ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_ ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM - TIỂU LUẬN MÔM HÓA SINH

ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_ ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM TIỂU LUẬN MÔM HÓA SINH,

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN HÓA SINH :

ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_ ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN

THỰC PHẨM.

GVHD : NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG SVTH : ĐHTP6ALT_NHÓM 24

DANH SÁCH SVTH : NGUYỄN THỊ THẢO QUYÊN 10323501 NGUYỄN THỊ THANH LỆ 10320701

ĐINH THỊ BÍCH TUYỀN 10306811 PHẠM THỊ PHƯƠNG THẢO 10322281

TIỂU LUẬN HÓA SINH :

ĐƠN VỊ HOẠT TÍNH ENZYME_ ỨNG DỤNG HOẠT TÍNH ENZYME TRONG PHÂN TÍCH VÀ CHẾ BIẾN

THỰC PHẨM.

1.1 Khái niệm:

- Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau:

Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.

Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao.

- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ

là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.

- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.

- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ

thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme.

- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng

- Các quá trình hoá học xảy ra trong cơ thể sống là những phản ứng có hiệu quả cao nhất Đó là nhờ tác dụng xúc tác của enzyme, enzyme là những chất xúc tác sinh học, có thể là protein hoặc acid nucleic, có đầy

đủ tính chất của chất xúc tác, ngoài ra còn có những tính chất ưu việt hơn so với các chất xúc tác khác như: hiệu suất cao trong điều kiện nhiệt

độ và áp suất bình thường, có tính chất đặc hiệu cao Các tính chất này vẫn được giữ nguyên khi tách enzyme ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện invitro (trong ống nghiệm) Vì vậy mà enzyme càng được

sử dụng rộng rãi trong thực tế, trong công nghiệp… nên đã hình thành nên nhiều ngành lien quan đến enzyme như công nghệ sản xuất enzyme, công nghệ sản xuất các thiết bị có phẩn tử enzyme như biosensor (các thiết bị cảm biến sinh học)… để khai thác và sử dụng hiệu quả cần có kiến thức nhất định về enzyme

1.2 Danh pháp - Cấu tạo - Phân loại:

1.2.1 Danh pháp:

- Tên enzyme = tên cơ chất + ase

Ví dụ: enzyme thuỷ giải protein: protease, enzyme phân huỷ nucleic : nuclease…, enzyme tổng hợp DNA : DNA-polymerase

- Bên cạnh đó còn có những tên thông thường,ví dụ như ligase(enzyme

nối, trong quá trình tự sao DNA), amylase (enzyme thuỷ phân tinh bột,có trong dịch ruột)…

1.2.2 Cấu tạo:

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000

dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton)

Enzyme được cấu tạo từ các L – α – axitamin kết hợp với nhau bởi liên kết peptit Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L – α – axitamin

Trong nhiều truờng hợp ngoài axit amin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:

- Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein.

- Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành phần:

+ Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme.

+ Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của

monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme” (khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có tên riêng là coenzyme Phần agon quyết định kiểu phản ứng

mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính.

Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử Hiện nay người ta cũng đã xác định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúc bậc bốn Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ

enzyme bị giảm hoặc bị mất hoàn toàn Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của

enzyme được phục hồi.

1.2.3 Trung tâm hoạt động của enzym :

Trung tâm hoạt động : chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản

ứng, phần này gọi là trung tâm hoạt động, số trung tâm hoạt động có thể

lớn hơn 1.

1.2.4 Phân loại:

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hoá sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành 6 lớp, đánh số từ 1 đến 6 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp:

- Oxydoreductasa: các enzyme xúc tác cho pảhn ứng oxy hoá – khử, có nghĩa là chúng vận chuyển các nguyên tử Hydro hoặc điện tử của chúng từ cơ chất của chúng sang các phần tử nhận.

- Transpherasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

- Hydrolasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân

- Liasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nuớc, loại nuớc tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nuớc vào liên kết đôi.

- Izomerasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá.

- Ligasa: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng luợng ATP…, ligasa giúp cho sự tổng hợp nên Hydro carbon, protein và các đại phân tử khác.

2.1 Đơn vị họat tính là đơn vị để:

- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ enzyme xác định.

- Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với 1 nồng độ enzyme xác định.

-Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự

biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.

2.2 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme:

Phản ứng do enzyme có thể khái quát đơn giản hóa bằng phương trình

phản ứng:

Có thể xác định hoạt độ enzyme bằn gcách phân tích sự biến đổi theo

thời gian trong điều kiện phàn ứng xác định của: cơ chất còn lại; hoặc sản

phẩm tạo thành; hoặc cả cơ chất và sản phẩm Tùy theo đặc trưng của

phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp, yêu cầu về độ chính xác, điều kiện

của phòng thí nghiệm…mà chọn cách xác định phù hợp nhất

2.3 Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme:

Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme, cần sử dụng cơ chất và cofactor ở mức dư thừa (nếu enzyme cần cofactor) và thời gian xác định càng ngắn

càng tốt.

