công nghệ vi sinh - sản xuất protein tái tổ họep trên e.coli

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG INSULIN INSULIN Công NGhệ vi sinh Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli Nhóm: 1.Trần Thị Huyền Trân 61003158 2.Huỳnh Thị Trúc 61003267 3.Lê Thị Thúy Quyên 61003118 4.Nguyễn Thị Kim Thao 61003132 5.Huỳnh Thị Thanh Trúc 61003268 6.Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080 7.Trần Nguyễn Hương Trang 61003262 I/ Bệnh tiểu đường: II/ Một số loại insulin trên thị trường: Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian bắt đầu tác dụng Thời gian hết tác dụng Tác dụng nhanh - Insulin Actrapid HM - Insulinum maxirapid Trong Người Lợn 30 phút (tiêm dưới da) 8h Tác dụng bán chậm - Insulatard HM - Insulin Lente Đục Người Lợn 1h 20h 18h Loại pha trộn -Mixtar HM 30/70 Đục Người 30 phút 20h Tác dụng rất chậm -Utra – Lente Đục Bò 4h 30h III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin 1. Cấu trúc phân tử insulin: Insulin người là 1 polipeptide Bao gồm: - Chuỗi A 21 aa - Chuỗi B 30aa. Có 1 cầu nối disulfur giữa 2 chuỗi A và 2 cầu nối giữa 2 chuỗi A và B. CTHH: C 257 H 383 N 65 O 77 S 6. Trọng lượng phân tử: 5808 2. Vai trò của insulin: 2. Vai trò của insulin:  Insulin làm tăng tính hấp thụ của các acid amin.  Thúc đẩy sự sinh tổng hợp các acid béo trong gan  Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali, magie và phosphate vô cơ tạo điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa và sử dụng glucose. IV/ Công nghệ sản xuất insulin: Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. [...]... (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giá thành cao + Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp V/ Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên E.coli: 1 Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp mini proinsulin (MPI): Bước 1: bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hóa proinsulin người trên NST số 11 Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp - Cắt gen mã hóa proinsulin... (Reverse-phase HPLC) ` ↓ So sánh peak với mini proinsulin insulin xoắn cuộn với Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin + Bằng phương pháp sắc ký, tách, và phương enzyme pháp miễn dịch gắn 2 Sinh tổng hợp insulin theo phương pháp 2 chuỗi: Nguồn: http://www.bvdkquangnam.vn/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp-.html http:/ /vi. scribd.com/doc/93630047/G5-miniproinsulin... http://www.bvdkquangnam.vn/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp-.html http:/ /vi. scribd.com/doc/93630047/G5-miniproinsulin http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de -sinh- hoc/cong-nghe -sinh- hoc/5296-san-xuat-thuoc-bang-cong-nghe-dna-tai-tohop.html The End! ... phageT4 - Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất - Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành như sau: + Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT – PCR) + Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vào plasmid đứng sau một promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli Chủng E.coli: BL21... 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện Sau quá trình biến nạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên men Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất dinh dưỡng được bổ sung thường xuyên để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm... BL21 (DE3) Gen: T7 RNAP DNA mã hóa 8 – 12 aa TNF-α và His 10 được tổng hợp hóa học Promoter lacUV5 Cắt bằng NdeI và BamHI Plasmid T2 Chèn vào downstream T7 promoter Biểu hiện trong pET-3a Cắt bởi endonuclease Thu pT2 Plasmid pT2hPI Gen mã hóa cho proinsulin người PCR (5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65 – 68 base như mẫu) Cắt bằng BamHI và HindIII Chèn vào pT2 pT2-hPI Plasmid pT2M2PI: Plasmid pT2M2PI: Gen mã... các chất dinh dưỡng được bổ sung thường xuyên để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân Chỉ sau 1 thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp Môi trường: Luria – Bertani - 1% (w/v) peptone 0,5% (w/v) cao nấm men 1% (w/v) NaCl 0,1% (w/v) NaOH (v/v) duy trì 200 mg/l ampicilline Sơ đồ biểu hiện mini... Bước 6: Hoạt hóa Hoạt hóa proinsulin vitro (sau tinh sạch ở dạng mạch thẳng) bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4 (tạo phản ứng xoắn cuộn), sau đó dùng enzyme đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết Phản ứng xoắn cuộn + 50mM glycine buffer  mini proinsulin tinh sạch (50 µM, 0.375 mg/l) + 2-mercaptoethanol  phản ứng cuộn xoắn . lớn tụy để sản xuất) => giá thành cao. + Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp. V/ Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên E. coli: 1. Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VI T NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG INSULIN INSULIN Công NGhệ vi sinh Sản xuất protein tái tổ hợp trên E. coli Nhóm: 1.Trần. TNF-α và His 10 được tổng hợp hóa học. Cắt bằng NdeI và BamHI Chèn vào downstream T7 promoter Biểu hiện trong pET-3a Cắt bởi endonuclease Thu pT2 Chủng E. coli: BL21 (DE3) Gen: T7 RNAP Promoter