Phân lập và tuyển chọn chủng bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt thấp NGUYỄN THỊ THU TRANG Trang.NTT202668M@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Tuân Chữ ký GVHD Bộ môn: Công nghệ Sinh học Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 10/2022 ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên học viên: Nguyễn Thị Thu Trang Khóa: CH2020B Mã học viên: 20202668M Viện: Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ Sinh học Đầu đề đề tài nghiên cứu: Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt thấp Nội dung nghiên cứu: – Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase cao tạo độ nhớt thấp – Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp nattokinase tạo độ nhớt canh trường lên men chủng tuyển chọn – Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men phương pháp đáp ứng bề mặt nhằm cải thiện hoạt lực enzyme giảm độ nhớt canh trường – Lên men theo mẻ thiết bị L Họ tên giảng viên hướng dẫn: TS Lê Tuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày hoàn thành đồ án: Ngày …… tháng …… năm 20… Giảng viên hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) I LỜI CẢM ƠN Trải qua năm học tập nghiên cứu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy Thầy, Cô với nỗ lực cố gắng thân mình, em hồn thành đề tài luận văn Thông qua luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy TS Lê Tuân; Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy hướng dẫn em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, em muốn bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương giúp đỡ để em học hồn thành chương trình Thạc sỹ Đại học Bách Khoa Hà Nội Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm giúp em tích lũy thêm nhiều kiến thức suốt thời gian học tập vừa qua Cuối cùng, em xin cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, động viên sát cánh bên em suốt khoảng thời gian thực đồ án tốt nghiệp Trong q trình hồn thiện đồ án hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm nên khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý Thầy, Cơ để luận văn em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! II TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Nattokinase (NK) enzyme phân hủy fibrin có tiềm lớn ngăn ngừa điều trị bệnh liên quan huyết khối Tuy nhiên, trình thu hồi NK từ dịch lên men lỏng thường bị cản trở độ nhớt canh trường cao Trong bối cảnh đó, luận văn đặt mục tiêu phân lập chủng Bacillus subtilis sinh tổng hợp NK cao tạo độ nhớt thấp Trong nghiên cứu này, phân lập 73 dòng khuẩn lạc sinh protease từ 25 mẫu phâp lập bao gồm tương, đất, nước biển natto thương mại Tiến hành sàng lọc 73 dòng khuẩn lạc theo tiêu chí khả sinh tổng hợp enzyme phân giải fibrin đột nhớt canh trường lên men lỏng lựa chọn chủng TVY.04 có hoạt lực NK cao đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL độ nhớt thấp đạt 3,87 ± 3,5 cP Kết định danh cho thấy chủng TVY.04 thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens Kết khảo sát điều kiện lên men nhận thấy nhiệt độ lên men 37°C, tốc độ lắc 150 rpm tỉ lệ cấp giống OD 600 nm = 0,2 cho hoạt lực NK cao đồng thời tạo độ nhớt thấp Thành phần môi trường dinh dưỡng khảo sát tối ưu theo mơ hình Minimal run Box-Behnken với tiêu chí hoạt lực enzyme cao độ nhớt thấp Kết thành phần môi trường tối ưu bao gồm: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, g/L CaCl 2, 10 g/L cao nấm men, g/L NaCl, g/L K2HPO4 Lên men chủng TVY.04 mơi trường tối ưu, quy mơ bình tam giác giúp hoạt lực NK tăng lần, đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL nhiên độ nhớt chưa cải thiện so với môi trường ban đầu Lên men theo mẻ chủng Bacillus amyloliquefaciens môi trường tối ưu thiết bị bioreator quy mô L thu hoạt lực NK đạt 460 ± 12 FU/mL, độ nhớt canh trường đạt 4,41 ± cP; tăng 50% xấp xỉ 10% so với hoạt lực NK độ nhớt (4,08 ± cP) lên men bình tam giác Học viên thực III MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .VII DANH MỤC HÌNH VIII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT X CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xu hướng nghiên cứu nước 1.2 Enzyme Nattokinase 1.2.1 Lịch sử .5 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm nattokinase 1.3 Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.4 Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase 1.4.1 Thực phẩm lên men 1.4.2 Nguồn phân lập khác .8 1.4.3 Tương Việt Nam 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp NK lên men lỏng 10 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 12 1.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 13 1.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại 13 1.6 Poly – γ – glutamic acid (γ-PGA) 14 1.6.1 Cấu trúc γ-PGA 14 1.6.2 Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 16 1.6.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 18 1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình tổng hợp γ-PGA lên men lỏng 20 1.6.5 Ảnh hưởng độ nhớt tới trình thu hồi enzyme 21 1.7 Kết luận 22 CHƯƠNG - VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 23 2.1.2 Chủng đối chứng 23 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 23 2.1.4 Các môi trường dinh dưỡng 23 2.1.5 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp phân tích 24 IV 2.2.