tối ưu hóa quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase

31 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase .... 35 Hình 3.1:Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình là

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên xin cám ơn trường đại học Nha Trang nói chung và khoa Chế Biến nói riêng đã truyền đạt những kiến thức và kĩ năng hữu ích trong suốt 4 năm qua để em hoàn thành chương trình đại học ngày hôm nay

Em xin gửi lời cám ơn tới TS Nguyễn Minh Trí đã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện đề tài

Cám ơn Ths Đặng Thu Hương, giáo viên chủ nhiệm lớp 49TP2, cô đã nhiệt tình giải đáp, hướng dẫn em khi thực hiện tính toán các số liệu, phương thức bố trí thí nghiệm trong quá trình thực hiện

Cám ơn cô Lê Thiên Sa, giáo viên phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm, luôn ủng hộ và giúp đỡ em trong quá trình thực hành ở phòng thí nghiệm

Cám ơn mẹ, gia đình, bạn bè đã ủng hộ và giúp đỡ để hoàn thiện được đề tài tốt nghiệp

MỤC LỤC

1.1 Giới thiệu chung về nho 3

1.1.1 Hình dạng, cấu tạo 3

1.1.2 Thành phần hóa học 5

1.1.2.1 Đường 6

1.1.2.2 Acid hữu cơ 6

1.1.2.3 Hợp chất phenol 7

1.1.2.4 Hợp chất nito 8

1.1.2.5 Hợp chất thơm 8

1.1.2.6 Chất khoáng 8

1.1.2.7 Hợp chất pectin 9

1.2 Tổng quan về enzyme 9

1.2.1 Đặc điểm của enzyme 9

1.2.2 Enzyme pectinase 13

1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase 13

1.2.2.2 Ứng dụng của enzyme pectinase 16

1.2.2.3 Những nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase làm trong dịch quả 25

1.3 Giới thiệu về phép thử cảm quan cho điểm 26

1.3.1 Giới thiệu về phép thử 26

1.3.2 Phương pháp tiến hành 27

1.3.3 Xử lý kết quả 27

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên liệu 28

2.1.1 Nho 28

2.1.2 Enzyme pectinase 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Quy trình 29

2.2.2 Xác định các thông số biên 30

2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nhiệt độ 30

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về thời gian 31

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nồng độ 31

2.2.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu phương pháp làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase 32

2.2.4 Đánh giá cảm quan khi sử dụng các phương pháp làm trong 33

2.2.4.1 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp lọc 34

2.2.4.2 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp ly tâm 34

2.2.4.3 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp sử dụng enzyme pectinase 35

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN … 36

3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm trong dịch nho sử dụng enzyme pectinase 36

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong 36

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ trong quá trình làm trong 38

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong quá trình làm trong 40

3.2 Xử lý kết quả quá trình tối ưu hóa theo phương pháp thực nghiệm 41

3.3 Kết quả đánh giá cảm quan của các phương pháp làm trong dịch nho ép 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

Kết luận 54

Đề xuất ý kiến 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Phụ lục 1 62

Phụ lục 2 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nho Phan Rang 3

Hình 1.2 Cấu tạo nho 5

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng của Pectinesterase và Polygalacturonase 16

Hình 1.4 Quy trình sản xuất nước táo ép 18

Hình 1.5 Quy trình sản xuất rượu vang 22

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm 29

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinas 30

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinase 31

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase 31

Hình 2.5 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp lọc 34

Hình 2.6 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp ly tâm34 Hình 2.7 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp sử dụng enzyme 35

Hình 3.1:Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase 37

Hình 3.2 : Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đối với độ đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase 39

Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ đối với độ đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinase 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nho Phan Rang 5

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm quy hoạch tối ưu hóa quá trình làm trong bằng enzyme pectinase 32

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm tâm 33

Bảng 3.1: Số liệu tương ứng giữa độ đục với nhiệt độ khi làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase 36

Bảng 3.2: Số liệu tương ứng giữa độ đục và thời gian trong quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase 38

Bảng 3.3: Số liệu tương ứng giữa nồng độ và độ đục trong quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase 40

Bảng 3.4: Kết quả bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm 41

Bảng 3.5: Hệ số bj 42

Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm tâm 42

Bảng 3.7: Kết quả tính Sbj 43

Bảng 3.8: Kết quả tính tj 43

Bảng 3.9: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher 44

Bảng 3.10: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa 45

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá của cảm quan viên về độ trong và màu sắc theo phương pháp cho điểm 46

Bảng 3.12: Bảng phân tích phương sai 48

Bảng 3.13: Bảng số điểm trung bình của các mẫu sắp xếp theo chiều giảm dần 49

Bảng 3.14: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm 50

Bảng 3.15: Xử lý kết quả 50

Bảng 3.16: Bảng phân tích phương sai 51

Bảng 3.17: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm 51Bảng 3.18: Xử lý kết quả 52Bảng 3.19: Bảng phân tích phương sai 52

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng 300 loại nước giải khát các loại, mỗi loại đều đánh vào những thị hiếu khác nhau như giải nhiệt, đẹp da, giảm béo, chữa bệnh Trước đây thị trường nước giải khát ở nước ta đa phần là sản phẩm nước uống có gas, rất ít những sản phẩm chiết xuất từ trái cây và không có gas Nhưng mấy năm gần đây do xu hướng người tiêu dùng ưa chuộng các sản phẩm nước không gas nên doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã mạnh dạn đầu tư dây chuyền mới để tung ra hàng loạt sản phẩm theo nhu cầu của khách hàng Kết quả bán hàng năm 2004-2005 của Công ty nước giải khát hàng đầu Việt Nam Bidrico cho thấy, gần 50% người tiêu dùng thành phố đang chuyển sang các loại nước uống có chứa vitamine, ít ngọt, mùi vị tự nhiên

Năm 2010 các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng trên mức 20% so với năm 2009: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh; Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas Các nhà nhập khẩu cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tác dụng thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao

Nhờ ưu thế là một nước nhiệt đới có nhiều loại trái cây đa dạng, hiện nay nước giải khát sản xuất từ trái cây đang được nhiều doanh nghiệp Việt Nam quan tâm khai thác Theo công bố nhu cầu tiêu thụ nước giải khát không gas, đặc biệt là

nước trái cây tại Việt Nam tăng rất mạnh, đạt gần 30%/năm

Nắm bắt được xu hướng đó, việc tính nghiên cứu phát triển sản phẩm mới và nâng cao chất lượng nước trái cây được đẩy mạnh ở từng doanh nghiệp thực phẩm Thường trong các công đoạn sản xuất nước quả có sử dụng các enzyme để nâng cao chất lượng và hiệu suất sản xuất Ứng dụng của các enzyme đã được chứng minh tính hiệu quả cao từ lâu Những enzyme thường được sử dụng như amylase, protease, pectinase… ứng dụng khá nhiều, đặc biệt là pectinase trong công nghệ chế

biến nước giải khát Vì thế việc sử dụng enzyme trong ngành công nghệ giải khát

là cần thiết để nâng cao chất lượng sản phẩm

Trong lĩnh vực thức uống, enzyme pectinase có tác dụng là một chất làm trong dịch quả nhằm tránh tình trạng sản phẩm bị phân tầng trong thời gian bảo quản Những nghiên cứu về enzyme pectinase cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ 30-60oC với thời gian ủ 60-120 phút và ứng dụng với dịch chuối nhiệt độ tối ưu là 43,2oC với thời gian ủ 80 phút [69], dịch sapoche ở nhiệt độ tối ưu

là 40oC, thời gian ủ 120 phút [28] Trong luận văn này tôi nghiên cứu sâu hơn quá trình lọc trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase để tìm ra nhiệt độ, thời gian ủ và nồng độ tối ưu

Mục tiêu đề tài

Mục tiêu của đề tài nhằm xác định các thông số về nồng độ enzyme pectinase nhiệt độ ủ, thời gian xử lý trong quá trình làm trong dịch nho ép

Nội dung nghiên cứu của đề tài

 Xác định các thông số trong quá trình làm trong dịch nho ép

- Xác định khoảng nghiên cứu của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ enzyme pectinase

- Tối ưu hóa các thông số của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ enzyme pectinase trong quá trình làm trong dịch nho

 So sánh chất lượng cảm quan của dịch nho ép giữa các phương pháp làm trong khác nhau

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về nho

Nho là nguyên liệu thô quan trọng để làm rượu và dịch quả vì thế khi hiểu rõ tính chất vật lý và thành phần hóa học sẽ cải thiện tốt hơn chất lượng sản phẩm

Hình 1.1 Nho Phan Rang

Nguồn: http://vi.wikipedia.org

1.1.1 Hình dạng, cấu tạo

Nho là loại quả mọng, mọc thành chùm trên các cây dạng dây leo thân gỗ, sinh trưởng lớn hơn 2 năm và rụng lá theo mùa Nho khi chín có thể được sử dụng trực tiếp hoặc dùng làm mứt, nước ép, thạch, dấm, rượu, chiết xuất dịch từ hạt, nho khô, mật đường và chiết xuất dầu từ hạt Nho thường được sử dụng nhiều trong sản phẩm có chứa nhiều đường Nó có hình dạng cầu và elips đặc trưng

Các phần chính trong quả nho là vỏ, thịt và hạt

Vỏ nho

Nho có lớp vỏ mỏng được xem như là lớp vỏ ngoài bao xung quanh trái, gồm

có 6-10 lớp tế bào, nó được bao phủ bởi láp sáp gọi là cutin Không giống như các loại thực vật khác, cấu trúc của vỏ nho rất ít các lỗ khí Vì thế hàm lượng nước muốn thoát ra phải qua lớp sáp cutin và thường thì tốc độ thoát hơi nước rất chậm

Dưới lớp vỏ mỏng bên ngoài thì nho còn một lớp mỏng gọi là lớp dưới da gồm các tế bào hình dạng phẳng Những tế bào này có xu hướng tạo ra hợp chất

phenol nồng độ cao khi nho chín, đây cũng là hợp chất ảnh hưởng tới mùi, vị, màu sắc của nho đồng thời các yếu tố cảm quan của sản phẩm từ nho như nước ép, rượu vang

Thành phần chính của lớp vỏ: yếu tố tạo màu, tannin, hợp chất thơm, kiềm

Kích thước thịt quả thường được quyết định bởi số lượng và kích thước của các tế bào bên trong

Tế bào thịt quả chứa nhiều khoảng không bào lớn bên trong có dịch hoặc chất dinh dưỡng Khi nho bị dập, những tế bào trong thịt quả thường bị phá vỡ và làm thoát dịch ra ngoài

Hạt nho

Hạt nho thường có lớp vỏ bao ngoài, nội nhũ, phôi, thường khi mới phát triển, nội nhũ sẽ là nguồn dinh dưỡng để nuôi phôi của hạt Kích thước của nho cũng bị ảnh hưởng bởi số hạt có bên trong nó Vỏ hạt cũng chứa hàm lượng tannin cao, cũng như hợp chất phenol Tuy nhiên hợp chất phenol này giảm dần khi nho chín và phenol thì thường tạo vị đắng chát nếu sử dụng hạt nho

Hình 1.2 Cấu tạo nho

Nguồn: http://wikipedia.org/grape

1.1.2 Thành phần hóa học

Nho tươi chứa 70-80% lượng nước và nhiều chất hòa tan khác bên trong Những chất hòa tan này bao gồm cả chất hữu cơ và vô cơ Một số chất quan trọng như:

Pectin (g/l)

Tro (%) Nito

(g/l)

1.1.2.1 Đường

Trong nho, đường chiếm một phần lớn trong hàm lượng chất tan Glucose và fructose là 2 đường chính ở trong dịch ép Hàm lượng đường trong nho chín có thế đạt từ 100-150g/l dịch ép Đối với nho chưa chín thì hàm lượng glucose chiếm nhiều hơn Khi nho bắt đầu chín thì tỉ lệ glucose và fructose hiện diện ngang nhau, còn nho chín quá thì hàm lượng fructose vượt quá glucose nhiều lần Fructose, glucose và sucrose có độ ngọt khác nhau, sắp xếp theo thứ tự tăng dần theo độ ngọt thì : fructose, sucrose, glucose Nếu tính theo tỉ lệ fructose là 100 thì sucrose là 84

và glucose là 66 Đây là một yếu tố quan trọng đối với nhà sản xuất rượu hoặc nước giải khát Ví dụ nếu nhà sản xuất mong muốn nước giải khát có vị ngọt cao thì họ sẽ cần nhiều sucrose hơn fructose để đạt tới điểm cảm quan mong muốn

Glucose và fructose là những loại đường có thể lên men Trong suốt quá trình lên men, nấm men sẽ chuyển hóa đường thành rượu và CO2 Hàm lượng alcohol sản sinh ra có liên quan tới hàm lượng đường ban đầu trong dịch ép, vì thế để khống chế hàm lượng alcohol trong dịch thì nên khống chế hàm lượng đường ban đầu Có thể tham khảo thêm công thức giữa lượng đường và alcohol trong rượu:

o Brix x 0,55 = % alcohol trong rượu

Hàm lượng đường trong dịch nho ép thường được biểu hiện thông qua độ Brix Đơn vị Brix được biểu hiện cho hàm lượng đường có trong 100gram dịch ép, tuy nhiên thông thường thì có thể quy đổi thành hàm lượng đường có trong 100ml dịch ép Thông số này có thể được đo bằng thiết bị khúc xạ kế Hàm lượng đường cũng có thể đo bằng tỷ trọng kế sau đó chuyển đổi qua độ Brix

