Thu nhận ethanol từ sinh khối rong nước lợ chaetomorpha sp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN MINH HÁI THU NHẬN ETHANOL TỪ SINH KHÔI RONG NƯỚC LỢ CHAETOMORPHA SP LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYÊN MINH HẢI THU NHẶN ETHANOL TÙ SINH KHÓI RONG NƯỚC LỢ CHAETOMORPHA SP Phản biện độc lập: GS TS Nguyễn Minh Thủy Phản biện độc lập: PGS TS Phan Tại Huân Phán biện: PGS TS Đồng Thị Thanh Thu Phàn biện: PGS TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Phán biện: TS Lê Thị Ánh Hồng NGƯỜI HƯỚNG DÀN KHOA HỌC: l GS TS Lê Văn Việt Mần PGS TS Hồng Kim Anh THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kêt tât sô liệu nghiên cứu luận án riêng tôi, chưa sứ dụng đô bảo vệ học vị số liệu trình bày nghiêm túc, quy định tài liệu dẫn chứng có nguồn gốc rõ ràng Tác gia luận án Nguyên Minh Hải i TÓM TẨT Rong Chaetomorpha sp thu nhận từ ao nuôi thủy sản tỉnh Bạc Liêu; rong làm sấy khô độ ẩm 5-10% Thành phần polysaccharide rong có nhiều loại liên kết glycoside khác nhau; đó, liên kểt P-1,4- glucopyranosyl chiếm tý lệ 74,4% Rong tiền xử lý NaOH kết hợp với sóng siêu âm để tách phần protein khoáng nhàm làm tăng hàm lượng polysaccharide lại Rong tiếp tục xứ lý bang H2SO4 loãng đè phá vờ cấu trúc tinh thề cùa polysaccharide Sau trình tiền xừ lý, rong chuyến hóa thành ethanol phương pháp: SHF (thủy phân lên men tách biệt), SSF (đường hóa lên men đồng thời) kết hợp SHF-SSF Tiền xứ lý bàng NaOH sóng siêu âm có tham sổ phù hợp nồng độ NaOH 1,0% w/v, tỳ lệ rong:dung dịch NaOH 1:25 (w:v), công suất siêu âm 45W/g, thời gian siêu âm phút, thời gian tách protein khoáng 60 phút nhiệt độ 60 °C; sau trình xừ lý, rong chứa xấp xỉ 72% polysaccharide Rong tiếp tục xử lý với H2SO4 1,75% w/v, tý lệ rong dung dịch H2SO4 12,5% w/v, nhiệt độ 120 °C thời gian 30 phút; kết số tinh thể hạt rong bị giâm 42,0% so với ban đầu Rong tiếp chuyển hóa thành ethanol phương pháp SHF với tham số q trình đường hóa tỷ lệ rong 10% w/v, nồng độ Cellic Ctec2 Novozyme 188 30 FPU/g 10 CBU/g nguyên liệu, thời gian dường hóa 40 giờ, thu dược dịch thúy phân có tống lượng đường khử glucose 65,8 g/L 39,3 g/L; trình lên men tiến hành nhiệt độ 35 °C, mật độ giống cấy lOxlO6 CFU/mL thời gian 40 giờ; thu sản phẩm ethanol có nồng độ 1,83% v/v hiệu suất lên men đạt 54,8% Rong chuyển hóa thành ethanol phương pháp SSF với tham số tỷ lệ rong 9% w/v, nồng độ Cellic Ctec2 Novozyme 188 25 FPU/g CBU/g, mật độ giống cấy lOxlO6 CFU/mL nhiệt độ lên men 38 °C thời gian 36 giờ; thu dung dịch ethanol 2,1% v/v hiệu suất lên men đạt 70,0% Với phương pháp kết hợp, rong đường hóa theo điều kiện phương pháp SHF, bô sung thêm rong với tý lệ 37,5% so với lượng ban đau đường hóa, nồng độ Cellic Ctec2 Novozyme 188 20 FPU/g CBU/g rong bổ ii sung, mật độ giống cấy 