Rutin là một dược chất có giá trị được sử dụng rộng rãi trong y học. Ngoài khả năng phục hồi sự vỡ mao mạch tới 88%, rutin còn là một chất chống oxy hóa hiệu quả được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh như bệnh tế bào hình liềm, viêm khớp, xơ gan, u hắc tố
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG BÁO CÁO TIỂU LUẬN HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Bình Dương, tháng 3/2023 ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT VIỆN PHÁT TRIỂN ỨNG DỤNG BÁO CÁO TIỂU LUẬN TÌM HIỂU VỀ RUTIN - MỘT FLAVONOID CĨ TRONG CÂY HOA HOÈ Ngành: Cử nhân hóa học Bình Dương, tháng 3/2023 ii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH i DANH MỤC BẢNG ii KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT iii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ FLAVONOD 1.1 Khái niệm .1 1.2 Cấu trúc hóa học .1 1.3 Phân loại 1.4 Tính chất CHƯƠNG 2: NỤ HÒE, RUTIN TRONG KHOA HỌC VÀ ĐỜI SỐNG 2.1 Cây hòe Việt Nam giới 2.1.1 Thành phần ứng dụng hòe đời sống người 2.1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng nụ hòe .5 2.2 Rutin nghiên cứu đánh giá 2.2.1 Giới thiệu chung rutin 2.2.2 Tầm quan trọng rutin y dược cổ truyền đại 2.2.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất rutin 11 CHƯƠNG TRÍCH LY, TINH CHẾ VÀ THỰC TRẠNG SẢN XUẤT RUTIN 13 3.1 Cơ chế q trình trích ly tinh chế rutin .13 3.1.1 Trích ly rutin khỏi nguyên liệu 13 3.1.2 Tách rutin khỏi pha trích 15 3.2 Tổng kết trình trích ly, tinh chế rutin 16 3.2.1 Sơ lược kết nghiên cứu 16 3.2.2 Các phương pháp trích ly rutin .18 3.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất tiêu thụ rutin Việt Nam .20 3.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất rutin 20 3.3.2 Tình hình tinh chế tiêu thụ rutin .21 3.4 Nhận định chung thực trạng sản xuất rutin Việt Nam 22 3.5 Các phương pháp định tính, định lượng rutin .24 3.5.1 Đinh tính rutin 24 3.5.2 Định lượng rutin 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 27 4.1 Kết luận 27 4.2 Kiến nghị………………………………………………………………………27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc chung flavonoid Hình 2.2 Cây Sophora japonica Hình 3.1 Phân bố nồng độ phacủa trình chuyển khối rắn- lỏng 13 Hình 3.2 Sự thay đổi tốc độ kết tinh (m) theo thời gian (t) 1- bão hòa mạnh; 2-khi bão hòa 14 Hình 3.3 a Độ hồ tan tương đối rutin nước 19 Hình 3.3 b Độ hồ tan tương đối củarutin dung dịch etanol 19 i DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tiêu chuẩn dược điển rutin Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam 23 ii KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng cao áp pre- HPLC Sắc ký lỏng điều chế GC-MS Sắc ký khí - khối phổ SK Sắc ký SKC Sắc ký cột KLK Khối lượng khô KLT Khối lượng tươi DM Dung môi CK Chân không SPME Vi chiết pha rắn PTN Phịng thí nghiệm MKL Mất khối lượng PP Phương pháp TL Trọng lượng KT Kết tinh TCDĐ Tiêu chuẩn dược điển TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam HIV Virut suy giảm miễn dịch người, gây bệnh AIDS ADP Ađenôzin điphosphat ddA, ddA1, ddA2, ddB1, ddG, ddG1 Các dung dịch A, B, G (chỉ số 1,2 cấp độ pha lỗng) Speak Diện tích peak rutin thu từ phân tích HPLC SSmax Sai số lớn THF Tetra hydrofuran iii ĐẶT VẤN ĐỀ Rutin dược chất có giá trị sử dụng rộng rãi y học Ngoài khả phục hồi vỡ mao mạch tới 88%, rutin chất chống oxy hóa hiệu sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh bệnh tế bào hình liềm, viêm khớp, xơ gan, u hắc tố, Do có nhiều ứng dụng nên rutin quan tâm nghiên cứu sản xuất mà cịn nghiên cứu chuyển hóa thành nhiều dược phẩm giá trị khác polyrutin, troxerutin, quercetin, melin sulfat, phức rutin-kim loại, Từ năm 1947 đến 1950, rutin sản xuất quy mô công nghiệp nhiều quốc gia Nhật, Mỹ, Úc, từ nguồn thực vật nụ hịe, kiều mạch, bạch đàn Australia, chè xanh, [17] Sở hữu hàm lượng rutin (34 - 44%) [6], nụ hòe Việt Nam nguồn nguyên liệu giá trị giới Trong đó, có hàm lương rutin cao nước ta, hòe trồng từ lâu đời, trống nhiều nơi đặc biệt cho hàm lượng rutin cao so với hỏe nước khác Do đó, hịe trở thành nguồn dược liệu phong phủ cho ngành công nghiệp chiết xuất rutin Vì chúng tơi lựa chọn để tài “ TÌM HIỂU VỀ RUTIN - MỘT FLAVONOID CĨ TRONG CÂY HOA HỊE” TÌM HIỂU VỀ RUTIN - MỘT FLAVONOID CÓ TRONG CÂY HOA HOÈ CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ FLAVONOD 1.1 Khái niệm Flavonoid nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác khung gồm vịng benzen A B nối với qua mạch carbon Flavonoid nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp dược liệu nguồn gốc thực vật Flavonoid thường tìm thấy khơng bào số tìm thấy nhiễm sắc thể diệp lục hạt 1.2 Cấu trúc hóa học Trong tự nhiên, hợp chất flavonoid sản phẩm chiết xuất từ thực vật tìm thấy nhiều phận Các flavonoid có cấu tạo gồm vòng benzen A B nối với qua mạch carbon (Hình 1.1) Hình 1.1 Cấu trúc chung flavonoid 1.3 Phân loại Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng dựa vào vị trí gốc aryl (vịng B) mức độ oxy hoá mạch 3C Euflavonoid Isoflavonoid Neoflavonoid Các flavonoid có gốc Các flavonoid có gốc Các flavonoid có gốc aryl vị trí C-2 aryl vị trí C-3 aryl vị trí C-4 Một số tên nhóm Favonoid như: Anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron… Người ta phân biệt biflavonoid flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo monomer flavonoid, flavolignan flavonoid mà phân tử có phần cấu trúc lignan Phần lớn flavonoid xem dẫn chất có gốc phenyl nhân Ðánh số thứ tự dị vòng, số từ dị tố oxy tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ Trường hợp khơng có vịng C (nghĩa mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon đánh số vòng B, vòng A đánh số phụ 1.4 Tính chất Các dẫn chất flavon có màu vàng nhạt có khơng màu (trường hợp nhóm OH methyl hố), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, flavan-3-ol khơng có nối đơi liên hiệp vịng B với nhóm carbonyl nên khơng màu Các dẫn chất anthocyanidin màu thay đổi tuỳ theo pH môi trường Tuy nhiên flavonoid phận cịn phụ thuộc vào hỗn hợp với sắc tố khác Ðộ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid flavonoid sulfat hợp chất phân cực nên khơng tan tan dung mơi hữu cơ, tan nước tốt cồn nước Các aglycon flavonoid tan dung mơi hữu cơ, khơng tan nước Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan dung dịch kiềm loãng CHƯƠNG 2: NỤ HÒE, RUTIN TRONG KHOA HỌC VÀ ĐỜI SỐNG 2.1 Cây hòe Việt Nam giới Cây hòe thuộc thực vật họ đậu Fabaceae (Papilionceae) Hịe có nguồn gốc từ Trung Quốc, Triều Tiên phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Đông Á, Đông Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam); Trung Á (Capcadơ, bán đảo Crưm) số nước châu Âu (Anh, Hungary,…) Ở Việt Nam, chi Sophora L có ba lồi chủ yếu là: hịe lơng (Sophora tomentosa L (Silverbrush)) có hoa màu vàng xám, phân bố rộng rãi vùng ven bờ biển (trên bãi cát đảo từ Quảng Ninh đến tận Côn Đảo - Vũng Tàu Phú Quốc – Kiên Giang Hình 2.1 Cây Sophora japonica Hịe Bắc Việt Nam (Sophora tonkinensis Gagnep.) có thân mang lông mềm, tràng hoa màu vàng, thường mọc núi đá vơi sườn đồi phía Bắc (phân bố từ Quảng Ninh, Ninh Bình tới Quảng Nam, Đà Nẵng) [8, 17] lồi có giá trị kinh tế hịe (Sophora japonica L.) có nụ hoa màu trắng hay vàng xanh nhạt, thuộc loại lưỡng tính phân bố Bắc, Trung Bộ Tây Nguyên (hình 1.2) [2, 7] Hịe thực vật rễ cọc có khả thích nghi mạnh, ưa đất sâu mát, thành phần giới trung bình, chua, nước; mọc tốt đất phù sa, đất bazan, đất bồi tụ chân đồi, đất pha cát, đất thịt (trừ đất cát ven biển miền Trung đất chua mặn); thích hợp khí hậu nhiều vùng từ Nam Tây Nguyên tới vùng núi phía Bắc [3, 4, 5] Ở nước ta hòe mọc hoang hay trồng (trong vườn, bờ ruộng cao, bờ mương máng, bờ sông) để làm thuốc, làm cảnh từ lâu đời tỉnh phía Bắc Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng n, Hải Phịng, Ninh Bình, Hà Nam, trộn ảnh hưởng khác đến trình khuếch tán nguyên liệu + Sóng viba (bước sóng khoảng 30cm (tần số 1GHz) - 1cm (tần số 30GHz)): Sóng viba ứng dụng lị vi sóng với dao động trường điện từ tần số 2450 MHz Tần số làm nóng hiệu nước lỏng (nấu chín thức ăn từ bên trong) không hiệu với chất béo, đường nước đá Có thể dùng lị vi sóng làm thiết bị trích ly với dung mơi phù hợp nước + Sóng siêu âm (tần số 16kHz -10MHz): có khả tạo tác động hóa lý thơng qua tượng sủi bong bóng Sử dụng sóng siêu âm trích ly khơng rút