1.1.2.2 Acid hữu cơ

Cũng như hàm lượng đường thì acid hữu cơ cũng đóng vai trò quan trọng trong dịch ép và rượu nho Nó đóng vai trò tạo vị chua và ảnh hưởng tới các tính chất ổn định, màu sắc và pH trong rượu Các acid quan trọng được tìm thấy trong nho là: tartaric, malic và citric Nhiều acid hữu cơ khác như amino acid cũng được thấy tuy nhiên acid tartaric và malic đã chiếm trên 90% tổng acid có trong nho Ở

giai đoạn đầu phát triển thì hàm lượng acid trong nho tăng dần tuy nhiên khi nho càng chin, hàm lượng đường càng nhiều thì hàm lượng acid lại giảm Nhìn chung acid malic giảm nhiều nhát vì thế khi nho trưởng thành thì lượng acid tartaric chiếm nhiều hơn acid malic

Nho là một trong những trái cây chứa nhiều acid tartaric và muối của nó Bitartrate là một hợp chất quan trọng ảnh hưởng tới pH và sự ổn định ở nhiệt độ thấp của rượu

Thành phần acid trong nho bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như giống loài, điều kiện địa lý, phương thức trồng trọt… Nồng độ acid ở khí hậu ấm thấp hơn so với khí hậu lạnh

Hàm lượng acid có thể đo bằng đơn vị TA, đây là thông số quan trọng dùng

để đánh giá chất lượng của dịch ép và rượu

1.1.2.3 Hợp chất phenol

Hợp chất phenol là nhóm chất có cấu trúc đa dạng và đóng vai trò quan trọng trong tạo màu và vị của rượu Nhóm chức này cũng góp phần vào phản ứng hóa nâu trong nho và rượu

Hợp chất phenol có nhiều trong hạt và vỏ của nho, dịch ép chỉ chứa lượng nhỏ từ 3-5% trên tổng số Rượu nho trắng ít bị ảnh hưởng bởi vì đã bỏ xác trong quá trình lên men nên hàm lượng phenol thấp, chỉ từ 100-250mg/l đối với acid gallic (GAE) Rượu nho đỏ thì khi lên men có cả hạt và vỏ nên hàm lượng phenol cao hơn, tùy theo thời gian mà hàm lượng ừ 1000-3500mg/l GAE

Hai chất chính trong hợp chất phenol là anthocyanins và tannins Anthocyanin là yếu tố màu quyết định màu của nho là đỏ hay tím Ở nho đỏ chưa chín thì anthocyanins ở dạng tự do, chưa liên kết, đến khi nho chin thì chất này mới liên kết với các chất khác trong nhóm phenol Ở trạng thái liên kết thì chất màu này góp phần vào sự ổn định cho rượu vang đỏ Tannin là loại hợp chất phức tạp có phân tử lượng lớn trên 500 Nó có thể màu vàng, nâu hoặc đỏ và có vị chát Trong suốt quá trình chế biến và làm chin rượu thì tannin bị polyme hóa nên sẽ làm tăng kích thước

phân tử Khi nho dần chín thì cấu trúc của thành phần hợp chất tannin thay đổi, vì thế nho bớt đắng, ngon và thơm hơn

1.1.2.4 Hợp chất nito

Nho chứa nhiều hợp chất nito như ammonium cation và hợp chất nito hữu cơ như amino acid, peptide, protein Hàm lượng hợp chất nito phụ thuộc vào giống nho, khí hậu, thổ nhưỡng, phân bón và kỹ thuật canh tác Tổng lượng nito tăng dần khi nho sinh trưởng

Lượng nito chứa trong hợp chất rất quan trọng bởi vì nó là nguồn dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn lactic sinh trưởng Nito ảnh hưởng tới sự tạo thành sinh khối của vi khuẩn và nấm, tỉ lệ lên men, các yếu tố cảm quan khác Protein (hợp chất nito) có tác dụng tạo sự ổn định trong rượu Nếu thiếu hàm lượng nito thì sẽ làm giảm sự lên men và có thể tạo nên hợp chất H2S có mùi trứng thối Để hạn chế vấn đề này thì nên bổ sung DAP (Diammonium phosphate) vào dịch nho trước khi lên men Tỉ lệ lớn nhất DAP cho phép bổ sung là 958,7mg/L hoặc 8lbs/1000 gal

1.1.2.6 Chất khoáng

Chất khoáng có trong nho là được hấp thụ từ nguồn đất nơi trồng và thường chiếm từ 02-0,6% trọng lượng nho tươi Những chất khoáng quan trọng như: kali, natri, sắt, phosphate, sulfate và chlorie trong những chất trên thì kali là quan trọng nhất, chiếm từ 50-70% cation của dịch Trong quá trình chín, hàm lượng kali trong

nho tăng lên, và nó chuyển dần sang trạng thái kali bitartrate nên làm giảm lượng acid và tăng pH của dịch

1.1.2.7 Hợp chất pectin

Hợp chất pectin chứa nhiều trong thành tế bào, đây là loại polysaccharide phức tạp được tạo thành từ các phân tử galacturonic liên kết với nhau Trong quá trình chín thì pectin bị thủy phân tự nhiên từ các enzyme pectolytic Ở trong dịch ép thì pectin gây nên hiện tượng đục và tạo phân tầng Để khắc phục vấn đề này thì nhiều phương pháp sử dụng enzyme thương mại được áp dụng

1.2 Tổng quan về enzyme

1.2.1 Đặc điểm của enzyme

Khái niệm chung và đặc tính của enzyme

Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Người ta đã khám phá rằng các enzyme đã có xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa, tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cần đối theo những chiều hướng xác định Như vậy enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường

xuyên giữa cở thể sống và môi trường bên ngoài

Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn lần

so với các chất vô cơ và hữu cơ khác

Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường, pH môi trường gần với pH sinh lý, enzyme có khả năng lựa chọn cao đối với các phản ứng mà nó xúc tác, cũng như đối với chất mà nó tác dụng

Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme

 Bản chất của enzyme

Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ tính chất như một protein thông thường

Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein

Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng của yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao,enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác

 Cấu trúc của enzyme

Enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác được chia thành hai loại sau :

o Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản) : trong thành phần phân tử chỉ

có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân

o Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp) : trong thành phần cấu tạo của

nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme) những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận chuyển

