẫu) cho 14 týp HPV nguy cao sử dụng để phân tích mơ tả đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng lưu hành nhóm đối tượng MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam 4.1.2.1 Đặc điểm phân tử dạng di truyền týp HPV thuộc alpha a Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV18 Gen L1 E6-E7 phân tích tương ứng chủng HPV18 Dựa vào đoạn gen này, chủng HPV18 nghiên cứu thuộc dòng A1, gần gũi với 16 chủng tìm thấy Nhật Bản, Thái Lan Costa Rica Kết tương đồng với nghiên cứu biến thể HPV18 khu vực châu Á toàn giới b Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV39 HPV39 chia thành dòng A B Dòng A chia nhỏ thành A1 A2 (khác 0,48 ± 0,06% trình tự nucleotit); dòng khác biệt với dòng B tương đương nhau, với khác biệt trung bình tương ứng 0,98 ± 0,09% 0,97 ± 0,08% Trong nghiên cứu này, tất mẫu Việt Nam thuộc dịng A2, có trình tự gần gũi với chủng Đài Loan c Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV45 HPV45 chia thành dịng lớn A B, dịng A chia thành dòng từ A1 đến A3 dòng B chia thành dòng B1 B2 Phân bố dòng HPV45 bị ảnh hưởng chủ yếu vị trí địa lý Dưới dịng A1 chủ yếu tìm thấy châu Phi với tỷ lệ 60% gặp vùng địa lý khác Dưới dòng A2 phổ biến châu Á–châu Đại Dương Bắc Mỹ, B1 phổ biến châu Âu Trong dòng A3 gặp tìm thấy châu Phi Nam Mỹ dịng B2 lại ghi nhận toàn vùng địa lý với tỷ lệ 40% Số lượng mẫu HPV45 phân lập Việt Nam hạn chế, phân loại vào nhóm dịng B2 d Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV59 HPV59 chia thành dòng lớn A B, dịng A chia thành dòng A1, A2 A3 Những chủng thuộc dòng A đa dạng dòng B với khác biệt trung bình 0,60%-0,89% HPV59 dịng A B có khác biệt trung bình 1,11%-1,2% 17 Nghiên cứu cho kết tương đồng với nghiên cứu phần lớn chủng phân lập từ Việt Nam (7/8 chủng – 87,5 %) thuộc dòng C2, giống với Đài Loan; chủng lại (1/8 chủng – 12,5%) thuộc dòng E, giống với Trung Quốc 4.1.2.2 Đặc điểm phân tử dạng di truyền týp HPV thuộc alpha a Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV16 Phân tích cho thấy diện dòng định mặt tiến hóa cấp độ phân loại sâu so với nhóm biến thể thường cơng nhận (tức E, Af-1, Af -2 AA; đổi tên A, B, C D) Đáng ý việc phân biệt rõ ràng so sánh trình tự nucleotit L1 dòng dòng Quan sát cung cấp ví dụ cụ thể việc sử dụng gen HPV hoàn chỉnh để xác định đơn vị phân loại biến thể dịng dịng, trình tự L1 ORF đủ đáng tin cậy để phân biệt týp HPV b Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV31 Các chủng HPV31 phân loại thành dòng: A, B C, với prototype quy ước dòng A Mẫu phân lập Việt Nam dựa vùng gen E6-E7 L1 cho kết thuộc dịng A, gần với trình tự phân lập Thái Lan Costa Rica Một số nghiên cứu Trung Quốc, Serbia cho thấy dòng A C hai dòng phổ biến nhất, dòng B gặp Tất trình tự phân lập Việt Nam thuộc dịng A, dòng A1 Đây dòng phổ biến xuất tất vùng địa lý dân tộc giới 18 c Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV35 Các chủng HPV35 bảo thủ, có 0,6% khác biệt trình tự nucleotit chủng, đa dạng trình tự nucleotit