ngắn thời gian mà cịn làm tăng hiệu suất trích ly 3.1.2 Tách rutin khỏi pha trích Phương pháp tách rutin khỏi pha trích chủ yếu dựa tượng kết tinh,kết tủa rutin, đưa rutin từ dạng hòa tan trạng thái rắn thực tách pha Dựa vào đặc tính rutin dung mơi trích ly tiến hành theo cách sau: + Với dung mơi trích ly nước nhiệt độ cao (≥ 1000C): Pha trích làm lạnhvà rutin kết tủa nằm đáy thiết bị chứa nên cần lọc thu rutin thơ + Với dung mơi trích ly etanol lạnh: Có thể nâng nhiệt độ pha trích (vì rutin tan tốttrong etanol lạnh tan etanol nóng) Tuy nhiên phương pháp thường dùng để tách rutin hòa tan dung mơi nhóm rượu (metanol, etanol, ) cho bay dung môi (cất dung môi) Trong q trình cất dung mơi,khi dung mơi bay phần dung dịch dễ đạt trạng thái bão hòa nên tượngkết tinh rutin xảy Với dung mơi trích ly kiềm (natrihydroxyt, nước vơi, ): Do rutin tan môi trường kiềm kết tủa mơi trường axit nên thay đổi pH pha trích làm rutin kết tủa pha trích Axit hóa tan từ bề mặt hạt đến lớp xa (chủ yếu khuếch tán phân tử), khuếch tán đối lưu chuyển rutin theo dòng chuyển động dịch chiết (điều kiện thủy động yếu tố quan trọng nhất) 15 Hình 3.2 Sự thay đổi tốc độ kết tinh (m) theo thời gian (t) 1- bão hòa mạnh; 2-khi bão hòa [4] 3.2 Tổng kết q trình trích ly, tinh chế rutin 3.2.1 Sơ lược kết nghiên cứu Do phát khả phục hồi thành mạch đặc biệt rutin, nghiên cứu trích ly rutin (từ kiều mạch) trở thành sốt giới khoa học Châu Âu mà kết hồng loạt Patent sáng chế cơng nghệ trích ly rutin, lọc rutin tinh chế rutin từ kiều mạch đời, tập trung nhiều vào năm 1946-1953 Trong nghiên cứu này, cải tiến công nghệ thường tập trung vào loại nhựa, chất béo khỏi dịch chiết từ giai đoạn trích ly * Về trích ly rutin: Các dung môi sử dụng chủ yếu nước sôi, etanol, propanol, axeton, metyl etyl xeton, hay hỗn hợp dung mơi Thí dụ trích ly rutin từ hạt kiều mạch nảy mầm dùng etanol (30-80%), axit acetic (3-15%) (hoặc hỗn hợp chúng) với tỷ lệ lỏng/rắn = 5/10, 50-80oC 1-3h; từ kiều mạch dùng nước sôi; từ lá, thân mạch ba góc dùng etanol 70% 80 oC [6] Rutin pha trích tách cách cất dung mơi kết tủa rutin Etanol 95% thêm vào cất chân không để protein chất keo đơng tụ, lọc bỏ phần đơng tụ, hóa dịch lọc để loại cồn sau Sản phẩm thơ hịa tan kết tinh lại cồn, ethyl benzol, Silicagel dùng chất trợ lọc để loại nhựa chất béo hay hấp phụ sắc tố màu đỏ fagopyrin (fagopyrin có rutin thơ trích ly từ mạch ba góc) [6] Tạp chất trước trích ly loại clorofoc, axit clohydric loãng, axit sulfuric loãng dùng FeCl3 5% để xác định dấu hiệu chiết kiệt rutin [19] Quá trình trích ly rutin cải tiến cách thêm vào pha trích phân đoạn hydrocacbon (phân đoạn khống spirit có nhiệt độ sơi 160-190oC, dung mơi thơm, phân đoạn naphta) dễ bay có nhiệt độ sơi cao dung mơi trích để loại nhựa thực vật, clorophyl Cất pha trích điểm sơi dung môi để thu hồi dung môi; 16 làm lạnh phần cặn để thu rutin tinh với hiệu suất đạt tới 90-95% Cải tiến loại bỏ nguy hiểm vùng nhiệt trình cất dung môi nhờ hydrocacbon làm chất lỏng đệm kết hợp thực tách, làm tạp chất dầu rutin * Về tinh chế rutin: Quá trình tinh chế rutin nhiều nhà khoa học quan tâm Từ năm 1947-1955 có 10 patent (chủ yếu châu Âu) công bố quyền phương pháp tinh chế rutin Với đặc thù nguyên liệu kiều mạch nên cơng trình tập trung vào tinh chế rutin thơ trích ly từ kiều mạch Ở Việt Nam, hầu hết nghiên cứu tập trung vào vấn đề chiết xuất rutin từ nụ hòe, phần tinh chế rutin đề cập đến Phương pháp hòa tan kết tinh lại nước số dung môi etanol, metanol, diclometan, nước sôi, clorofoc, axeton thường sử dụng, thí dụ hịa tan rutin metanol sôi kết tủa dung dịch kiềm, [13] Theo tài liệu [23] kết tinh lại rutin etanol 80% đạt hiệu suất tinh chế tới 76,63% Tùy thuộc vào nguyên liệu dung môi trích ly mà rutin thơ có tạp chất khác nhau, q trình tinh chế khác + Ảnh hưởng nguyên liệu: Chất lượng nguyên liệu ảnh hưởng đến thành phần dịch chiết mà ảnh hưởng đến hàm lượng rutin Do khác thành phần hóa học nguyên liệu nên từ nguyên liệu khác nhau, rutin thơ có thành phần tạp khác lượng lẫn chất Để đưa phương pháp tinh chế rutin phù hợp, phải dựa vào đặc điểm tạp chất sản phẩm Thí dụ kiều mạch, ngồi rutin cịn có 12-15% protein, amino