Trung tâm hoạt động cua phân tử enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau Ở enzyme một cấu tử thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như (-SH, -OH, -COOH ) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra các trung tâm này còn có sự tham gia của các ion kim loại

Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lí do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi

 Cơ chế tác dụng của enzyme

Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau :

E+S  ES  P+E

o Trong giai đoạn thứ nhất : enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

o Trong giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất

và nồng độ các chất phản ứng, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme

 Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo quy luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định Đa số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trông nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần

Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp Ngoài ra còn phụ thuộc vào nồng

độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ

 Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường Mỗi enzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme

Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau

 pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme

- pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất

 Ảnh hưởng của thời gian : trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để Mặt khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu

 Ảnh hưởng của nồng độ muối : muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt động của

vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân Mặt khác, muối ăn còn điều vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme

 Ảnh hưởng của ion kim loại : một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt của

sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này

 Ảnh hưởng của chất kìm hãm : chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc chấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme Có hai loại chất kìm hãm :

Kìm hãm cạnh tranh : là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác Kìm hãm không cạnh tranh : là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác

 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp

Hoạt hóa không gián tiếp : làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme

Hoạt hóa gián tiếp : chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng

có lợi cho hoạt động xúc tác

1.2.2 Enzyme pectinase

1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase

Enzyme pectinolytic có nhiều trong thực vật và vi sinh vật [74] Đây là yếu

tố quan trọng trong thực vật mà có thể củng cố thành tế bào [70] và giúp làm mềm các mô tế bào trong quá trình chín và bảo quản [61,5] Enzyme này cũng là nhân tố góp phần vào việc cân bằng môi trường khi phân hủy và tái chế các phần thừa thực vật [34]

Vi sinh vật sản sinh pectinase cũng được nghiên ngứu nhiều trong những năm gần đây [36] Các nghiên cứu về enzyme pectinase từ vi khuẩn [15,14,12], nấm men [13,56] và nấm [21,56] Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm hiện tại của pectinase

được chiết xuất từ nguồn nấm [65] Aspergillus niger được xem là loại nấm phổ

biến nhất để sản xuất hệ enzyme pectinase công nghiệp [50,26]

Hợp chất pectinase được phân loại [61] [52] như sau:

o Protopectinase: chuyển hóa hợp chất protopectin không tan thành pectin hòa tan

o Esterases: cắt và ngăn quá trình ester hóa của hợp chất pectin bằng cách cắt các nhóm methoxyl ester

o Depolymerases: cắt và thủy phân mạch α-(1-4)-glycosidic của acid galacturonic trong hợp chất pectin

D-Phản ứng de-polyme trên hợp chất pectin có 2 cơ chế khác nhau, thủy phân

và cắt các mạch của pectin có sự tham gia của nước và oxy hoặc là cắt bộ khung pectin nhưng không có sự hiện diện của các phân tử nước [6,16] Depolymerase có thể chia thành 4 loại khác nhau, phụ thuộc vào hợp chất enzyme nền là gì, cơ chế chung đều là cắt các mạch glycosis [57]

Polygalacturonase và polymethylgalacturonase cắt các mạch pectate và pectin, chủ yếu là dùng cơ chế thủy phân Tuy nhiên, polygalacturonate lyase và polymethylgalacturonate lyase cắt các mặc pectate và pectin bằng loại trừ nhóm β Phụ thuộc vào yếu tố phản ứng, ngẫu nhiên hay có mục đích thì enzyme được chia thành enzyme nội bào hay enzyme ngoại bào [27] Polygalacturonase (PGases) là hệ enzyme pectinolytic cắt các mạch acid polygalacturonic cùng với sự tham gia của nước và oxy Có nhiều nghiên cứu sâu về các loại enzyme trong hệ này Hệ enzyme PGases thủy phân hợp chất pectin gồm có endo-PGase (E.C.3.2.1.15) và exo-Pgases (E.C.3.2.1.67) PGases có những ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm

Endo-PGases có nhiều trong nấm, vi khuẩn và nấm men [42] Nó được tìm

thấy nhiều trong loại giun tròn kí sinh [63], hay nhiều loài như Aureobasidium

pullulans [64], Rhizoctonia solani Kuhn [48], Fusarium moniliforme [19], Neurospora crassa [55], Rhizopus stolonife [47], Asppergillus sp.[49], Thermomyces lanuginosus [40], Peacilomyces clavisporus [66] Endo-PGases

thường được tìm thấy trên nhiều loài vi sinh vật Tuy nhiên, exo-PGases ít thấy hơn

Các loài vi sinh vật được nghiên cứu như Erwinia carotovora [52], Agrobacterium

tumefacinens [58], Bacteroides thetaiotamicron [67], E.chrysanthemi [39], Alternaria mali [57], Fusarium oxysporum [44], Ralstonia solanacearum [31], Bacillus sp [39]

Exo-PGases có thể phân thành 2 nhóm : nhóm nấm exo-PGase sản sinh acid monogalacturonic và nhóm vi khuẩn exo-PGase sản sinh acid digalacturonic như là nhóm chất chính [63]

Pectinesterase: Pectinesterase (PE, Pectin pectlyhydrolase, E.C.3.1.1.11), thường được tham khảo như pectinmethylesterase, pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase và pectolipase, là acid cacboxylic esterase và thuộc vào nhóm enzyme thủy phân [72] Nó cắt các nhóm methyl ester của bộ khung galacturonan trong hợp chất pectin để giải phóng acid pectin và methanol [18]

PE thương mại có thể được dùng để bảo vệ hay cải thiện bề mặt, tính chắc của một số công đoạn chế biến trái cây và rau củ cũng như để chiết dịch hay làm trong dịch quả [22] PE thường được tìm thấy trong thực vật, vi khuẩn, nấm [30]

Vài nghiên cứu chỉ là một số vi khuẩn có enzyme này như Rhodotorula sp [68],

Phytophthora infestans [23], Erwinia chrysanthemi B341 [54], Saccharomyces

cerevisiae [24], Aspergillus niger [45,46], Lactobacillus lactis subsp Cremoris [35],

Penicillium frequentans [37], E.chrysanthemi 3604 [41], Penicillium occitanis [29], A.japonicus [64] PE trong thực vật như Carcica papaya [22,33, Lycopersicum esculentum [71], Prunus malus [45], Vitis ninifera [17], Citrus sp [10] Poutera sapota [9] và Malpighia glabra L [11]

Hình 1.1 Cơ chế phản ứng của Pectinesterase (a) và Polygalacturonase(b)