Cần phải chọn lựa các điê2u kiện sao cho có được sự biến đổi tuyến tính

giữa nồng độ enzyme, thời gian phản ứng và mức độ chuyển hóa cơ chất

(trong giới hạn nồng độ cơ chất đa lựa chọn) Một số enzyme bị ức chế bởi

cơ chất ở nồng độ quá cao; hoặc bị giảm hoạt độ nhanh chóng theo thời gian

ở nhiệt độ phân tích Do đó phản ứng phân tích nên thực hiện trong khoảng thời gian nhất định và nồng độ enzyme lẫn cơ chất thích hợp

2.4 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme:

•Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân

tích ở vùng thích hợp

•Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định,

nên phải dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó

Nồng độ đệm thường dùng là 20-50 nM Tuy vậy các phản ứng sinh acid, base cần phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá trình thí nghiệm

•Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp

xúc với nhau để bắt đầu phản ứng Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng phải duy trì như nhau Luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai sót.

• Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm

biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo; hay can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng dến hoạt tính enzyme :

2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Hoạt động của enzym lệ thuộc khá rõ vào nhiệt độ của môi

trường Ở nhiệt độ cao (> 70 - 800C) enzym bị tê liệt và phá huỷ do rối loạn về cấu trúc phân tử bậc 2, 3 làm hỏng trung tâm hoạt động được tạo nên từ các acid quan trọng và nhóm ghép Nếu tác động của nhiệt chưa thật sâu sắc thì enzym có khả năng khôi phục lại cấu trúc và do đó hoạt động xúc tác của enzym vẫn còn

- Nhưng nhiệt độ quá thấp (gần hoặc dưới O0C) hoạt động của

enzym yếu dần và hầu như dừng hẳn lại nhưng enzym không

bị phá huỷ.ứng dụng trong việc bảo quản thực phẩm dễ hỏng

ở tủ lạnh.

- Đa số các chất enzym ở động vật có hoạt độ cao nhất ở điều

kiện thân nhiệt (37 - 400C).sự tăng nhiệt độ ở giới hạn thích hợp (35 - 500C) Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym tức là kích thích quá trình trao đổi vật chất

2.5.2 Ảnh hưởng của pH Enzym rất nhạy cảm đối với phản ứng môi trường và mỗi enzym có

vùng pH hoạt động tết nhất riêng cho mình Sở d có ảnh hưởng của

độ pH đến hoạt độ của enzym là vì enzym có nguồn gốc protein nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu trao nên trung tâm hoạt động của enzym như OH, SH

Độ pH thích hợp của một số enzym thường gặp: Pepsin dịch vị 1,5 - 2,5

- Trypsin dịch tụy 7,8 - 9,5

- Amylase nước bọt 6,8 - 7,2

- Lipase dịch tụy 7,0 - 8,0

- Phosphatase huyết thanh 9,0 - 10,0

Trong nhiều trường hợp, khi pH thay đổi thì hướng xúc tác thuận

nghịch của enzym cũng bị đảo ngược.

2.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzym và cơ chất

* Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Đặc điểm chung của các chất xúc tác là với một lượng rất nhỏ, cũng có khả năng thực hiện phản ứng cho một lượng cơ chất lớn gấp nhiều lần.

Tuy nhiên tốc độ phản ứng cũng phụ thuộc vào cơ chất, nếu nồng độ đó thấp thì tốc độ enzym xúc tác chậm dần, nhưng nếu nâng nồng độ lên mãi thì đến một lúc tốc độ xúc tác thôi không tăng vì nó đã đạt được tối đa (Vmax) lúc này phản ứng lập hợp chất trung gian (ES) và giải phóng sản phẩm (ES → E + P) tiến hành nhanh nhất.

Người ta dùng hằng số Michaelis- Men ten để biểu diễn trạng thái phân ly của ES.

Hằng số Michaelis- Men ten Khi (molllit) là nồng độ cơ chất cần để một enzym tương ứng hoạt động với tốc độ bằng 1/2 tốc độ tối đa nói trên tức là: Vmax/2

* Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Nồng độ của enzym cũng có tác dụng quan trọng đối với tốc độ xúc tác Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym: V=k [E].