axit, chất béo, khoáng (sắt, photpho, đồng, kẽm), vitamin B1, B2, rutin thơ trích ly từ kiều mạch mang tạp chất Trong số tạp chất sắt, phức sắt phức đồng chất khó tách nhất, khơng thể loại trình vật lý, chiết, dùng chất hấp phụ hay kết tinh Để xử lý chúng phải hòa tan rutin nước sơi làm lạnh đến 70oC, axit hóa dung dịch tới pH = 2,6 trì 70oC sau làm lạnh, lọc thu rutin tinh Đối với rutin chiết từ nụ hịe, thành phần hóa học nụ hịe phức tạp bao gồm flavonoit, chất béo, clorophyl, axit béo, diệp lục, kim loại nặng, … nên tạp chất rutin thô đa dạng Đặc biệt flavonoit quercetin, isoquercetin, kaemperol 3- rutinosit, chất có lợi dược phẩm chúng 17 lại tạp chất khó tách khỏi rutin thơ tương đồng cấu trúc, tính chất hóa lý với rutin + Ảnh hưởng dung mơi trích ly rutin: Do khả hịa tan chọn lọc dung mơi trích ly khác mà rutin thô mang tạp chất khác Từ nguyên liệu nụ hịe, rutin thơ chiết nước lẫn nhiều chất pectin, pectat bị xạm, keo dính hàm lượng thấp, sản phẩm có màu xanh lục Nếu dùng dung mơi trích ly kiềm, rutin thơ lẫn nhiều tạp chất mang tính bazơ, sản phẩm có màu vàng sậm Nếu dùng dung mơi trích ly dung mơi hữu cơ, rutin thơ lẫn nhiều clorophyl, sắc tố, chất béo Như vậy, để khắc phục clorophyl rutin thơ, dùng tetracloruacacbon; để loại diệp lục chất béo hoà tan chiết cồn, rutin thường tinh chế ete kết tinh lại nước [7] 3.2.2 Các phương pháp trích ly rutin Rutin hoạt chất có khung flavol, phân tử lượng lớn nên q trình trích ly thường sử dụng dung mơi thích hợp để hịa tan, tách rutin khỏi nguyên liệu Khả tan rutin dung môi vấn đề then chốt q trình trích ly rutin tách rutin khỏi pha trích Mức tan rutin dung mơi nước etanol theo nhiệt độ tìm thấy (hình 3.3 a hình 3.3 b) Ba loại dung mơi chiết đề xuất lựa chọn để trích ly rutin nước, kiềm rượu Dựa vào dung mơi, q trình trích rutin từ nụ Hịe phân làm ba phương pháp sau: Phương pháp nước: Dựa vào độ tan khác rutin nước theo nhiệt độ (hình 3.3 a): tan nhiều nước ≥ 100oC tan nước lạnh nên nước dùng làm dung mơi trích ly tinh chế rutin + Ưu điểm: Dung môi nước nên khơng độc, rẻ tiền, an tồn, khơng gây cháy nổ;sản phẩm không bị lẫn diệp lục, tỷ lệ clorophyl tan lẫn (< 0,004 %) [13] + Nhược điểm: Địi hỏi lượng nước sơi lớn, đun nấu thiết bị cồng kềnh; hiệu suất trích ly thấp; rutin lẫn nhiều chất khác pectin, pectat [13] bị xạm, keo dính, màu xanh lục đạt chất lượng thô 18 nhiệt độ sôi nhiệt độ thường Nhiệt độ (oC) Etanol %(v/v) Hình 3.3 a Độ hồ tan tương đối Hình 3.3 b Độ hoà tan tương đối rutin nước [17] rutin dung dịch etanol [17] Phương pháp kiềm: rutin glucozit có nhóm – OH tự phenolic (đặc biệt nhóm OH vị trí 7) nên dễ tan mơi trường kiềm Các loại dung dịch kiềm sử dụng để trích ly rutin natrihydroxit, amoniac, natri cacbonat, nước vơi, Pha trích axit hố axit để rutin thơ kết tủa tách bằngdung môi hữu môi trường axit [7] + Ưu điểm: Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền; tiết kiệm nhiên liệu, lượng; trang thiếtbị đơn giản + Nhược điểm: Với dung dịch kiềm rutin bị ảnh hưởng điều kiện dung dịch kiềm đặc có nhiệt độ cao cấu trúc rutin dễ bị phá vỡ Quá trình axit hoá cho rutin kết tủa phải khống chế độ pH thích hợp để tránh phân huỷ rutin thành quercetin rutin chưa kết tủa hết pha trích Phương pháp áp dụng Rumani, Hungari Bộ môn Công nghiệp Dược - ĐH Dược Hà Nội sử dụng phương pháp nghiên cứu trích ly rutin quy mô PTN [6] Phương pháp dùng dung môi hữu khác: dung dịch axit axetic 1% nước trích ly rutin với hiệu suất 25,4% Hầu hết dung mơi hữu có khả hồ tan rutin axeton, etyl axeton, pyridin,… đặc biệt nhóm rượu etanol, metanol, iso-propanol sử dụng để trích ly rutin Rutin tan metanol etanol theo nhiệt độ (hình 3.2 b) nên hai dung mơi sử dụng làm dung mơi trích ly [6] + Ưu điểm: Dung mơi có tính chọn lọc nên hàm lượng rutin sản phẩm hiệu 19 suất trích ly cao + Nhược điểm: Dung môi đắt tiền độc hại; dùng metanol, etanol, propanol tốn thêm công đoạn cất dung môi Sản phẩm thô lẫn nhiều clorophyl, sắc tố chất béo [13] Ở Đức, Mỹ, Việt Nam thường sử dụng etanol để trích ly rutin 3.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất tiêu thụ rutin Việt Nam 3.