Dưới tác dụng của pectinase tính chất của dung dịch pectin thay đổi nhiều Pectinesterase tách gốc metyl khỏi phân tử pectin làm lộ các nhóm cacboxyl rất hoạt động, dễ kết hợp với các ion kim loại(ví dụ Ca2+) để tạo thành các muối không hòa tan, kết lắng lại và có thể tách dễ dàng Còn polygalacturonase phân hủy phân

tử pectin thành các đoạn mạch ngắn hơn, làm mất khả năng tạo del, làm giảm độ

nhớt của dung dịch, làm độ acid và hàm lượng các chất khử tăng lên

1.2.2.2 Ứng dụng của enzyme pectinase

Các enzyme pectic được sử dụng rộng rãi trong công nghệ nước quả và làm rượu thường cos nguồn gốc từ nấm mốc, đặc biệt là từ nấm Aspergillus niger Dịch quả được sản xuất trong công nghiệp bao gồm: Nước quả trong (táo, lê, nho ) , nước quả đục (chanh, mận, cà chua, nước dạng nectar), những sản phẩm dùng enzyme để thủy phân polysaccharide của lớp vỏ

Mục đích của việc sử dụng enzyme là khác nhau tùy vào loại dịch quả mong muốn

1.2.2.2.1 Nước quả trong

Trong trường hợp sản xuất nước quả trong, enzyme được thêm vào nhằm tăng lượng dịch thu được trong quá trình ép và làm trong dịch bằng cách làm lắng các

yếu tố gây đục Mục tiêu là thu được tối đa dịch quả và dịch quả không bị đục sau

ép táo sẽ có màu vàng nâu Mặc dù enzyme pectinase có thể cắt các mạch polymer

ở các nhóm ester pecin nhưng không phải chỉ sử dụng enzyme để làm trong mà còn kết hợp một số phương pháp khác nữa Sự kết hợp giữa pectinase và cellulose có thể tăng hiệu suất ép dịch lên tới 100% [7] Một yếu tố khác làm đục nữa là thành phần tinh bột, đối với táo chưa chín thì hàm lượng tinh bột chiếm tới 15% tổng thành phần

Có thể sử dụng thêm enzyme amylase (thường là amyloglucosidase) có thể hoạt động tốt ở pH của dịch táo và thêm cùng với enzyme pectinase

Ép dịch: Bước đầu tiên trước khi ép dịch là rửa, phân loại, làm dập bằng máy nghiền Mặc dù pectinase thường được thêm ở công đoạn này nhưng kết quả sẽ cao hơn nếu phần thịt quả được nghiền và giữ trong các thùng lớn từ 15-20 phút để các chất kìm hãm enzyme (polyphenols) bị oxi hóa bởi các enzyme polyphenol oxidase

có sẵn trong quả Vì polyphenol là một chất kìm hãm enzyme pectinase nên có thể

bổ sung enzyme polyphenol oxidase vào hoặc thêm chất polyvinyl pyrolidone (PVP) giúp oxi hóa hợp chất phenol từ đó tạo điều kiện cho sự hoạt động của enzyme pectinase [20]

Enzyme pectinase được sử dụng trong quá trình ép dịch táo nhằm tạo điều kiện cho quá trình được thực hiện dễ dàng hơn thu được nhiều dịch hơn, bên cạnh

đó enzyme cũng được sử dụng nhằm tạo kết tủa các chất lơ lửng, và hỗ trợ cho quá trình lắng cặn hoặc ly tâm Xử lý bằng enzyme với pectinase diễn ra từ 15 phút cho đến 2h tùy vào loại dịch ép và nồng độ của enzyme, thời gian, nhiệt độ [38] Trong suốt quá trình ủ, enzyme pectinase sẽ cắt các mạch của pectin hòa tan trong trong thịt quả vì pectin này có thể làm giảm chất lượng dịch ép Thứ nhất, những phân tử pectin có tính nhớt nằm trong dịch quả nên gây khó khăn trong quá trình ép dịch từ

thịt quả Thứ hai là pectin làm bít các đường thoát dịch ép từ trong thịt quả ra ngoài nên tỉ lệ dịch ép không cao[36] Bên cạnh đó nếu thịt quả không bị nghiền nhiều thì hiệu suất ép cũng không cao Xử lý enzyme sẽ đạt hiệu quả cao với táo chín và được bảo quản lạnh [60]

Hình 1.2 Quy trình sản xuất nước táo ép [25]

Làm trong dịch: Sự làm trong dịch quả bằng enzyme bị ảnh hưởng bởi các yếu tố nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ enzyme Dịch quả với pH thấp sẽ làm trong dễ dàng hơn là làm với pH cao cũng như nhiệt độ càng tăng thì hiệu quả cao hơn, miễn

là xử lý enzyme trong khoảng nhiệt độ 40-60oC [38] Nhìn chung thì thời gian xử lý

sẽ nghịch đảo với nồng độ enzyme trong khoảng nhiệt độ 5-50oC [36]

Nếu dịch quả muốn đục thì dịch nên được thanh trùng nhanh chóng sau khi

ép để bất hoạt các enzyme tự nhiên trong dịch nhằm tránh gây biến đổi xấu Sau đó

có thể ly tâm và loại bỏ các phần lơ lửng hay lắng cặn Đối với dịch quả trong thì các phần lắng cặn phải loại bỏ hoàn toàn Các enzyme thương mại được sử dụng kèm như pectinase, hemicellulase và cellilases được phép dùng [25] Những enzyme này có thể được cung cấp bởi Gist-brocades và được dùng với hàm lượng 200-600g/tấn táo nghiền với vận tốc 40-60 vòng/phút trong 3h ở nhiệt độ 50oC Dịch của táo sau khi nghiền được ly tâm

Một số nghiên cứu đưa ra phương pháp sử dụng enzyme PG hoặc PME mà không cần các enzyme khác trong táo Có nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sử dụng enzyme pectin lyase (PL) ở pH=3-4 có thể làm trong dịch táo Bên cạnh đó vì dịch táo chứa 91-91% ester pectin nên cũng dễ dàng lọc bởi PL Dịch táo trong có thể làm tăng thời gian bảo quản nếu bảo quản trong điều kiện lạnh

Lợi ích của việc sử dụng enzyme pectinase trong dịch táo: đa dạng hóa được sản phẩm như nước táo trong, nước táo đục từ đó tăng được giá trị của nguyên liệu tươi Trong sản xuất, thời gian ép dịch được rút ngắn hơn và đặc biệt xử lý bằng enzyme làm tăng tính ổn định và sản phẩm có mùi vị thơm ngon hơn khi loại bỏ bã

và tiết kiệm hơn về kinh tế (năng suất tăng, ít thiêt bị máy móc)