chủng 1,8% (140/7908) với 46/2306 (2%) trình tự axit amin Các chủng HPV35 chia thành nhánh chính, với khác biệt 0,5% 0,06% khác biệt nhánh, nhiên khác biệt không đảm bảo để phân loại thành dòng khác nhau, chia thành dòng A1 A2, cho thấy HPV35 vừa tiến hoá từ chủng gốc HPV31, HPV35 HPV16 d Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV52 Về đa dạng di truyền phân tử, vùng gen E6-E7 mẫu phân lập Việt Nam có xuất thay nucleotit A379G (K39R), biến đổi biết đến có liên quan tới tổn thương tế bào mức độ cao Ngoài ra, biến đổi 623T (T20I), 760A (G63S) có liên quan tới tân sinh cổ tử cung (cervical neoplasia) Trong đó, vùng gen L1 bảo tồn, có biến đổi có thay axit amin vị trí T5578C (L5S) trình tự thuộc dịng C2 e Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV31 HPV58 chia thành dòng A, B, C, D dịng A1/A2/A3, B1/B2, D1/D2 Tất trình tự phân lập Việt Nam thuộc dòng A, xuất dịng A1, A2 A3 4.1.2.3 Đặc đểm phân tử đa dạng di truyền chủng HPV thuộc alpha khác a Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV51 HPV51 chia thành dòng lớn, A B, 19 dòng A1-A4 B1-B2 Khác biệt dòng dòng tương ứng 0,52-0,74% 0,92-1,24%, khác biệt dòng 0,2–0,03% Các chủng HPV51 từ nước châu Á thuộc dịng A, chủng từ châu Phi phần lớn thuộc dòng B Ở Costa Rica, dòng A B phát Dưới dòng B2 tìm thấy nước châu Phi Các thay C395T (S100L) vùng gen E6 C756T (S66L) vùng gen E7 thay phổ biến trình tự tương ứng HPV51 b Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV56 Dựa vào trình tự gen L1, tồn mẫu HPV56 phân lập thuộc dòng B Tuy nhiên, sử dụng vùng gen E6-E7 để phân loại, có 2/5 trình tự phân loại vào dòng A, dòng A2 3/5 trình tự cịn lại phân loại thuộc dịng B Các chủng HPV56 có mức độ đa dạng thấp Có dịng A B dịng A1 A2 mơ tả cho HPV56 Các đột biến ghi nhận mẫu phân lập Trung Quốc Do vậy, chủng HPV56 phân lập Việt Nam có nhiều tương đồng với trình tự phân lập Trung Quốc c Đặc điểm phân tử dạng di truyền HPV66 Tỷ lệ biến đổi trình tự nucleotit HPV66 2,8% (218/7827 nucleotit), tỷ lệ biến đổi trình tự axit amin 3,3% (88/2519) tồn ORF Các chủng HPV66 chia thành dòng A B dòng B1 B2 Khoảng cách dòng dòng tương ứng 1,55-0,13% 0,530,06% Các mẫu HPV66 từ Costa Rica thuộc lineage A B Tất mẫu phân lập Việt Nam thuộc dòng B, chia thành dịng B1 B2 dựa vùng trình tự E6-E7 20 4.2 Phát triển mẫu chuẩn nhằm đánh giá sinh phẩm chẩn đoán Realtime-PCR cho 14 týp HPV nguy cao Xây dựng mẫu chuẩn thước đo quan trọng nhằm đánh giá chất lượng xét nghiệm/sinh phẩm chẩn đoán sử dụng xét nghiệm sàng lọc, chẩn đoán bệnh xét nghiệm HPV kỹ thuật sinh học phân tử Có nhiều tiêu chí khác để đánh giá chất lượng sinh phẩm xét nghiệm, đặc biệt độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác Carina Eklund cộng xây dựng đánh giá đặc tính panel mẫu chuẩn HPV Các gen hoàn chỉnh HPV nhân plasmid phịng thí nghiệm cung cấp cho nghiên cứu gồm HPV týp 6, 11, 16, 18, 45 33, 39, 66, 68, 51, 31, 35, 56, 52, 58 59 Trình tự axit nucleic cho gen HPV xác lập có sẵn ngân hàng gen Trong