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất rutin Do nụ hịe có từ lâu đời sẵn có Việt Nam, hầu hết nghiên cứu trích lyrutin tiến hành sở nụ hoè, nghiên cứu từ nguyên liệu khác mang tính chất cơng bố phát Năm 1962, xí nghiệp dược phẩm TW đưa quy trình trích ly rutin vào sản xuất công nghiệp rutin sử dụng nước làm thuốc chữa bệnh làm phẩm màu cao viên Trong giai đoạn 1965-1975, rutin sản phẩm Viện dược liệu sử dụng làm thuốc tim mạch; có quy trình trích ly rutin từ nụ hoè đạt TCDĐ Đức (DAB7) (hiệu suất 24%) chuyển giao nước Đến năm 1989, nghiên cứu trích ly rutin tiến hành nhiều nơi trường ĐH dược Hà Nội, Viện dược liệu, xí nghiệp Hố dược Một vài sở cơng bố sản xuất rutin xí nghiệp dược phẩm TW2, xí nghiệp liên hợp dược Thái Bình, xí nghiệp hố dược, Viện khoa học Việt Nam, Công ty dược liệu TW1 Phương pháp trích ly rutin đề cập thời gian dùng nước sôi, kiềm cồn (dùng etanol, metanol) Theo kết cơng bố dùng etanol 95% 15 phút chiết 65% rutin sau 1h chiết 85-95% rutin [6] Cho đến năm 1995, dự án “Nghiên cứu triển khai công nghệ sản xuất thử rutin chất lượng cao” nghiên cứu trích ly rutin nước qua xử lý Dây chuyền sản xuất rutin chất lượng cao (ở nhiệt độ >100 oC, áp suất 1-5at) quy mô pilot 3000kg rutin/năm lắp đặt với hiệu suất trích ly cơng bố > 80%, rutin đạt 95% (quercetin < 2%) với chất lượng tương đương TCDĐ Hà Lan NFXI, Đức DAB VII Nhật JP VII [22] Từ năm 1997-2003, vấn đề lựa chọn dung mơi trích ly quan tâm nhiều nghiên cứu tìm giải pháp cơng nghệ Dường mong muốn tìm hệ dung mơi tốt cho q trình trích ly rutin từ nụ hòe nhà khoa học Việt Nam không dừng lại Các nghiên cứu khảo sát nhiều hệ dung môi etanol (95%), amonihydroxit (20%), natrihydroxit (0,15÷30%), nước (100oC, 120oC), dung dịch natricacbonat 1%, axit axetic, metanol (50%, 70%, 80%, 90%) etanol (50%, 70%, 20 80%, 90%) công bố Nhận định chung vẫn là: etanol, metanol trích ly rutin tốt (etanol 80% cho hiệu suất trích ly 29- 29,5%; natrihydroxit 20% dung môi tốt kiềm khác; [12] Trong năm gần đây, qua phương tiện truyền thơng, nhiều doanh nghiệp cơng bố thức sản xuất rutin BV Pharma có cơng suất chiết 20 rutin/năm (hàm lượng 98,0%), có cơng nghệ bào chế viên rutin bao đường (GMP); vimedimex có khả cung cấp rutin > 50 tấn/năm Bên cạnh doanh nghiệp nhà nước, công ty cổ phẩn với quy mô lớn, dây chuyền sản xuất đại tồn khơng doanh nghiệp tư nhân với cơng suất trích ly rutin khơng nhỏ Thí dụ Thái Bình có Cơng ty chế biến nơng sản Đạt Doan (cơng suất 5000 hịe/năm), Quế Hịe (cơng suất 1200-3000tấn/năm), Nhật Cường (công suất 5-6000 tấn/năm) Hàng năm, sở đóng góp cho thị trường rutin thơ Việt Nam -Trung Quốc khối lượng sản phẩm đáng kể Không dừng lại đấy, phát triển hịe rutin cịn phía trước: dự án Thái Bình tới xây dựng nhà máy chiết xuất rutin từ nụ hoè công suất 300 tấn/năm với 100% vốn nước ngồi (trị giá triệu USD); hồn thiện quy trình sản xuất rutin rutin hòa tan mục tiêu mà nhà máy chiết tách dược liệu bán tổng hợp tổng Cơng ty Hóa chất Việt Nam xây dựng Để có quan tâm trọng đầu tư phát triển tiềm lợi nhuận thực tế từ việc trồng hòe, sản xuất rutin xem xét, đánh giá nhìn nhận [12] 3.3.2 Tình hình tinh chế tiêu thụ rutin Tinh chế rutin đạt tiêu chuẩn dược phẩm vấn đề mà hầu hết sở sản xuất rutin bị vướng mắc Từ năm 1995 năm 2000, khơng có cơng bố kết nghiên cứu tinh chế rutin Tuy nhiên việc rao bán công nghệ sản xuất rutin (mã VN2442 738 đạt TCVN hay VN03TMSH0231 với công suất 40 kg sản phẩm/ca đạt TCDĐ Đức DAB VIII, NF 11) xuất Website Sở khoa học Công nghệ tỉnh Tuyên Quang, Techmart Việt Nam Bí tinh chế rutin nằm bí mật Đến năm 2005, có cơng bố kết tinh chế rutin metanol, natrihydroxit sau rutin không tinh chế nước mà đưa sang Trung Quốc qua đường tiểu ngạch dạng thô [12] Một thực tế phủ nhận rutin sản xuất Việt Nam phần lớn không đủ chất lượng để cạnh tranh làm bạn hàng với nhà sản xuất dược phẩm tiềm 21 Ấn độ, Anh, Bỉ nên phần lớn rutin thô bán sang Trung Quốc, Nhật Bản Trước tình hình đó, câu hỏi “tại sao” điều phải trăn trở Phải hạn chế mặt cơng nghệ, Việt Nam chưa tìm cơng nghệ tinh chế rutin phù hợp [12] Do chưa đạt tiêu chuẩn dược phẩm nên rutin Việt Nam có giá trị bán thành phẩm (190.000 - 200.000 đồng/kg, giá thời điểm tháng 