ép lê cũng tương tự như táo Lê được nghiền và bổ sung enzyme vào các bước với

hàm lượng 75g/tấn và giữ trong 30-60 phút ở nhiệt độ mong muốn [36] Enzyme pectinase PL, PME, PG và arabanase cải thiện hiệu suất và năng suất ép của dịch Sau khi ép, dịch được xử lý enzyme nhằm cắt mạch pectin bởi enzyme pectinase cũng với arabanases trong 1h ở nhiệt độ 45-50oC Dịch ép lê được phối chế, lọc rồi

cô đặc Lê có thế chế biến ở dạng pure hoặc nectar

Trái cây nectar là gồm phần thịt quả nghiền trộn với syrup và acid citric để sản xuất dạng nước giải khát Phần thịt quả này được pha loãng hoặc lấy dịch ép từ thịt quả Yếu tố quan trọng của loại nước giải khát này là các cấu tử lơ lửng phải ổn định, tránh phân tầng Sau khi phối trộn với nước, đường và acid, các cấu tử có xu hướng lặn xuống và thỉnh thoảng tạo gel Điều này làm giảm tính cảm quan của sản phẩm

Việc sử dụng enzyme bên ngoài có thể cải thiện sự ổn định của các cấu tử trong nectar Enzyme Rapidase LIQ+(GistBrocades), Pectines Ultra SP (Novo Nordisk) hay Rohapect TF (Rohm) đều có hoạt tính PG, PL cao cùng với kết hợp giữa celluloase và hemicellulase sẽ làm giảm độ nhớt, giữ các cấu tử ổn định và cải thiện khả năng cô đặc của sản phẩm

c Dịch nho ép và rượu

Nho là loại trái cây có hàm lượng lớn đường (200g/l), acid (10g/l acid tartaric), pectin (5-10g/l) nên khó khăn trong việc làm dập và ép (Kashyap 2001) Đối với nho đen, sau khi làm dập thì được gia nhiệt tới 60oC hoặc 80oC để làm mất màu của vỏ hoặc làm bất hoạt enzyme nội bào polyphenoloxidase Sau đó bổ sung enzyme như Cytolase PCL (Gist-Brocades) hoặc Ultrazyme (Novo Nordisk) khoảng 50g/tấn nho để làm tăng hiệu suất chế biến Dịch ép thoát ra được phân tách với các chất lơ lửng bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm Dịch sau khi lọc thì được làm lạnh tới nhiệt độ 0oC nhằm ngăn quá trình lên men Dịch này sẽ được bổ sung enzyme với nồng độ 200ppm trong 2 tuần nhằm cắt các mạch pecin Pectinase, chủ yếu là PG và hemicelluloses như arabinogalactanase sẽ làm các chất lơ lửng nhỏ kết hợp với nhau tạo các đám vẩn đục to hơn

Enzyme được sử dụng nhiều trong suốt quá trình làm rượu vang và nước giải khát từ nho như:

- Làm dập và chín nho

- Làm lắng và làm trong dịch nước nho trước khi làm rượu

- Sử dụng đối với dịch nho ở cuối quá trình lên men

Enzyme được bổ sung vào bằng nhiều phương pháp khác nhau Một số phương pháp thực tế như:

- Phun dịch enzyme lên nho

- Đưa dịch enzyme vào hệ thống bơm trực tiếp ở công đoạn nén

- Thêm dịch enzyme vào tank trước khi làm trong

Vì có nhiều đặc điểm riêng biệt nên enzyme giải phóng các phân tử đóng vai trò quan trọng trong cảm quan (màu sắc, mùi vị, cấu trúc) hay phá vỡ phân tử của các chất mà làm giảm hiệu quả quá trình xử lý kỹ thuật như nén, làm trong, lọc Xử

lý tốt quá trình lên men và sử dụng enzyme hiệu quả sẽ làm giảm sự có mặt của cinnamyl esterase

Sử dụng đồng thời bentonite và enzyme được khuyên nên tránh bởi enzyme

sẽ hạn chế sự hấp phụ của bentonite đồng thời chất này cũng kém hiệu quả vì một

số đặc tính của enzyme protein Xử lý bằng bentonite nên được thực hiện sau quá trình xử lý bằng enzyme Thêm bentonite sẽ giúp sự lơ lửng tốt hơn của các mạch pectin nhỏ bị thủy phân bởi enzyme

Hoạt tính và hiệu quả của enzyme khá đa dạng, thường phụ thuộc vào nhiệt

độ và pH Enzyme pectinase có thể được sử dụng trong dải nhiệt độ 10-55oC Dưới

10oC thì lượng enzyme cần dùng nên tăng lên, trên 55oC thì enzyme sẽ bị bất hoạt Enzyme không bị kìm hãm bởi sulfur dioxide (SO2) tại mức độ mà có thể chấp nhận trong sản xuất rượu Sự kìm hãm bởi polyphenol có thể xảy ra trong rượu vang đỏ Tăng hàm lượng enzyme có thể chống lại điều này Tỉ lệ cồn trên 14%(v/v) không ảnh hưởng xấu tới sự hoạt động của enzyme, thực tế là cồn chỉ ảnh hưởng tới β-glucanase sử dụng cho việc giải phóng hương thơm

Β-glucanases Hemicellulase

Rượu vang trắng

Rượu vang màu

Hình 1.3 Quy trình sản xuất rượu vang [25]

Tăng vốn hiểu biết về ảnh hưởng của enzyme đối với polysaccharide của thành tế bào nho như arabinans, galactans, arabinogalactan và arabinoxylans có thể

sẽ tối ưu hóa công dụng của enzyme trong sản xuất rượu

Từ lâu hoạt tính của enzyme bao gồm thủy phân hợp chất pectin như pectin esterase, polygalacturose, pectin lyase, rhamno-galacturonase, rhamnogalacturonan acetylesterase, arabinase và galactanase Sự kết hợp của các loại enzyme khác như cellulase hay hemicellulase làm thủy phân chưa một phần đồng thời hòa tan các acid

và các polysaccharide trung hòa hiện diện trong thành pectocellulos và ở trong phiến mỏng của thành tế bào vỏ nho Các thành phần này chịu trách nhiệm cho tính chất

cứng của loại quả mọng Kết quả của việc thủy phân sẽ làm thoát nước, hương và chất màu Những mảnh nhỏ của thành tế bào sẽ được hòa tan tạo thành các chất keo

Cơ chế của enzyme

Pectinase thủy phân một phần thành pecto-cellulose của tế bào thịt và việc này sẽ làm cho thành tế bào xuất hiện những lỗ như tổ ong Những thành tế bào này nhạy cảm với sự hoạt động của enzyme bởi vì thành tế bào mỏng và hàm lượng tannin thấp Enzyme đồng thời cũng phản ứng với tế bào trên lớp vỏ nhưng ít hơn bởi vì tế bào ở đây có thành dày hơn và hàm lượng tannin cao hơn Hàm lượng tannin có khả năng kìm hãm sự ảnh hưởng của enzyme