đó, HPV11 HPV58 ban đầu nhân gen L1 nhân vectơ (pGEM4z) xác định gen L2 (vị trí 4781) E1 (vị trí 1158) Tuy nhiên mẫu panel chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn plasmid công nghệ tái tổ hợp toàn phần hệ gen vi rút HPV mà chưa có mẫu lâm sàng thiết lập kèm theo Ngoài mẫu chuẩn tạo từ plasmid tái tổ hợp mẫu panel chuẩn từ nghiên cứu công bố, nghiên cứu chúng tơi cịn xây dựng mẫu chuẩn lâm sàng từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ người Việt Nam thành phố Hà Nội Hồ Chí Minh theo khuyến cáo WHO Bên cạnh đó, nghiên cứu thiết lập thêm mẫu lâm sàng giả định từ plasmid pha mẫu bệnh phẩm lâm sàng để xác định độ xác (độ lặp lại, độ tái lặp) sử dụng để đánh giá sinh phẩm 21 Bộ mẫu panel chuẩn xây dựng để đánh giá độ nhạy phân tích (giới hạn phát hiện) bao gồm 20 mẫu chuẩn cho 14 týp HPV plasmid bao gồm HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 68 Các mẫu chuẩn xây dựng nguyên tắc đoạn gen đặc trưng E6-E7 L1 cho 14 týp HPV nguy cao nhân chèn vào vectơ pGEM-T easy (Promega, Mỹ) tạo plasmid tái tổ hợp Các plasmid sau biến nạp vào tế bào khả biến E coli TOP10 Các mẫu sau xây dựng xác định nồng độ gốc phương pháp digital PCR dòng máy QX200 Biorad (máy tạo vi giọt Manual DG QX200, máy tạo vi giọt QX-200 (Biorad-Hồng Kông) Từ mẫu chuẩn gốc thực pha mẫu chuẩn làm việc có nồng độ làm việc khoảng 10 để bảo quản thời gian dài Khi thực đánh giá số giới hạn phát (LOD) mẫu chuẩn làm việc pha loãng độ pha: 1, 5, 10, 50, 100 1000 sao/µl để tạo mẫu chuẩn cho xác định độ nhạy phân tích Bộ mẫu chuẩn sử dụng cho đánh giá độ xác xây dựng chứa đặc tính mẫu bao gồm mẫu âm tính, mẫu dương tính yếu, mẫu dương tính trung bình mẫu dương tính cao với 14 týp HPV nguy cao bao gồm 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 68 Bộ mẫu thiết lập từ mẫu chuẩn HPV plasmid tái tổ hợp tiến hành trộn mẫu lâm sàng âm tính để tạo 20 mẫu chuẩn lâm sàng giả định cho 14 týp HPV nguy cao Các mẫu chuẩn cho týp pha nồng độ phù hợp cho týp sử dụng thiết kế đánh giá độ xác lần làm thời điểm lần làm vào thời điểm khác 22 Ngoài ra, theo khuyến cáo WHO, để đánh giá chất lượng loại sinh phẩm chẩn đốn quốc gia, phịng thí nghiệm cần có mẫu chuẩn lâm sàng Bộ mẫu chuẩn tốt xây dựng mẫu bệnh phẩm thu thập xác định cộng đồng dân cư nước sở (bao gồm mẫu HPV dương tính với týp HPV âm tính lưu hành nước sở tại) Chính vậy, kết việc thiết lập mẫu lâm sàng nghiên cứu xây dựng panel mẫu chuẩn để xác định độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng, panel gồm 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ 60 mẫu lâm sàng dương tính 103 mẫu bệnh phẩm lâm sàng âm tính với 14 týp HPV nguy cao có 20 mẫu bệnh phẩm với týp nguy thấp 93 mẫu bệnh phẩm lâm sàng âm tính với HPV Bộ mẫu chuẩn xây dựng để đánh giá độ nhạy lâm sàng độ đặc hiệu lâm sàng cho sinh phẩm chẩn đoán HPV phương pháp Realtime-PCR khẳng định đặc tính mẫu đánh giá phịng thí nghiệm NIHE NICVB thực Bên cạnh đó, mẫu chuẩn xác định độ đặc hiệu phân tích tạo sử