Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzyme aspergillius niger và ứng dụng trong xử lý hạt cacao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ HẠT CACAO GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH: NGUYỄN THỊ CẨM NHUNG LÊ THỊ LÂM TRÚC SKL009133 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8/2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116194 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ HẠT CACAO GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH MSSV NGUYỄN THỊ CẨM NHUNG 18116194 LÊ THỊ LÂM TRÚC 18116220 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116194 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ HẠT CACAO GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH MSSV NGUYỄN THỊ CẨM NHUNG 18116194 LÊ THỊ LÂM TRÚC 18116220 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 ii iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzyme pectinase từ nấm mốc Aspergillus niger ứng dụng xử lý hạt cacao” kết trình cố gắng học tập làm việc không ngừng chúng tôi, động viên khích lệ từ q thầy cơ, gia đình bạn bè Vì vậy, chúng tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cá nhân tổ chức tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ chúng tơi suốt q trình thực nghiên cứu Chúng tơi xin tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến thầy ThS Nguyễn Quang Duy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, ln lắng nghe ý kiến cho phản hồi tỉ mỉ thời gian nhanh giúp giải vấn đề gặp phải, để hồn thành khóa luận cách trọn vẹn Chúng xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, khoa Cơng nghệ Hóa học Thực phẩm, mơn Cơng nghệ Thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi học tập thực khóa luận tốt nghiệp Chúng xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm tận tình giảng dạy, trang bị cho chúng tơi kiến thức tảng quý báu suốt năm học vừa qua Chúng xin chân thành cảm ơn bậc sinh thành động viên ủng hộ, tạo cho chúng tơi nguồn động lực to lớn để vượt qua khó khăn hồn thách Chúng xin cảm ơn anh chị, bạn bè, tất cá nhân tổ chức quan tâm giúp đỡ q trình thực khóa luận tốt nghiệp Trong q trình thực khóa luận cố gắng kiến thức cịn hạn chế nên khơng thể trách khỏi thiếu sót, chưa hồn thiện Chính mà mong nhận thông cảm góp ý từ q thầy để chúng tơi sửa chữa, hồn thiện khóa luận tốt nghiệp cách tốt Chúng xin chân thành cảm ơn iv LỜI CAM ĐOAN v PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN vi vii PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN viii ix Orapin Bhumibhamon, cộng sự, (1997), Cocoa Fermentation : Effect of Enzyme Pectinase on Natural Cocoa Fermentation, Kasetsart Journal – Natural Science 31(2): 206–211 Osborne, D J (2004) Advances in Pectin and Pectinase Research In F Voragen, H Schols, & R Visser, Annals of Botany (Vol 94 (3), pp 479 – 80) The Netherlands: Kluwer Academic Publishers Pahlevi A de Souza, Lunian F Moreira, Diógenes H.A Sarmento, Franciscleudo B da Costa, (2018), Cacao — Theobroma cacao Exotic Fruits, 69–76 Palaniyappan, M., Vijayagopal, V., Viswanathan, R., & Viruthagiri, T (2009) Screening of natural substrates and optimization of operating variables on the production of pectinase by submerged fermentation using Aspergillus niger MTCC 281 Afr J Biotechnol., 8, 682 – 686 Panasenko, V (1967) Ecology of microfungi, The Botanical Review, 189–215 Panesar, P., & Marwaha, S (2014) Biotechnology in Agriculture and Foodprocessing: Opportunities and challenges CRC Press, 226 Pariza, M.W., Johnson, E.A., (2001), Evaluating the safety of microbial enzyme preparations used in food processing: Update for a new century, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 173–186 Patil, N., & Chaudhari, B (2010) Production and purification of pectinase by soil isolate Penicillium spp and search for better agro–residue for its SSF Recent Res Sci Technol., 2, 36 – 42 Patil, S., & Dayanand , A (2006) Production of pectinase from deseeded sunflower head by Aspergillus niger in submerged and solid–state conditions Bioresource Technology, 97(16), 2054 – 2058 Pedrolli, D., Monteiro, A., Gomes, E., & Carmona, E (2009) Pectin and pectinases: production, characterization and industrial application of microbial pectinolytic Enzymes Open Biotechnol J, 3, – 18 Phutela, U., cộng sự, (2005), Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels, Braz J Microbiol, 36(1), 63–69 57 