20x1 o6 CFU/mL, nhiệt độ thời gian lên men 38 °C 36 giờ; canh trường thu có hàm lượng ethanol 3,93% (v/v) hiệu suất lên men 89,6% Q trình phân tích chuycn hóa cùa thành phần chứa carbon phương pháp lên men cho thấy, phương pháp SHF cỏ ty lệ chuyển đối nguyên liệu thành ethanol với tỷ lệ Cethanoi'.Cc02 thu 1:1,5, hai phương pháp SSF kết họp SHF-SSF cho tỷ lệ Cethanoi:Cco2 tương đương 1:0,8 iii ABSTRACT Chaetomorpha sp biomasss is collected from aquaculture areas in Bac Lieu province The seaweed is cleaned and dried to archive material moisture of 5-10% The polysaccharide components in seaweed have many different glycosidic linkages; in which, 0-1,4-glucopyranosyl linkage accounts for 74.4% The seaweed is pretrealed by ultrasonic-assisted NaOH to remove the protein and minerals, that increase the remaining polysaccharides content in seaweed The seaweed biomass is further treated with dilute H2SO4 in order to break down the crystal structure of the polysaccharides After chemical pretreatments, seaweed biomass is converted into ethanol by three methods: SHF (separate hydrolysis and fermentation), SSF (simultaneous saccharification and fermentation) and SHF-SSF combination Ultrasonic-assisted NaOH pretreatment has appropriate parameters such as NaOH concentration of 1.0% w/v, ratio of seaweed: NaOH solution of 1:25 (w:v), ultrasonic power of 45W/g, ultrasonic treatment for minutes, then seaweed biomass is treated to separate proteins and minerals at 60 °C and 60 minutes; after processing, seaweed biomass contains approximately 72% polysaccharides The seaweed was further treated with 1.75% w/v H2SO4, the seaweed content in the H2SO4 solution of 12.5% w/v, the temperature of 120 °C and the time of 30 minutes As a result, the crystallinity index of seaweed biomass is reduced by 42.0% compared to original seaweed The pretreated seaweed is further converted into ethanol by the SHF method, that has the suitable parameters of saccharification process such as seaweed content in suspension of 10% w/v, Cellic Ctec2 and Novozyme 188 enzyme concentrations of 30 FPU/g and 10 CBU/g of raw material, respectively, saccharification time of 40 hours, obtained seaweed hydrolyzate has total reducing sugar and glucose concentration of 65.8 g/L and 39.3 g/L, respectively; subsequent fermentation is carried out at 35 °C, initial inoculum density of lOxlO6 CFU/mL and fermentation time of 40 hours; obtained fermentation broth has ethanol concentration of 1.83% v/v and fermentation efficiency of 54.8% The pretreated seaweed is also converted to ethanol by the SSF method with the appropriate parameters as follows: seaweed biomass ratio of 9% w/v iv in biomass suspension, Cellic Ctec2 and Novozyme 188 enzyme concentrations of 25 FPU/g and CBU/g, respectively, the