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase .24 2.2.2 Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào vi sinh vật 25 2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng hoạt lực enzyme phân giải fibrin 25 2.2.4 Phương pháp xác định độ nhớt canh trường lên men 26 2.2.5 Phương pháp phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) 26 2.2.6 Phương pháp xác định nồng độ đường khử 26 2.2.7 Phương pháp điện di SDS – PAGE 27 2.2.8 Định danh chủng phương pháp 16S rRNA 27 2.2.9 Xác định mật độ tế bào thông qua giá trị OD 600nm 28 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 28 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Hoạt hóa tăng sinh chủng 29 2.4.2 Sàng lọc thứ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme NK phương pháp lên men lỏng 29 2.4.3 Sàng lọc thứ cấp chủng tạo độ nhớt thấp 30 2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men tới khả sinh tổng hợp NK độ nhớt chủng TVY.04 30 2.4.5 Sàng lọc yếu tố môi trường ảnh hường tới hoạt lực độ nhớt chủng sản xuất 31 2.4.6 Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men phương pháp đáp ứng bề mặt 31 2.4.7 Kiểm chứng thí nghiệm thiết bị bioreactor quy mô L 32 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh nattokinase 33 3.1.1 Sàng lọc sơ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme protease 33 3.1.2 Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí hoạt lực NK cao 37 3.1.3 Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí độ nhớt thấp 38 3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng TVY.04 38 3.1.5 Định danh chủng phương pháp 16S rRNA 39 3.1.6 Phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) 41 3.1.7 Phân tích protein ngoại bào 41 V 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men tới khả sinh tổng hợp NK độ nhớt chủng TVY.04 42 3.2.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc 42 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men 43 3.2.3 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống theo giá trị OD 600nm 44 3.3 Tối ưu hóa yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt lực NK độ nhớt chủng TVY.04 phương pháp đáp ứng bề mặt 45 3.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường Minimum-Run screening 45 3.3.2 Tối ưu hóa hàm lượng yếu tố lựa chọn RSM 48 3.3.3 So sánh chủng B amyloliquefaciens TVY.04 với chủng đối chứng 54 3.4 Kiểm chứng thí nghiệm Bioreactor quy mơ L 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 VI DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số nghiên cứu nattokinase Việt Nam Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ chủng vi khuẩn khác Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên men Bảng 1.4: Nồng độ thành phần môi trường lên men 12 Bảng 1.5: Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt lực NK lên men 14 Bảng 1.6: Khối lượng phân tử γ-PGA từ số chủng vi khuẩn khác [73, 74] 15 Bảng 1.7: Tóm tắt đặc tính số vi khuẩn Bacillus sản xuất γ-PGA [68] 17 Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng môi trường 23 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số chủng phân lập 34 Bảng 3.2: Kết thí nghiệm dựa thiết kế Minimum-Run resolution IV screening 45 Bảng 3.3: Phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố lựa chọn tới hoạt lực enzyme 46 Bảng 3.4: Phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố lựa chọn tới độ nhớt47 Bảng 3.5: Bảng kết thí nghiệm thực nghiệm tối ưu sử dụng Box – Behnken design 48 Bảng 3.6: Kết phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực enzyme 49 Bảng 3.7: Kết phân tích ANOVA ảnh hưởng yếu tố đến độ nhớt 51 VII DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Thông kê số lượng nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase” sở liệu Science Direct khoảng thời gian từ 1988 – 2022 Hình 1.2: Infographic phân bố nghiên cứu nattokinase theo quốc gia Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK theo quốc gia tổng số 42 báo khoa học Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10] Hình 1.5: Cấu trúc khơng gian nattokinase [15] Hình 1.6: Sự phân bố nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39] .9 Hình 1.7: Tương lên men truyền thống Việt Nam 10 Hình 1.8: Thành phần mơi trường lên men sinh tổng hợp NK 11 Hình 1.9: Cấu trúc γ-PGA [69] 15 Hình 1.10: a) Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA; b) Các gen sinh tổng hợp γ-PGA Bacillus spp [75] 18 Hình 3.1: Khuẩn lạc thu sau 24h phân lập môi trường LBS agar với mẫu khác 33 Hình 3.2: Hoạt lực enzyme phân giải fibrin 40 chủng phân lập 37 Hình 3.3: Độ nhớt canh trường sau lên men từ chủng 38 Hình 3.4: Ảnh khuẩn lạc đĩa LBS agar (A) nhuộm Gram (B) 39 Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA chủng TVY.04 39 Hình 3.6: Kết so sánh trình tự chủng TVY.04 ngân hàng Genbank 40 Hình 3.7: Sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân EPS 41 Hình 3.8: Điện di đồ enzyme thơ (giếng 1: marker protein; giếng 2: enzyme thơ) 41 Hình 3.9: Ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả sinh tổng hợp enzyme độ nhớt chủng TVY.04 42 Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt chủng TVY.04 43 Hình 3.11: Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống tới khả sinh tổng hợp enzyme NK độ nhớt chủng TVY.04 44 Hình 3.12: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng thông số đầu vào tới khả sinh tổng hợp NK chủng B amyloliquefaciens TVY.04 50 Hình 3.13: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng thơng số đầu vào tới q trình sản xuất độ nhớt chủng B amyloliquefaciens TVY.04 52 Hình 3.14: Kết lên men kiểm chứng lại dự đốn mơ hình 53 VIII Hình 3.15: Kết so sánh hoạt lực NK độ nhớt chủng B amyloliquefacines TVY.04 chủng đối chứng B subtilis D 54 Hình 3.16: Các thông số vận hành lên men thiết bị L chứa L mơi trường tối ưu 55 Hình 3.17: Kết lên men theo mẻ chủng B amyloliquefaciens TVY.04 quy mô thiết bị L với L môi trường 56 IX