Pires, J.L., (2003) Avaliacão quantitativa e molecular de germoplasma para o melhoramento cacaueiro com ênfase na produtividade, qualidade de frutos e resistência a doencas Tese Doutorado Universidade Federal de Vicosa, Vicosa, MG, 220 Pitt, J.I., (1981), Food spoilage and biodeterioration, in Cole G T and Kendrick B, Biology of Conidial Fungi, Vol 2, New York, Academic Press, 111–142 Powis, T.G., A Cyphers, et al., (2011), Cacao use and the San Lorenzo Olmec Proc Natl Acad Sci USA, 595–600 (2011) Rahardjo Y.P., cộng (2022), A literature review on cocoa fermentation techniques to shorten fermentation time, IOP Conf Ser.: Earth Environ Sc 974 Roelofsen, P.A., (1985), Fermentation, drying, and storage of cocoa beans, Adv Food Res Int, 225–296 Rosane, F.S., W Alan, (2010), The microbiology of cocoa fermentation and its role in chocolate quality Crit Rev Food Sci Nutr, 205–221 Rusconi, M., Conti, A., (2010), Theobroma cacao L., the Food of the Gods: A scientific approach beyond myths and claims, Pharmacological Research, 5–13 Samson, R V Visagie, C.M., Houbraken, J., Hong, S.B., Hubka, V., Klaassen, C.H.W., Perrone, G., Seifert, K.A., Susca, A., Tanney, J.B., Varga, J., Kocsube, S., Szigeti, G., Yaguchi, T., Frisvad, J.C., (2014), Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus, Stud Mycol 78, 141–173 Sandhu, S K., Oberoi, H S., Dhaliwal, S S., Babbar, N., Kaur, U., Nanda, D., Kumar, D., (2012), Ethanol production from Kinnow mandarin (Citrus reticulata) peels via simultaneous saccharification and fermentation using crude enzyme produced by Aspergillus oryzae and the thermotolerant Pichia kudriavzevii strain Ann Microbiol, 62, 655 – 666 Schuster, E., N Dunn–Coleman, J Frisvad, P van Dijck, (2002), On the safety of Aspergillus niger – a review, Applied Microbiology and Biotechnology, 426–435 Semenova, M., Sinitsyna, O., Morozova, V., & et al (2006) Use of a preparation from fungal pectin lyase in the food industry Appl Biochem Microbiol, 42, 598 – 602 Snowdon, A., (1990), A Colour Atlas of Post–harvest Diseases and Disorders of Fruits and Vegetables 1, General Introduction and Fruits, London, Wolfe Scientific Snowdon, A., (1991), A Colour Atlas of Post–harvest Diseases and Disorders of Fruits and Vegetables 2, Vegetables, London, Wolfe Scientific 58 Sudeep, K v (2020) Production, Characterization, and Industrial Application of Pectinase Enzyme Isolated from Fungal Strains, 6(2), 59 Vibha sharma, cộng sự, (2014), Effect of temperature on commercially applicable Pectinase enzyme derived from Strain improved Aspergillus Niger using Agro– industrial waste by solid state fermentation process, Research Journal of Science & IT Management, Vol 04(1) Vicken, J., Schols, H., & Oomen, R (2003) If homogalacturonan were a side chain of rhamnogalacturonan I: implications for cell wall architecture Plant Physiol, 132, 1781 – Wang, D., Lin, H., Kan, J., Liu, L., Zeng, X., & Shen, S (2012) Food chemistry Nova Science, 40 – 46 Willats, W., Knox, P., & Mikkelsen, J (2006) Pectin: new insights into an old polymer are starting to gel Trends Food Sci Technol, 17, 97 – 104 Wollgast, J., Anklam, E., (2000), Review on polyphenols in Theobroma cacao: changes in composition during the manufacture of chocolate and methodology for identification and quantification Food Research International, 423–447 Yadav, S., Yadav, P., Yadav, D., & Yadav, K (2009) Purification and characterization of pectin lyase producted by Aspergillus terricola suitable for retting of natural fibers Appl Biochem Biotechnol, 159, 270 – 283 59 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Nồng độ galacturonic acid độ hấp thu dung dịch chuẩn bước sóng 575 nm Ống Nồng độ galacturonic acid (mg/mL) Độ hấp thu 0,00 0,1 0,06 0,2 0,15 0,3 0,26 0,4 0,31 0,5 0,38 0,6 0,46 0,7 0,54 0,8 0,65 PHỤ LỤC B Đường chuẩn galacturonic Đường chuẩn galacturonic 0.70 0.65 0.60 0.54 Độ hấp thu (OD) 0.50 0.46 0.40 0.38 0.31 0.30 y = 0.7953x - 0.0063 R² = 0.9956 0.26 0.20 0.15 0.10 0.06 0.00 0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ galacturonic (mg/mL) 60 0.7 0.8 0.9 PHỤ LỤC C Một số hình ảnh trình làm nghiên cứu PHỤ LỤC C.1 Enzyme thô sau lọc PHỤ LỤC C.2 Cacao lên men tủ ủ lắc 61 PHỤ LỤC C.3 Hạt cacao sau lên men: (1) Mẫu không bổ sung enzyme; (2) Mẫu bổ sung enzyme (2) (1) PHỤ LỤC C.4 (1) Hạt cacao sau sấy ; (2) Hạt cacao sau xay nhuyễn (1) (2) 62 PHỤ LỤC D Kết xử lý thống kê SPSS nghiên cứu