initial inoculum density of I Ox o6 CFU/mL, fermentation temperature of 38 °C and time of 36 hours; obtained fermentation broth has ethanol concentration of 2.1% v/v and fermentation efficiency of 70.0% For combined method, the seaweed is saccharified with appropriate parameters of the SHF method; after that, seaweed hydrolyzate is added pretreated seaweed of 37.5% (compared to amount of saccharified seaweed), the Cellic Ctec2 and Novozyme 188 enzyme concentrations of 20 FPU/g and CBU/g of added seaweed, respectively, the initial inoculum density of 20xl06 CFU/mL, the fermentation temperature and time of 38 °C and 36 hours, respectively; the obtained fermentation broth has the ethanol concentration of 3.93% (v/v) and fermentation yield of 89.6% The analysis of the metabolism of carbon-containing components in the three fermentation methods show that the SHF method has the lowest conversion rate of seaweed biomass to ethanol with the obtained Cethanoi:Cco2 ratio of 1:1.5, while the SSF and the SHF-SSF combination methods give an equivalent V CethanoiiCco? ratio of 1:0.8 LỊI CẢM ƠN Tơi xin chân thành càm ơn tất bạn, đồng nghiệp, em sinh viên tơi nhiệt tình hỗ trợ cho tơi q trình thực luận án Đặc biệt, xin gứi lời tri ân đến cô Hoàng Kim Anh thầy Lê Văn Việt Mần, người thầy đà dẫn dắt định hướng cho tơi q trình học tập nghiên cứu; nữa, cương vị đồng nghiệp, thầy cô động viên tơi nhiều để tơi vượt qua khó khán hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin cám ơn gia đình làm chỗ dựa vũng cho đường học tập nghiên cửu khoa học Nguyễn Minh Hai vi DANH MỤC HÌNH X DANH MỤC BẢNG xii DANH MỤC CHỦ VIÉT TÁT xiv MỞ ĐẦU Chương TỐNG QUAN 1.1 Rong (Algae) 1.2 Rong Chaetomorpha sp đồng sông Cửu Long 1.3 Thu nhận ethanol lừ sinh khối rong 1.3.1 Tiền xử lý 1.3.1.1 Các phương pháp tiền xứ lý 1.3.1.2 Sự hình thành chất ức chế vi sinh vật 11 1.3.2 Đường hóa lên men 13 1.3.2.1 Phương pháp SHF 13 1.3.2.2 Phương pháp SSF 16 1.3.2.3 Một số phương pháp cải tiến 18 1.4 Các vấn đề tồn 19 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cúu 21 2.1 Nguyên vật liệu 21 2.1.1 Rong Chaetomorpha sp 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm .22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Xác định thành phần hóa học rong 26 2.2.2 Nghiên cứu tiền xư lý sinh khối Chaetomorpha sp 26 2.2.3 Chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol bàng phương pháp SHF 31 2.2.3.1 Đường hóa bang enzyme 31 2.2.3.2 Lên men ethanol 32 2.2.4 Chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol bàng phương pháp SSF 33 2.2.5 Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol phương pháp kết hợp SHF-SSF 35 vii 2.3 So sánh phương pháp lên men 38 2.3.1 Sự chuyên hóa hợp chât chửa carbon trình lên men 38 2.3.2 So