4/2009) Trong rutin mức độ tinh nhập lại Việt Nam với giá thành cao (rutin 95% nhập từ Brazil 1.000.000 đồng/kg; rutin 99,0% nhập từ Đức có giá 150.000 đồng/0,5g) Thực tế mức tăng giá “siêu cao” từ kênh phân phối trung gian chưa hẳn giá thành cơng nghệ tinh chế Theo tính tốn chuyên gia, dược chất Việt Nam sản xuất bào chế nước giá thành 30-50% giá sản phẩm có chất lượng tương đương nhập ngoại Do đó, việc tinh chế rutin hàm lượng từ 95-98% tiến hành nước, người tiêu dùng Việt Nam người hưởng lợi từ nhiều khía cạnh: khơng phải trả thuế nhập khẩu, giảm chi phí vận chuyển, giảm thời gian đặt mua hàng, Bên cạnh với nguồn lao động dồi giá thành xuất xưởng rutin tinh sản xuất nước thấp nhiều so với sản phẩm nhập ngoại Rutin Việt Nam khơng cịn sản phẩm thơ mà trở thành mặt hàng dược phẩm với ứng dụng cao hơn, hiệu kinh tế Nó khơng sử dụng làm thuốc mà sử dụng cho nhiều mục đích khác làm chất chuẩn hay chế phẩm trung gian để bào chế dược chất giá trị dùng phòng chống ung thư như: quercetin, melilsulfat (trị HIV), troxerutin (trị chứng giãn, viêm loét tĩnh mạch), O-(β- hydroxyetyl)-rutosit (trị kết tụ tiểu cầu tế bào đỏ), Như vơ hình dung việc đưa công nghệ tinh chế rutin phù hợp không nâng cao giá trị kinh tế, kỹ thuật cho sản phẩm mà cịn góp phần thúc đẩy việc trồng hịe, sản xuất rutin; giải cơng ăn việc làm cho lực lượng lao động dư thừa đồng thời góp phần thúc đẩy phát triển ngành cơng nghiệp hóa dược thời kỳ hội nhập, cơng nghiệp hóa đại hóa 3.4 Nhận định chung thực trạng sản xuất rutin Việt Nam Xuất phát từ sản phẩm nông sản truyền thống nụ hòe, sản xuất rutin Việt Nam phát triển nhiên nhiều vấn đề bất cập: Tồn nhiều nhà sản xuất với đầu tư quy mô chênh lệch + Rutin không tinh chế nước mà chủ yếu bán dạng bán 22 thành phẩm (dạng thô hàm lượng < 95%) sang Trung Quốc + Sử dụng nhiều công nghệ trích ly khác chất lượng sản phẩm khơng đồng Một số sở sản xuất không đảm bảo vấn đề mơi trường + Chưa có cơng nghệ tinh chế phù hợp để nâng hàm lượng rutin lên 98%, đạt TCDĐ Như vậy, từ nguồn tài nguyên sẵn có phương thức khai thác, chế biến chưa hiệu dẫn đến hiệu kinh tế thấp Nếu khơng quan tâm thích đáng, rutin trở thành sản phẩm có số phận bế tắc - “nửa chìm nửa nổi” bao sản phẩm khác Việt Nam Để khắc phục tình hình đó, cần phải có chiến lược đầu tư lâu dài bản: từ việc quy hoạch phát triển vùng nguyên liệu (vùng trồng hòe) đến khâu thu hái bảo quản nguyên liệu nghiên cứu trích ly tinh chế rutin [12] Bảng 3.1 Tiêu chuẩn dược điển rutin Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam STT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Đức Mất khối lượng làm khơ ÷ 8,5% 10 11 Tro sulfat Hàm lượng rutin Hàm lượng quercetin Kim loại nặng Hàm lượng clorofin Sắc tố đỏ Clorofin sắc tốtan ete Tro toàn phần Hàm lượng isoquercetin Hàm lượng kaemperol 3- rutinoside ≤ 0,1% Tiêu chuẩn Mỹ ≥ 5,5% ≤ 9% - ≥ 98,5% ≤ 102% ≥ 95% ≤ KLK 101,5% KLK (UV,TBAH);≥95% (PP UV) (PP HPLC) ≤ 2,0% (HPLC) ≤ 0,001% ≤ 5% - Tiêu chuẩn Liên xô ≥ 6% ≤ 9% (lượng mẫu thử 0,5g, sấy 1350C) < 0,1% (lượng mẫu thử 0,5g) Tiêu chuẩn Việt Nam 5,5 ÷ 9,0% < 0,3% (lượng mẫu 0,5g) ≥ 95% KLK (PP UV) ≥ 97% ≤ 102% (KLK) ≤ 5,0% - ≤ 5,0% ≤ 0,001% ≤ 0,004% ≤ 0,004% - - ≤ 0,004% ≤ 0,004% - - Lắc hỗn hợp (0,1g mẫu thử + 5ml ete), ete phải không màu - - - - - - ≤ 0,5% ≤ 2,0% (HPLC) - - - ≤ 2,0% (HPLC) - - - 23 * Các sản phẩm chứa rutin ứng dụng y học và thực phẩm Trong y dược học, rutin dùng để phòng chống biến cố xơ vữa động mạch, trường hợp suy yếu tĩnh mạch, xuất huyết tử cung xuất huyết, ho máu, đại tiện máu, chảy máu cam Không vậy, người ta sử dụng rutin để bào chế thành thuốc chữa trĩ, chống dị ứng, thấp khớp Một số sản phẩm chức chứa rutin: Nhiều chuyên gia đồng ý thực phẩm tốt cho người bị giãn tĩnh mạch thực phẩm chứa nhiều rutin Rutin sắc tố thực vật có số loại trái rau Rutin loại chất có tác dụng bảo vệ mạch máu, củng cố mao mạch yếu ngăn nguy phát triển thành tình trạng giãn tĩnh mạch Rutin có tác dụng chống viêm, chống huyết khối chống oxy hóa Thực phẩm có chứa rutin có loại: Táo, kiều mạch, nho, anh đào, mơ, dâu đen, bơ 3.5 Các phương pháp định tính, định lượng rutin 3.5.1 Đinh tính rutin Trong q trình trích