dụng với 10 mẫu bệnh phẩm âm tính với 14 týp HPV nguy cao dương tính với 21 tác nhân nguy thấp 11 tác nhân vi sinh vật bao gồm tác nhân vi rút tác nhân vi khuẩn Các mẫu chuẩn xây dựng bao gồm panel mẫu chuẩn tạo 20 bộ/panel, có mẫu chuẩn lâm sàng từ mẫu bệnh phẩm người Việt Nam, mẫu chuẩn plasmid mẫu chuẩn lâm sàng giả định Toàn mẫu chuẩn mẫu chuẩn thiết lập khẳng định đặc tính mẫu để sử dụng nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán HPV 23 phương pháp Realtime-PCR Các mẫu chuẩn nghiên cứu đánh giá tính ổn định 12 tháng theo điều kiện bảo quản tiêu chuẩn thời gian thực HPV Genotypes 14 RealTM Quant (Sacace, Ý) Genoflow HPV (Diagcor, Hong Kong) Kết cho thấy, đặc tính chất lượng mẫu chuẩn với mẫu bệnh phẩm lâm sàng ko thay đổi số chất lượng, tỷ lệ đồng lần chạy 100% hệ số biến thiên (CV) lần đo nồng độ mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp CV ≤ 10% điều kiện bảo quản -20°C Tính ổn định mẫu chuẩn tiếp tục đánh giá thời gian KẾT LUẬN Nghiên cứu đưa tỷ lệ nhiễm HPV MSM, PNBD nữ sinh viên Việt Nam, 2017-2018 29,8%, 26,4% 4,2% Sự phân bố 14 týp HPV nguy cao xác định nhóm đối tượng chiếm tỷ lệ cao tương ứng 80,7%, 66,8% 79,4% Tần suất xuất đa nhiễm xuất cao gấp khoảng 2-3 lần so với đơn nhiễm Ngồi HPV16/18 HPV52, HPV66/68 HPV39 týp có tần suất xuất cao nhất, đáng lưu ý HPV39 týp chưa có vắc xin Nghiên cứu đưa đặc điểm phân tử vùng gen L1, E6 E7 134 mẫu dựng phát sinh loài cho 14 týp HPV nguy cao Các chủng Việt Nam thuộc týp chi alpha có quan hệ gần gũi với chủng có nguồn gốc từ Đông Á Nhật Bản, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan Các chủng Việt Nam thuộc týp chi alpha chi alpha khác có kiểu gen đa dạng giống với chủng nhiều nơi giới bao gồm quốc gia thuộc châu Á, Mỹ La Tinh Các biến đổi gen L1, E6 E7 týp HPV nguy cao khơng 24 nhiều góp phần vào đa dạng di truyền quần thể HPV Việt Nam Dòng dòng gen L1 E6E7 cho kết tương đồng xây dựng phát sinh chủng loại Nghiên cứu phát triển mẫu chuẩn từ 14 plasmid tái tổ hợp mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhằm đánh giá độ nhạyđộ đặc hiệu phân tích, độ nhạy-độ đặc hiệu lâm sàng độ xác sinh phẩm chẩn đoán Realtime-PCR cho 14 týp HPV nguy cao Các mẫu chuẩn ứng dụng để để đánh giá tiêu kỹ thuật cho sinh phẩm NIHE-Realtime PCR hrHPV Kit KIẾN NGHỊ Đẩy mạnh công tác tuyên truyền tiêm chủng vắc xin cho nhóm đối tượng kể nhóm đối tượng có nguy nhiễm HPV cao gồm MSM, PNBD Nghiên cứu bổ sung số týp HPV nguy cao phổ biến quần thể người Việt Nam giới vào vắc xin Nghiên cứu phát triển vắc xin phịng HPV sử dụng cơng nghệ VLPs dựa trình tự gen L1 chủng HPV phân lập Việt Nam Có thể dùng trình tự E6-E7 thay cho L1 để phân loại dòng dòng HPV Phát triển thêm mẫu chuẩn plasmid tái tổ hợp chứa toàn hệ gen cho 14 týp HPV HPV nguy thấp ví dụ HPV6, HPV11 Phát triển, cập nhật mẫu chuẩn lâm sàng nhằm tăng cỡ mẫu số lượng chủng/đa dạng chủng Tiếp tục tsheo dõi tính ổn định mẫu chuẩn nghiên cứu thêm trình đơng khơ mẫu chuẩn để tăng cường tính ổn định