sánh hiệu phương pháp lên men 39 2.4 Phương pháp phân tích .40 2.5 Cơng thức tính tốn 42 2.6 Phương pháp xứ lý số liệu 43 Chuông KÉT ỌUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Kết khao sát thành phầnhóa học cúa rong Chaetomorpha sp 44 3.1.1 Thành phần polysaccharide 44 3.1.2 Thành phần acid amin trongprotein 46 3.1.3 Khoáng 47 3.2 Tiền xử lý nguyên liệu 48 3.2.1 Tiền xứ lý dung dịch NaOH (% w/v) đè tách protein khoáng .50 3.2 ỉ.1 Anh hưởng tỳ lệ nguyên liệu:dung dịch NaOH 50 3.2.1.2 Anh hưởng cùa nồng độ dung dịch NaOH (% w/v) 51 3.2.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ (°C) 52 3.2.1.4 Ánh hưởng thời gian tiền xử lý 53 3.2.2 Tiền xứ lý rong sóng siêu âm dung dịch NaOH (% w/v) dê tách protein khoáng 56 3.2.2.1 Công suất siêu âm 56 3.2.2.2 Thời gian siêu âm 57 3.2.3 Tiền xử lý rong dung dịch H2SO4 (% w/v) để phá vỡ cấu trúc tinh thê sinh khôi rong 60 3.2.3.1 Nồng độ dung dịch H2SO4 60 3.2.3.2 Tý lệ nguyên liệu dung dịch H2SO4 (% w/v) 62 3.2.3.3 Nhiệt độ tiền xử lý 64 3.2.3.4 Thời gian tiền xứ lý với dung dịch H2SƠ4(% w/v) 65 3.3 Chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol bang phương pháp SHF 69 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa 69 3.3.1.1 Tý lệ nguyên liệu (% w/v) 69 viii 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Total 3 3 3 3 39 3,81 2,73 1,94 1,08 0,91 0,88 089 0,89 0,90 4,87 0,22 0,23 19 0,10 0,03 0,13 009 10 0,08 7,04 0,0565 0,0843 0,0952 0,0929 0,0278 0,1473 0,096 0,1072 0,0839 1,4461 Multiple Range Tests for Glucose TN5 by Thoi Method: 95,0 percent LSD Thoi gian Count Mean 36 0,88 0,89 40 44 0,89 48 0,90 32 0,91 28 1,08 24 1,94 20 2,73 16 3,81 12 4,56 7,63 10,37 26,66 3,59 2,51 1,76 0,99 0,88 0,75 0,8 0,79 0,83 0,75 4,02 2,97 2,13 1,19 0,93 1,01 0,97 0,98 0,98 29,34 0,43 0,46 0,37 0,2 0,05 0,26 0,17 19 0,15 28,59 gian Homogeneous Groups X X X X X X XX XX XX X X X X Summary Statistics for HMF TN5 Thoi Standard Coeff of gian Count Average deviation variation Minimum Maximum Range 210 0,0621 224 13 198 26 178 13 0,0704 166 191 25 174 163 12 0,0708 151 23 12 11 0,0717 137 21 147 158 122 11 111 22 16 0,09 133 20 101 0,0748 94 109 15 24 94 0,0711 88 101 13 84 77 92 28 0,0899 15 32 76 0,0596 80 71 12 71 77 36 0,0845 65 40 72 0,1049 80 65 15 180 44 48 Total 3 39 73 70 112 47 0,0556 0,0795 0,4165 69 64 64 77 75 224 11 160 Multiple Range Tests for HMF TN5 by Thoi gian Method: 95,0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups X 48 70 36 71 X 40 72 X 44 73 X X 32 76 XX 28 84 24 94 XX X 20 101 X 16 122 12 147 X X 163 178 X 210 X Summary Statistics for Ethanol TN5 Thoi Standard Coeff of gian Count Average deviation variation Minimum Maximum Range 0,00 0,00 % 0 0,87 0,05 0,0527 0,82 0,91 0,09 1,04 0,18 0,1443 1,39 0,35 1,21 12 1,52 1,84 0,32 1,68 