ly gián đoạn, kiểm tra định tính nhanh rutin dịch chiết hay bã chiết cần thiết để định kết thúc trình Một số phương pháp định tính chứng tỏ cịn rutin là: + Khi cho dung dịch NaOH 0,1N vào dịch chiết, màu vàng tăng lên; + Nhỏ thêm vài giọt HCl đậm đặc bột magie, sau vài phút dịch chiết xuất màu hồng đến đỏ; + Thêm axit HCl 25% bột kẽm vào, dịch chiết chuyển sang màu đỏ; + Thêm vài giọt FeCl3 3-5%, dịch chiết có màu nâu lục, … Ngồi định tính rutin bằng: so sánh phổ hấp thụ dịch chiết với phổ rutin chuẩn điều kiện; định tính rutin sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng (chất hấp 24 phụ silicagel, màu đèn tử ngoại bước sóng 366 nm) với hệ dung môi triển khai: benzen – AtOAC (3:1); CHCl3 – MeOH (15:1); benzen - axeton (9:1); toluen axeton (19:1); CHCl3 – CH3COOH (9:1); MeOH 80% (v/v) [8] 3.5.2 Định lượng rutin Để định lượng rutin nguyên liệu, rutin phải trích ly hồn tồn sau đánh giá rutin từ dịch chiết Chiết Soxhlet metanol phương pháp chiết kiệt rutin tốt Định lượng rutin dịch chiết, rutin thô, rutin tinh chế phẩm dược tiến hành theo phương pháp trọng lượng, đo độ hấp thụ hay so màu Có thể chia thành bốn phương pháp sau: Phương pháp trọng lượng: Đây phương pháp cổ điển đơn giản công bố dược điển nước Việt Nam, Tây Đức DAB8, Hungari, I, II Nguyên tắc chung chuyển hóa rutin thành quercetin tính hàm lượng rutin theo lượng cân quercetin tạo thành Có thể thủy phân rutin H2SO4 loãng (theo DĐVN I) HCl (theo DĐ Hungari IV) Phương pháp ứng dụng nguyên liệu giàu rutin dịch chiết tạp chất kết luận tài liệu phương pháp áp dụng để định lượng rutin mẫu rutin tinh khiết (DĐ VN, DĐ Hungari, DĐ Đức DAB) [6,12] Phương pháp đo màu: Căn vào tạo màu rutin với kiềm hay số thuốc thử khác amonimolipdat, phản ứng cyanidin, Rồi tiến hành đo mật độ quang sau đạt cường độ màu cực đại máy đo quang bước sóng 500nm, đối chiếu kết với mẫu rutin chuẩn Phương pháp dùng để định lượng rutin nụ hòe dạng thuốc [5,7] Phương pháp quang phổ: Căn vào đo độ hấp thụ cực đại dung dịch rutin etanol hai bước sóng λmax= 362,5 nm λmax= 258 nm để định lượng rutin Có thể áp dụng theo TCDĐ VN, TCDĐ Liên xô X NFXI Phương pháp áp dụng để đánh giá rutin sản phẩm dạng thuốc Một số tác giả cải tiến thay cồn tuyệt đối cồn 95% để phân tích rutin dạng thuốc phương pháp quang phổ chuyển rutin quercetin định lượng máy quang phổ Phương pháp áp dụng để định lượng rutin mẫu có độ tinh khiết khác nhau, phục vụ cho kiểm tra công đoạn sản xuất tinh chế rutin [8] Phương pháp sắc ký: Có thể định lượng rutin sắc ký mỏng silicagel với 25 hệ dung môi khai triển n-BuOH - AcOH - H2O (4:1:5), màu đèn UV amoniac Phổ biến định lượng rutin sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Phương pháp HPLC đại ngày dùng để định lượng xác rutin dịch chiết (cây xấu hổ, thuốc lá, nụ hoè), rutin sản phẩm hay chế phẩm dược Những năm 1990, rutin nụ Hòe Việt Nam định lượng cột nhồi, pha động metanol hay etanol, detector UV (λ = 362,5 nm), tốc độ dòng mL/phút Sau sử dụng cột LichrosorbR RP-18 10 µm, 250 x mm, pha động CH3OH/0,4% CH3COOH (60:40, v/v), detector UV λ = 254 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút; nhiệt độ 20-23oC Với điều kiện trên, thời gian lưu rutin 7,2 phút Rutin định lượng cột Appolo RP18 (250 x mm, μm), pha động metanol-nước (48: 52), detector UV λ=258 nm, tốc độ dòng mL/phút Trong số nghiên cứu công bố loạidung môi pha động tốt cho phân tích rutin dung mơi trung tính sử dụng metanol - H2O (48:52), sử dụng pha động có tính axit kết thu không ổn định Tuy nhiên nhiều công bố nhà khoa học khác, sử dụng kỹ thuật HPLC hay LC-MS pha động phải có tính axit Nhìn chung có số nghiên cứu so sánh đánh giá rutin theo bốn phương pháp theo TCDĐ Việt Nam (tập I), Tây Đức (DAB8), Hungari (I, II), Liên Xô (X)và Mỹ (NF XI) Phương pháp phổ tử ngoại phương pháp so màu đánh giá rutin, quercetin số thuốc có kết xấp xỉ 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 4.1 Kết luận Rutin (rutoside) flavonol có dược tính phục hồi vỡ mao mạch tới 88%, rutin chất chống oxy hóa hiệu sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh bệnh tế bào hình liềm, viêm khớp, xơ gan, u hắc tố, Có mặt gần 150 từ 77 loài 