1.2.2.2.2 Nước quả đục

Enzyme pectin chứa hàm lượng enzyme polygalacturonase cao nên được bổ sung vào nước quả đục nhằm tạo tính ổn định cho sản phẩm, tránh gây hiện tượng phân tầng

gia nhiệt dịch ép tuy nhiên phương pháp này sẽ làm giá trị cảm quan của sản phẩm giảm Phương pháp lựa chọn thay thế khác là làm lạnh dịch ép vì thế sẽ làm enzyme bất hoạt nhưng chi phí giá thành sẽ cao hơn

Sử dụng enzyme trong quá trình ép cam có thể thể bổ sung ở 2 giai đoạn Giai đoạn đầu bổ sung 0,5-2g/100kg thịt cam ở nhiệt độ phòng, làm như vậy có thể giảm độ nhớt Giai đoạn thứ hai có thể bổ sung là trước khi hoàn thiện sản phẩm, bổ sung enzyme ở nhiệt độ phòng và để yên trong 30 phút Điều này sẽ giúp đường và các phân tử hòa tan thoát ra ngoài dế hơn và sẽ tăng được hiệu suất ép và cũng giảm được độ nhớt trong dịch Bên cạnh đó xử lý bằng enzyme cũng giúp sản phẩm có tính ổn định cao hơn, tuy nhiên enzyme cắt các mạch pectin để làm giảm độ nhớt thì không ảnh hưởng mạnh đến các phân tử pectin hòa tan nên có tính ổn định của các cấu tử lơ lửng được giữ vững Khi sử dụng thì được khuyến khích nên dùng loại enzyme pectinase có hoạt tính PME thấp nhất nhằm tránh việc làm trong dịch thịt quả enzyem được dùng nhiều là PL Bên cạnh khác, Rapidase Citrus 2000 (cung cấp bởi Gist-Brocades) cũng được dùng nhiểu nhằm làm giảm vị đắng trong thịt quả

và cải thiện tốt mùi vị của sản phẩm [36]

a Chanh

Phương pháp truyền thống để làm trong nước cốt chanh là dựa vào enzyme esterase có sẵn trong quả Vỏ và thịt quả sẽ được phân thành kích cỡ 3-5mm rồi trộn với nước, tỉ lệ 1:1, gia nhiệt tới 95oC để phá hủy PME trong chanh, sau làm lạnh xuống 50oC Hỗn hợp thu được sẽ có hàm lượng pectin, polysaccraride, glycoprotein, sáp, tinh dầu cao Sau đó được xử lý bởi enzyme pectinase và cellulases trong 1h thì hồn hợp sẽ được chiết dịch, ly tâm, cô đặc, thanh trùng rồi đóng chai là hoàn thiện sản phẩm

Hàm lượng tinh dầu chiếm phần lớn trong vỏ chanh, gồm có hydrocacbon (terpene và sesquiterpene), hợp chất chứa nhóm oxy (aldehyt, ester, alcohol, ketone, phenol), và hợp chất không bay hơi (sáp, flavonoid, acid béo) Sau khi ép dịch, thành phần hỗn hợp của xác và hỗn hợp dầu-nước bị tách ra Hỗn hợp này sẽ đi qau

cyclone cát và được đi ly tâm nhằm thu được hỗn hợp nhiều tinh dầu hơn sau đó được đem đi làm sạch Dầu này sẽ được cô đặc tới 60-80% rồi loại bỏ nước trong thành phần, và đem đi bảo quản lạnh nhằm làm giảm lượng sáp bên trong

Enzyme có thể cải thiện thời gian của quá trình, hiệu suất thu hồi tinh dầu cao hơn và chất lượng cảu sản phẩm đạt yêu cầu

b Xoài

Xoài được chế biến theo dạng pure hoặc nectar, nước ép hoặc dạng hỗn hợp Dạng nectar thường chứa 20-30% pure , pH khoảng 3,5 và độ acid 0,2-0,3% Enzyme ngoại bào được sử dụng nhằm tăng nồng độ của pure xoài hoặc đề sản xuất nước ép trong Pectinase, hemicellulase và cellulose sử dụng nhằm phân tách thịt quả Xử lý enzyme với hỗn hợp thịt quả nhằm tăng hiệu suất 80% tích ép thu hồi

c Ổi

Ổi có thể sử dụng trực tiếp hoặc làm nước ép, nectar, pure, mứt, hay thạch Pure ổi có thể dùng làm nectar, nước ép, syrup mứt hay thạch Thịt quả được xử lý bằng enzyme ngoại bào nhằm cải thiện hiệu suất ép

Vỏ ổi có 2 loại cellulose chính là parenchyma và tế bào dạng đá Tế bào như

đá chứa nhiều lignin và khó bị xử lý bởi enzyme pectinase Khi kết hợp giữa các loại enzyme như pectinase, arabanase, hemicellulase, tannase và cellulose nhằm lọc trong dịch ổi ép tốt hơn

1.2.2.3 Những nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase làm trong dịch quả

Nghiên cứu làm trong dịch chuối bằng enzyme pectinase của W.C.Lee [68] đăng trên tạp chí Food Engineering 73 (55-63) sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm bề mặt cho kết quả sử dụng enzyme Pectinex Ultra SP-L của công ty Novo Nordisk Ferment ở nồng độ 0,084%, thời gian ủ là 43,2oC trong 80 phút Dịch chuối sau khi ép thì có độ đục, độ nhớt cao và màu xám Khi xử lý dịch chuối với enzyme thì sẽ ảnh hưởng tới khả năng lọc, độ trong, độ đục và độ nhớt của dịch ép chứng

minh bởi giá trị R2 ≥0,9 Các phân tích thống kê cũng cho thấy khả năng lọc, độ trong, độ nhớt, độ đục đạt giá trị có ý nghĩa (p<0,05) liên quan đến nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ ủ Theo nghiên cứu nồng độ enzyme ảnh hưởng nhiều nhất tới quá trình làm trong (p<0,01) Nếu tăng thời gian hay nồng độ enzyme thì sẽ làm tăng khả năng lọc và độ trong cũng như giảm độ nhớt và độ đục