16 0,0951 16 19 0,0907 1,87 2,24 205 0,37 2,84 2,67 0,17 20 0,0619 2,51 0,33 24 3,04 0,0362 0,22 0,11 2,93 3,15 3,42 14 3,29 0,27 28 0,0396 3,56 32 3,77 0,08 0,02 3,7 0,15 3,85 36 3 93 0,05 0,0128 3,88 3,98 0,1 40 89 0,0271 3,79 0,21 0,11 44 0,2 3,88 10 0,0258 3,78 3,98 48 3,85 0,08 0,0196 3,77 3,92 0,15 Total 64 0,4978 4 39 31 Multiple Range Tests for Ethanol TN5 by Thoi gian Method: 95,0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups X 181 12 16 20 24 28 32 48 44 40 36 3 3 3 3 3 3 X X X X X X X 0,87 1,21 1,68 2,05 2,67 3,04 3,42 3,77 3,85 3,88 3,89 3,93 X X X X X Các phương pháp phân tích 2.1 Phuong pháp DNS a Pha thuốc thử DNS - Hóa chat: DNS - Acid dinitrosaclicylic (C H,N:Or), NaOH, Potassium sodium tartrate (KNaC.H4O 4H O) - Cách pha thuốc thừ DNS: cân 10g DNS hòa vào 300ml nước cất, khuấy gia nhiệt khoảng 50 c Cân 10g NaOH hòa tan vào 150ml nước cất Đợi DNS tan hết, ta cho dung dịch NaOH vào khuấy Thêm lừ từ 300g muối tactrate vào, gia nhiệt lên 80 c khuấy tan hết Định mức thành 1000ml bảo quản chai thuy tinh tối màu b Dựng đường chuẩn đường khử Dung dịch đường chuẩn thí nghiệm: dung dịch đường glucose có nồng độ lmg/ml Hút dung dịch đường theo báng sau: Lắc đều, hút 0,3ml dung dịch từ ống, thêm vào 0,9ml thuốc thử DNS Đun 90°C phút, có đậy nắp ống nghiệm Sau phút, làm nguội nhanh, đo OD575nm Dựng đường chuân đường khứ 182 Bảng 2.1 Cách dựng đường chuẩn glucose Mẩu Blank s 9 10 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Glucose mg/ml (ml) Nước cất (ml) Nồng độ mg/ml 2.2 Xác định tông lượng polysaccharide nguyên liệu a Nguyên tắc Thủy phân hoàn toàn nguyên liệu chứa polysaccharide thành đường đơn Xác định tống lượng đường đơn phương pháp DNS Quy đổi đường đơn thành polysaccharide bàng hệ số 0,9 b Tiến hành Cân xác 300mg mẫu khô vào chai thủy linh chịu nhiệt Thêm vào 3ml dung dịch H2SO4 72%, đậy nắp chai, lắc đều, đổ yên nhiệt độ phòng 30 phút Sau 30 phút, thêm vào mầu thử 51 ml nước cất đe đạt nồng độ H2SO4 4%, lắc Đậy kín xử lý mẫu 121°c 60 phút Làm nguội, đo hàm lượng đường khử sinh bàng phương pháp DNS Xác định lượng polysaccharide nguyên liệu 2.3 Xác định liên kết glycoside polysaccharide Để xác định thành phần liên kết glycosid phân tử polysaccharide, 100 pg mẫu cho vào ống nghiệm ộ 13 Sau đó, 250 pL HC1 IM methanol thêm vào ống nghiệm Toàn hỗn hợp gia nhiệt 80 °C 15 phút; điều 183 sc thúy phân hoàn toàn polysaccharide chuyến chúng thành hợp chất methyl glycoside; HC1 cho bay bàng cách sử dụng 100 pL í-butyl alcohol Hỗn hợp methyl glycosid silyl hóa cách cho thêm hồn hợp 0,5 mL pyridine, 0,1 mL hexamethyldisilazan 0,05 trimethylchlorosilane Mầu tiếp tục gia nhiệt 80 °C 20 phút để tạo dẫn xuất silyl hóa sau tác nhân silyl hóa bay nhiệt độ phòng Hồn hợp dẫn xuất thu hòa tan lại bang mL