Trong đó: V là tốc độ phản ứng, [E] là nồng độ enzym

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn, tốc độ phản ứng tăng

chậm Theo qui định quốc tế, đơn vị enzym là số lượng enzym có khả năng xúc tác phản ứng biến đổi 1 micro-phân tử gam trong 1 phút ( 1 ~l -

mollphút) ở những điều kiện cụ thể cho trước như to , pH

2.6 Cơ chế hoạt động của enzyme trong phân tích thực phẩm:

Muốn cho phản ứng xảy ra thì enzyme phải gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Trung tâm hoạt

động của enzyme có nhóm hóa học đặc biệt trực tiếp tham gia vào cơ chế xúc tác Dưới tác dụng của enzyme, hoạt tính hóa học tăng lên rõ rệt và do

đó chỉ cần một năng lượng hoạt hóa nhỏ hơn nhiều cũng đủ làm cho phản ứng xảy ra tức thì để biến cơ chất thành sản phẩm Từ đó, ta xác định được lượng chất cần phân tích.

Tác dụng của enzyme khác những chất xúc tác khác là ở chỗ làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng làm tăng nhanh tốc độ phản ứng Một số yếu

tố dẫn đến sự hoạt hóa của enzyme trong phân tích thực phẩm:

- Enzyme có thể kết hợp với cơ chất theo một cách thức sao cho liên kết cảm thụ của cơ chất được tiếp cận với các nhóm hoạt động của enzyme và được định

hướng chính xác với các nhóm ấy Quá trình này có thể gây ra sự biến đổi cấu

trúc và quỹ đạo điện tử của cơ chất là cho phức hợp ES rơi vào trạng thái hoạt hóa.

-Một số enzyme có thể kết hợp với cơ chất bằng liên kết đồng hóa trị tạo ra một

hợp chất trung gian có hoạt tính cao nhờ vậy năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học sẽ giảm đi và cơ chất có thể dễ dàng tham gia phản ứng và tạo thành sản phẩm.

2.7 Phưong pháp xác định hoạt tính enzyme

2.7.1 Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản

phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết

bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt đây là mặt hạn chế của phương pháp Đồng thời, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó

thực hiện phân tích hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc.

2.7.2 Phân tích gián đoạn:

Một số phương pháp xác định:

• Phương pháp đo độ nhớt:

Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng

Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với

sản phẩm (chất có phân tử lớn như acid nucleic, protein,

cellulose…).

• Phương pháp phân cực kế:

Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng làm quay mặt

phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau.

• Phương pháp đo áp suất hay áp kế:

Dùng với các phản ứng enzyme có sự tiêu hao hay sinh khí, như các phản ứng oxy hóa, decarboxyl hoá, loại amin hóa Phản ứng

sinh hay tiêu hao khí có thể trực tiếp hay gián tiếp

• Phương pháp hóa học:

Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chất này Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành có thể đơn giản là sự đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp Tuy nhiên trong nhiều trường hợp,

có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn

• Phương pháp phóng xạ:

Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng vị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự phân rã) của cơ chất còn lại, hay sản phẩm tạo thành Thường áp dụng xác định hoạt độ các enzyme mà các phương pháp thông thường ko thể

đo được Có thể kết hợp phương pháp điện di với phương pháp phóng

xạ để xác định hoạt độ enzyme

• Phương pháp huỳnh quang:

Dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới tác dụng của một nguồn sang kích thích đặc trưng Mức độ phát huỳnh quang được đo nhờ máy huỳnh quang kế Đây cũng là phương pháp cho độ nhạy cao, cho phép phát hiện hoạt độ enzyme ở mức độ thấp

Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính định lượng nêu trên, nhiều trường hợp phân tích định tính hay bán định lượng cũng được sử dụng để nhanh chóng bước đầu xác định sự có mặt của enzyme Thường được dung hơn hết là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa đệm và cơ chất (tinh bột với amylase, casein với

protease…) sau đó nhuộm màu (iod nhuộm với tinh bột, xanh

coomassie hay amido đen với casein…) để phát hiện hay đánh giá hoạt

độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất.

MỘT SỐ ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME THƯỜNG DÙNG

Khả năng xúc tác của enzyme thông qua đơn vị hoạt độ của enzyme Vì vậy trong phân tích thực phẩm người ta dựa vào hoạt độ của enzyme để phân tích một số

thành phần trong thực phẩm Người ta biểu diễn hoạt độ của enzyme thông qua một số đơn vị sau:

a Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI):

1 UI = 1 µmol cơ chất (10 -6 mol/ phút)

Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị WI

d Hoạt độ riêng của phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi

1 enzyme trong một đơn vị thời gian.

e MWU (đơn vị Wohlgemuth cải tiến)

f SKB (đơn vị hoạt độ này do Sandstedt, Kneen, Blish đưa ra):

g GAU (đơn vị hoạt độ của glucoseamylase):

h NU (đơn vị Nothrop):

h NU (đơn vị Nothrop):