khảo sát điều kiện sinh tổng hợp enzyme pectinase PHỤ LỤC D.1 Kết xử lý thống kê SPSS mật độ tế bào hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme (U/mL) Mật độ tế bào Subset for alpha = 0,05 N 103 4,83 107 4,92 104 106 105 Sig 4,92 5,01 5,59 6,02 0,06 0,06 1,00 1,00 PHỤ LỤC D.2 Hoạt độ enzyme mật độ tế bào 103, 104, 105, 106, 107 Mật độ tế bào Hoạt độ enzyme (U/mL) 103 4,83 ± 0,77a 104 5,01 ± 1,29b 105 6,02 ± 0,62d 106 5,59 ± 1,16c 107 4,92 ± 0,77ab * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 63 PHỤ LỤC D.3 Kết xử lý thống kê SPSS nồng độ pectin hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme (U/mL) Nồng độ pectin (%) Subset for alpha = 0,05 N 0,5 2,5 2,0 2,0 1,5 Sig 5,81 6,73 7,12 7,77 9,09 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC D.4 Hoạt độ enzyme nồng độ pectin (%) 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 Nồng độ pectin (%) Hoạt độ enzyme (U/mL) 0,5 5,81 ± 0,64a 1,0 7,77 ± 0,48d 1,5 9,09 ± 0,71e 2,0 7,12 ± 0,52c 2,5 6,73 ± 0,56b * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 64 PHỤ LỤC D.5 Kết xử lý thống kê SPSS nồng độ chất hòa tan (oBrix) hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme (U/mL) Nồng độ chất hòa tan Subset for alpha = 0,05 N (oBrix) 5,0 6,0 9,0 7,0 8,0 Sig 6,09 8,16 8,93 10,73 12,78 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC D.4 Hoạt độ enzyme nồng độ chất hòa tan 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 Nồng độ chất hòa tan (oBrix) Hoạt độ enzyme (U/mL) 5,0 6,09 ± 0,61a 6,0 8,16 ± 0,46b 7,0 10,73 ± 0,35d 8,0 12,78 ± 0,51e 9,0 8,93 ± 0,71c * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 65 PHỤ LỤC D.6 Kết xử lý thống kê SPSS độ pH hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme (U/mL) Độ pH Subset for alpha = 0,05 N 4,0 6,0 5,5 4,5 5,0 Sig 7,08 7,77 9,84 10,64 13,92 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC D.7 Hoạt độ enzyme độ pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 Độ pH Hoạt độ enzyme (U/mL) 4,0 7,08 ± 0,92a 4,5 10,64 ± 1,22d 5,0 13,92 ± 0,27e 5,5 9,84 ± 0,76c 6,0 7,77 ± 1,27b * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 66 PHỤ LỤC D.8 Kết xử lý thống kê SPSS thời gian lên men hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme (U/mL) Thời gian lên men Subset for alpha = 0,05 N (Giờ) 24 120 48 96 72 Sig, 9,91 11,38 11,61 12,82 14,10 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC D.9 Hoạt độ enzyme thời gian lên men (Giờ) 24, 48, 72, 96, 120 Thời gian lên men (Giờ) Hoạt độ enzyme (U/mL) 24 9,91 ± 0,34a 48 11,61 ± 0,56c 72 14,10 ± 0,53e 96 12,82 ± 0,77d 120 11,38 ± 0,33b * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 67 PHỤ LỤC E Kết xử lý thống kê SPSS xử lý cacao chế phẩm enzyme pectinase PHỤ LỤC E.1 Kết xử lý thống kê SPSS hàm lượng chất trích ly tỷ lệ enzyme Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) Tỷ lệ enzyme (%) Subset for alpha = 0,05 N 3 3 2,55 2,79 2,82 3,06 3,28 Sig 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC E.2 Hoạt độ enzyme thời gian lên men (Giờ) 24, 48, 72, 96, 120 Tỷ lệ enzyme (%) Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) 2,82 ± 0,19c 2,79 ± 0,11b 3,28 ± 0,14e 3,06 ± 0,15d 2,55 ± 0,17a * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 68 PHỤ LỤC E.3 Kết xử lý thống kê SPSS hàm lượng chất trích ly nhiệt độ lên men Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) Nhiệt độ (oC) Subset for alpha = 0,05 N 70 30 60 40 50 Sig 2,97 3,07 3,25 3,29 3,42 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC E.4 Hoạt độ enzyme thời gian lên men (Giờ) 24, 48, 72, 96, 120 Nhiệt độ (oC) Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) 30 3,07 ± 0,08b 40 3,29 ± 0,08d 50 3,42 ± 0,16e 60 3,25 ± 0,20c 70 2,96± 0,20a * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 69 PHỤ LỤC E.6 Kết xử lý thống kê SPSS hàm lượng chất trích ly thời gian lên men Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) Thời gian lên men Subset for alpha = 0,05 N (Giờ) 24 120 96 48 72 Sig 3,04 3,14 3,40 3,45 3,77 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHỤ LỤC E.7 Hoạt độ enzyme thời gian lên men (Giờ) 24, 48, 72, 96, 120 Thời gian lên men (Giờ) Hàm lượng chất trích ly hịa tan (oBrix) 24 3,04 ± 0,16a 48 3,44 ± 0,10d 72 3,77 ± 0,16e 96 3,40 ± 0,21c 120 3,14 ± 0,07b * Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3) * Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 70 S K L 0