hexan, kết tủa loại bỏ muối tạp Dịch nơi bay lần hịa tan lại bang 100 pL hcxan; pL dịch sứ dụng đe phân tích thành phần methyl glycoside thu kỷ thuật GC/MS Bên cạnh đó, 100 pg mồi loại đường chuẩn (glucose, fucose, galactose, mannose, rhamnose, xylose arabinose) thực tương tự mẫu chứa polysaccharide Tất nghiên cứu dược thực phịng thí nghiệm cua Trung tâm Ngiên cứu Carbohydarte phức hợp (Complex Carbohydrate Research Center) Đại học Georgia (Mỳ) 2.4 Xác định hàm lượng protein phương pháp Kieldahl: a Ngun tắc Vơ hóa rong bang IỈ2SO4 đậm đặc có chat xúc tác HCIO4, dùng kiềm đặc mạnh NaOH NHí từ muối (NH4hSO4 thổ tự do, NH3 hấp thụ H2SO4 tiêu chuẩn Sau định lượng H2SO4 tiêu chuẩn dư NaOH tiêu chuẩn b Cách tiến hành Vơ hóa mẫu: mục đích biến đổi chất hữu thành chất vơ Cân xác (),2g mẫu sấy khô tuyệt đối vào ống phá mầu Thêm vào mồi ống 20ml H2SO4 đậm đặc khoáng 40 giọt chất xúc tác HC1Ơ4 Đặt ống phá mẫu lên hệ thống phá mầu, tiến hành nhiệt độ 400°C đến dng dịch suốt có màu xanh ngọc (khơng có cặn) dừng q trình vơ hóa mẫu lại, sau đe nguội Xác định hệ so K: tiến hành tương tự với thí nghiệm mẫu chứa nitơ thành mẫu trắng ( không chứa nitơ) Tính giá trị hàm lượng nitơ (N) có mẫu thí nghiệm theo cơng thức: N= (20-VlxK)x0,0014x100x100 1/2x0,2 184 Trong đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng V2: The tích H2SO4 O,1N để hấp thu NH3 0,0014: hệ số chuyến đổi, K: hệ số mẫu trắng Hàm lượng protein = Nx5.13 2.5 Phân tích thành phần acid amin protein Phân tích tiến hành bàng cách sử dụng 10 miligram mầu protein từ rong (có hàm lượng protein xấp xỉ 70 %) làm lạnh đông -56 °C Sau khối đơng hịa vào 200 pL NaOH 1%, phối trộn thêm 167 pL methanol 34 pL pyridine Sau đó, mẫu thêm 20 pL methyl chloroformate (MCF) hỗn hợp vortex rong 30 giây; tiếp tục thêm 20 pL MCF vortex tiếp tục 30 giày đè lạo dẫn xuất MCF bay acid amin Đe tách dẫn xuất MCF, 400 pL chloroform thêm vào lắc 10 giây, sau cho tiếp 400 pL NaHCO? 50 mM lac thêm 10 giây Lớp dịch phía loại bó pha chloroform bên làm khô cách cho thêm lượng nhô NaiSCh khan đem phàn tích thành phần acid amin bàng kỹ thuật GC/MS Các thí nghiệm thực Trung tâm Phân tích Đại học Missouri (Mỹ) 2.6 Phân tích lipid a Nguyên tắc Nguyên liệu làm khơ, sau trích ly lipid khỏi nguyên liệu bang ether dầu hóa ether ethylic máy Soxhlet xác định khối lượng chất béo b Dụng cụ hóa chất Máy Soxhlet, giấy lọc, hexan c Tiến hành Giấy lọc sấy 105°C đến trọng lượng khơng địi Ngun liệu nghiền nhở, sấy 105°C đen trọng lượng khơng đổi Cân xác - g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc gói lại cho kín khơng đe mẫu rơi 185 Đổ giấy lọc chứa mẫu vào trụ chiết máy Soxhlet Chiết bàng dung môi hexan Sau chiết het lipid (khoang giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khơ đen trọng lượng