34 họ thực vật 70 loài khác 28 họ thực vật dạng vết Trong hòe Việt Nam, rutin có hầu hết phận: nụ chưa nở (44%), nụ vừa nở (34%), hoa nở (14,2%), (3,6-4,4%), vỏ (3,3- 4,3%), hạt (0,5%) Do chứa hàm lượng rutin cao nhất, nụ hòe Việt Nam nguồn nguyên liệu để trích ly rutin tốt giới Trong ba cơng nghệ trích ly rutin đạt hiệu kinh tế kỹ thuật cao tìm được: trích ly rutin với lớp dung mơi chuyển động (nước vơi-borax 4%o), trích ly rutin metanol có khuấy trộn, trích ly siêu âm rutin metanol cơng nghệ trích ly siêu âm rutin metanol phương án sản xuất hiệu đại (hiệu suất đạt 96,23%, hàm lượng rutin 55-70%) 4.2 Kiến nghị Hoàn thiện nghiên cứu tinh chế rutin mức độ cao quy mô công nghiệp 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Diệu Liên Hoa, Phạm Đình Hùng (2015) Hóa học hợp chất tự nhiên, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 272 - 294 Đinh Ngọc Lâm (1987) Cây hịe, Nhà xuất nơng nghiệp, Hà Nội, 1-15 Viện dược liệu (1993) Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, 521-527 Võ Văn Chi (1999) Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, 9-31, 571573 Công Luận (2009) Sáng kiến đem lại hiệu kinh tế cao đất Tây Nguyên, Báo điện tử đảng cộng sản Việt Nam, 79589 Bộ môn Dược liệu (1990) Nghiên cứu phương pháp chiết xuất rutin đạt tiêu chuẩn xuất từ hoa hòe, Báo cáo đề tài 1988-1990, 1-36 Đinh Ngọc Lâm (1987) Cây hòe, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, 1-15 Bộ y tế (2002) “rutin, viên rutin, hòe (hoa)”, Dược điển Việt Nam, 251-253, 378379; Dược điển Việt Nam-bản bổ sung (2006), 582, Nhà xuất y học 10 Yuping Tang, Fengchang Lou, Jinghua Wang, Shufei Zhuang (2001) Four new isoflavone triglycosides from Sophora Japonica L., Journal of Natural Products, 64 (8), 1107-1110 11 Youngki Park, Hak-Ju Lee, Sung-Suk Lee, Don-Ha Choi, Jung-Soo Oh (2004) New isoflavone glycoside from the woods of Sophora japonica, Bull Korean Chem Soc., 25(1), 147-148 12 Yu-Ping Tang, Hua-Xu Zhu, Jin-Ao Duan (2008) Two new isoflavone triglycosides from the small branches of Sophora japonica, J Asian Nat Prod Res., 10 (1), 65-70 13 Lê Thị Anh Đào (2000) Rutin Sophora Japonica L Thái Bình Hà Bắc, Tuyển tập toàn văn báo cáo hội thảo quốc gia "Định hướng phát triển ngành hóa học cơng nghiệp hóa chất Việt Nam trước thiên niên kỷ mới", Hội hóa học Việt Nam, 286 14 Lê Thị Anh Đào (1997) Rutin nụ hoa hoè Thái Bình Bắc Giang, Thông báo khoa học, (1), 47-50 15 Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Mai Phương (1992) Tách tinh chế nghiên cứu số tính chất lectin nụ hoa hịe Sophora japonica L., Tạp chí sinh học,14(2),32-38 16 Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu 28 Hương, Hồ Việt Anh (2006) So sánh hoạt tính chống oxy hố số flavonoid (dạng glucosid dạng genin) chiết từ hoa hoè vỏ quýt, Tạp chí dược liệu, 11(5), 185-188 17 Bộ Y tế Bộ giáo dục đào tạo (1998) Bài giảng Dược liệu, tập 1, 259-294 18 Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ Quốc gia (2004) Chọn giống hoè sơ chế nụ hoè, Báo Nông nghiệp Việt Nam, 2004-1123.3907 19 Nguyễn Tiến Hùng, Hà Hồi, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Việt Hương, Tống Viết Thắng (2005) Nghiên cứu phương pháp chế biến nụ hòe sau thu hoạch, Tạpchí dược học, 11, 14-15 20 Phùng Hịa Bình, Đỗ Ngọc Thanh, Khương Thị Mai Lan (2005) Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt đến thành phần flavonoid hòe hoa, Tạp chí dược học, 8, 10-13 21 Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Hồng Nhan (2003) Khảo sát độ bền rutin quercetin trích từ hịe (Sophora Japonica L.), Hội nghị hóa học tồn quốc lần thứ IV, 261-266 22 Everaldo Moreira da Costa, José Maria Barbosa Filho, Ticiano Gomes Nascimento, Rui Oliveira Maceedo (2002) Thermal characterization of the quercetin and rutin flavonoids, Thermochimica Acta., 392-393, 79-84 23 Phan Tống Sơn, Lê Kiều Nhi, Phan Minh Giang, Nguyễn Văn Đậu (2002) Phân lập xác định rutin từ Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) Việt Nam, Tạp chí dược học, 7, 11-13 23 G I Lukpiahskova, S G Tiraspo Skata, T S Lyktanchikov (1987) Phép so màu phân tích dạng thuốc chứa rutin quercetin, Thông báo dược liệu, 19 (4), 17-20 29