Nghiên cứu khác về làm trong dịch sapoche sử dụng enzyme thương mại của H.N.Sin (2006) đăng trên tạp chí Food Engineering với kết quả sử dụng enzyme ở nồng độ 0,1% ở nhiệt độ 40oC và trong 120 phút Dịch ép sapoche được xử lý bằng enzyme với thời gian ủ khác nhau (30-120 phút), nhiệt độ (30-50oC) và nồng độ enzyme (0,03-0,1%) Ba yếu tố này được sử dụng như là các biến độc lập và những ảnh hưởng của nó đối với độ đục, độ trong, độ nhớt và màu sắc được kiểm định bởi giá trị R2>0,8

1.3 Giới thiệu về phép thử cảm quan cho điểm

1.3.1 Giới thiệu về phép thử

Trong thực tế nhiều khi người ta muốn so sánh nhiều mẫu với nhau về nhiều tính chất cảm quan ở các mức độ khác nhau Phép thử cho điểm thường dùng để xác định xem mức độ khác nhau về một tính chất cảm quan nào đó giữa hai hay nhiều sản phẩm là bao nhiêu

Trong phép thử này người thử sẽ nhận được đồng thời tất cả sản phẩm đánh giá Những người này thường là những chuyên gia cảm quan, đã có thời gian dài huấn luyện và làm việc trong lĩnh vực này Sau khi nếm thử, người thử sẽ đánh giá cường độ của tính chất cảm quan của mỗi sản phẩm thông qua một điểm số tương ứng với một thuật ngữ mô tả cường của độ tính chất ấy đã được quy định sẵn Thang điểm thường dùng trong phép thử này là thang điểm 6 Thang điểm hay thuật ngữ mô tả cường độ là do người điều hành thí nghiệm lựa chọn, tuy nhiên cần tránh những thuật ngữ không rõ nghĩa

1.3.2 Phương pháp tiến hành

Để đảm bảo cho chất lượng của phép thử người ta lập phiếu chuẩn bị thí nghiệm Trên phiếu cũng gồm các nội dung như trật tự trình bày mẫu cho mỗi người thử và cho mỗi lần cặp, các bộ mã số ngẫu nhiên dùng cho các mẫu, bảng ghi lại kết quả cho điểm của người thử…

Trên phiếu trả lời của phép thử này ngoài phần giới thiệu của nội dung phép thử thì cần ghi lại thang điểm sử dụng với những thuật ngữ mô tả cấp độ của tính chất cần

so sánh

1.3.3 Xử lý kết quả

Trường hợp có 3 mẫu trở lên người ta thường dùng phương pháp phân tích phương sai ANOVA (Analysis of Variance) Phương pháp giúp tính được chuẩn F để kiểm định xem liệu ba mẫu có khác nhau không? Nếu có ta sẽ dùng chuẩn tiếp

nhau không

Chuẩn F là tương quan giữa phương sai tính riêng cho từng yếu tố (mẫu hay người thử) so với phương sai sai số của từng thực nghiệm Nếu giá trị F tính được lớn hơn hoặc bằng giá trị Ftc ở một mức ý nghĩa nào đó thì sự khác nhau về yếu tố

đó được coi là có nghĩa ở mức ý nghĩa đó

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nho

Các thí nghiệm được tiến hành trên nho tươi Phan Rang được mua ở chợ Đầm (Nha Trang-Khánh Hòa) Nho không bị dập nát quá, vỏ có màu đỏ tím, không chín nhũn Nho sau khi mua về được bỏ cuống, rửa sạch, để ráo

Nồng độ đường trong nho đạt 10oBrix và dịch nho ép có pH = 3

2.1.2 Enzyme pectinase

Sử dụng enzyme Pectinex® Ultra SP-L của công ty Novozymes (Thụy Điển)

 Đặc điểm của enzyme:

 Enzyme công bố: polygalacturonase, hoạt độ 3800PGNU/ml

 Màu sắc: Nâu

 Chất ổn định : Glycerol, Potassium chloride

 Chất bảo quản: Không

 Mùi : Mùi hương lên men nhẹ

 Tính tan: Có khả năng tan trong nước với mọi nồng độ khác nhau tại điều kiện thường

 Được tách chiết từ: Aspergillus aculeatus

 Phương pháp: Sản xuất enzyme bằng phương pháp lên men kị khí với hệ

vi sinh vật Protein của enzyme được tách chiết và làm tinh từ sản phẩm

vi sinh đó

 Enzyme được khuyến nghị bảo quản ở nhiệt độ 0-10oC (32-50oF) và sử dụng tốt nhất trong vòng 18 tháng từ ngày sản xuất

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Pectin có độ nhớt cao làm khó khăn cho việc lắng lọc hoặc pectin kết hợp với các chất khác gây tủa Vì thế sử dụng enzyme pectinase thủy phân pectin sẽ làm cho dịch ép nho trong

Các thao tác làm cẩn thận, thời gian chặt chẽ, mỗi thí nghiệm tiến hành nhiều lần nhằm đạt kết quả chính xác cao

2.2.2 Xác định các thông số biên

Enzyme pectinase thủy phân pectin ở dịch nho, tạo điều kiện cho dịch ép có

độ trong tốt hơn, không bị phân tầng, chất lượng cải thiện hơn

Trong phạm vi đề tài chỉ xác định đến các thông số nhiệt độ ủ, thời gian xử

lý, nồng độ enzyme đối với quá trình làm trong Các yếu tố nhiệt độ, thời gian có liên quan mật thiết với nhau nên bố trí thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm Để tiến hành bố trí thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm thì cần các thông số biên

2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nhiệt độ

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình lọc trong

dịch nho bằng enzyme pectinas

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về thời gian

Dịch nho Nồng độ Enzyme 0,1%v/v Nhiệt độ 40 độ C

Đánh giá Thời gian

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đối với quá trình lọc trong

dịch nho bằng enzyme pectinase

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nồng độ

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với quá trình làm

trong dịch nho bằng enzyme pectinase

2.2.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu phương pháp làm trong dịch nho ép bằng

 Yếu tố thời gian trong khoảng 20-100 phút

 Yếu tố nhiệt độ trong khoảng 30-60oC

 Yếu tố nồng độ Enzyme pectinase 0,01-0,1%v/v

2.2.4 Đánh giá cảm quan khi sử dụng các phương pháp làm trong

Dịch nho ép được làm trong theo các phương pháp khác nhau rồi đem

đi đánh giá cảm quan theo phương pháp chấm điểm

N0 U1 (phút) U2(nhiệt độ) U3(nồng độ) Y

2.2.4.1 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp lọc

Hình 2.5 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp lọc

Thí nghiệm được tiến hành sau khi ép nho và đem đi lọc qua giấy lọc thông thường rồi tiến hành đánh giá cảm quan

2.2.4.2 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp ly tâm

Hình 2.6 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp ly tâm

Nho được ép dịch sau đó đi ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút ở thời gian 10 phút rồi tiến hành đánh giá cảm quan