khơng đơi d Tính tốn Hàm lượng lipid thơ tính theo cơng thức: mi - mj X (%) = X 100 mo Trong đó: X : hàm lượng lipid % me trọng lượng giấy lọc mẫu trước chiết (g) m2: trọng lượng giấy lọc mẫu sau chiết (g) mo: trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid (g) 2.7 Phân tích tro tổng - AOAC 930.30 (2000) a Nguyên tắc Nung mẫu nhiệt độ cao 600°C đê thành phần mẫu hóa tro hồn tồn, cân khối lượng cịn lại đê xác định hàm lượng tro có mầu b Hóa chất, dụng cụ, thiết bị Cốc nung mầu: phải cốc làm sứ c Tiến hành Chuẩn bị mẫu Rửa cốc nung bang nước, sấy tú sấy 105(,C 30 phút nung lò nung 600"C khơng q tiếng Làm nguội bình hút ẩm khoảng 20 phút cân với độ xác đến 0.00 Ig Xác định hàm lượng tro Cân khoảng g mầu khố tuyệt đối (đã loại bỏ âm cách sấy đến khối lượng không đối 105°C) với độ xác 0.00Ig cốc nung chuẩn bị Tiền xừ lý bảng H2SO4 đậm đặc (nếu cần) 186 Nung nhiệt độ 600°C thu tro màu trắng ngà (khi có mặt sắt có màu đỏ gạch, có mặt đồng mangan có màu xanh nhạt) Làm nguội bình hút ẩm Quá trình nung lặp lại cốc nung có khối lượng khơng đoi d Tính tốn Hàtn lượng tro (X) tính % theo cơng thức: X = [(mi -ni2)xl00]/m Trong đó: m: lượng mẫu cân,g mu khối lượng cốc nung, g m2: khối lượng cốc nung tro, g Kết trung bình cộng kết lần xác định Chênh lệch kết lần xác định khơng dược lớn hom 0,02% Tính xác đến 0,01% 2.8 Xác định hàm lượng glucose phuong pháp GOD-PAP a Nguyên tắc Dựa vào phân ứng: Glucose bị oxi hóa bưi xúc tác enzyme Glucose oxidase (GOD) tạo thành gluconic acid hydrogen peroxide (H2O2) H2O2 tác dụng với chloro-4-phenol 4-amino-antipyrine (PAP) xúc tác cúa enzyme peroxidase (POD) de tạo thành chất màu hồng quinoneimine Đo dung dịch bước sóng 500nm đê xác định glucose tạo thành b Hóa chất - Lọ R1: hệ đệm enzyme: Dung dịch đệm phosphate 150 mmol/L Glucose oxidase (GOD) > 20000 UI/L Peroxidase (POD) > 1000 UI/L 4-amoni-antipyrine (PAP) 0.8 mmol/L - Lọ R2: chromogen: Chloro-4-phenol 2mmol/L - Lọ R3: dung dịch chuân : Glucose 100mg/DL (5.55 mmol/L) c Tien hành 187 Hòa tan lọ RI R2 vào 200ml nước, định mức tới 250 ml, dung dịch GOD-PAP Hút Iml dung dịch GOD-PAP vào Eppcndorf + 10pl mẫu chứa glucose, U 20 phút sau tiến hành đo bước sóng 500nm Mầu kiếm chứng: tiến hành tương lự mẫu trên, thay lOpl mẫu chứa glucose = 10pl Glucose 100mg/DL d Tính tốn ODmẫu K —— X nong độ mâu kiếm chứng Nồng độ glucose mẫu = ———5—— ODmâu kiêm chứng 2.9 Định lượng carbon thành phân nguyên liệu chứa carbon a Nguyên tắc Nguyên liệu oxy hóa K2CT2Ơ7 với xúc tác H2SO4 đậm đặc để chuyển hóa hợp chất hữu có chứa c thành CO2 sau chuẩn độ lượng thừa K2Cr2Ơ7 để xác định lượng K2CT2O7 tham gia phản ứng, từ suy lượng c hữu nguyên liệu b Hóa chất foCrjCh, H2SO4, Muối Mohr, o-phenanthroline c Cách tiến hành Cân xác mẫu có khối lượng từ 20-50 mg cho vào bình tam giác Cho vào mẫu mL K2Cr2Ơ7 0,4N sau cho them 10 mL H2SO4 đậm đặc Mầu lắc nhẹ ủ nhiệt độ phòng 16-18 sau thêm 100 mL nước cất vào hỗn họp Lượng thừa cũa K2Cr2Ũ7 chuẩn độ bang muối Mohr 0,2 N với o- phenanthroline làm chất thị màu Mầu trang thực tương tự khơng có mầu ngun liệu d Tính tốn Lượng carbon ngun liệu tính theo cơng thức sau: C (%) = ((A - T*A/S)*0,006)/m)*100 Với A: Thể tích K^CftO? thêm vào mẫu T: The tích muối Mohr dùng để chuẩn độ mẫu thực 188 S: The tích muối Mohr dùng de chuẩn độ mẫu trắng m: khối lượng mầu dùng phân tích (g) 0,006: lượng carbon bị oxy hóa bới I11L K2Cr2Ơ7 0,4N (g) Một số kết phân tích HPLC 50 40 MV 30 20 10 000 -10 200 400 600 800 10'00 12'00 1400 lew 18.00 Mnutes MV Hình 3.1 Săc kỷ cùa sơ chât chn Mnutes Hình 3.2 Mâu có hàm lượng ethanol 1,1% 189 2000 22 00 24'00 26*0 MV MV Mnưtes Một số kết phân tích XRD 190 Rmt nOO - 100 - 200 - 10 20 30 40 Position [°2Theta] (Copper (Cu)) Hình 4.1 Giản đồ nhiều xạ rong nguyên liệu S12 600 - 400 - 200- 0-1 10 1 20 30 40 Position [°2ThetaJ (Copper (Cu)) Hình 4.2 Giản nhiêu xa mâu tiên xử lý băng H2SO4 với tỷ lệ nguyên liêu 12.5% 191 A2.0 800- 600- 200 — 0-4— Ĩ—r 1—r 20 10 30 40 Position (°2Theta] (Copper (Cu)) Hình 4.2 Giàn đồ nhiễu xa mầu tiền xử lý H2SO4 nồng độ 2,0% — X • X X • A w X Một sơ kêt phân tích băng phân bơ kích thước hạt HORIBA LA-fflfaririm(™)[WET(LA.920)]Va337 lA-92'j ffiian < fa Wiifowi Ultra some Laser T% Lamp T% Sample Name Dispersant 01:00 (3) 88 1(%) 91 8(%) ■Ml DI WATER SP Area Median Mean Mode : 206 01 (air cm- ) : 502.0950(pm) : 517.2453(pm) : 635.4276(pm) Hình 5.1 Kêt phân tích phân bơ kích thước hạt rong chưa qua tiên xử lý 192 HORIBA LA-920 foiiWB(l|BHiUO)]Vff337 IA-93 span ÍOỈ Iains 100 ■c o- ,o o'- 5.000 10.00 1000 2000 100 Diameter (ỊLIL11) Filename Cu dilation Speed Ultra sonic Laser T*i Lamp T* Sample Name Dispersant ■M2 01-00(3) 90.6(%) 95 x%) M2 DI WATER s p Area Median Mean Mode : 308 24(cm: on’ ) : 344 1138(nm) : 392.591 l(jun) : 484 9714(nm) Hình 5.2 Ket phân tích phân bố kích thước hạt rong tiền xử lý bàng NaOH kết hựp siêu âm HORIBA LA-920 LA-Ỹ20ỉvstaníorWniịows 1.000 1000 100.0 10.00 Diameter (pm) Filename Circulation Speed Ultra sonic Laser T% Lamp T% Sample Name Dispersant 1MỔ :5 101.00 (3) : 94 0(%) 191 8(%) :M6 1D.I WATER 1481 4(cm: cm3 ) 83.7860(|im) 92.314d(imi) 95.0420(iun) S P Area Median Mean Mode £ F « x Hình 5.3 Kêt phân tích phân bơ kích thước hạt rong tiên xư lý băng H2SO4 193 Các thiết bị sứ dụng nghiên cứu Hình 6.1 Máy gia nhiệt Sandbath (a) thiêt bị siêu âm (b), máy đo nhiêu xạ tia X (c), r _ r kính hiên vi điện tử quét (d), hệ thông HPLC (c), máy đo phân bơ kích thước hạt (f), máy quang phơ UV-Vis (g), bê gia nhiệt siêu âm (h), máy lăc ôn nhiệt (i) ông chứa mâu tiên xư lý Sandbath (j) 194