Luận án tiến sĩ sinh học sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHÍNH PGS.TS ĐÁI THỊ XUÂN TRANG 2021 LỜI CẢM TẠ Với tất lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đái Thị Xuân Trang, PGS.TS Nguyễn Minh Chơn PGS.TS Nguyễn Trọng Tuân dành thời gian quý báu, hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án Xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Đức Độ, TS Nguyễn Lộc Hiền, TS Huỳnh Kỳ, PGS.TS Nguyễn Thị Thu Nga Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học giúp đỡ, chia sẻ khó khăn, khuyến khích động viên tơi Xin cảm ơn tất bạn em phịng thí nghiệm Sinh - Hóa, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu & Phát triển Cơng nghệ Sinh học; phịng thí nghiệm Hóa Sinh; phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi động viên tơi suốt q trình thực đề tài Kính gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Tự nhiên, Khoa Sau Đại học phòng ban khác Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo tiến sĩ Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc đến đồng nghiệp, gia đình người thân dành cho tơi tất tình u khuyến khích, ủng hộ để tơi có đủ nghị lực hồn thành luận án Xin trân trọng cảm ơn tất i TÓM TẮT Giới thiệu: Tăng acid uric không nguyên nhân gây bệnh gout, mà làm tăng nguy mắc bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường hội chứng chuyển hóa Acid uric tạo enzyme xanthine oxidase (XO) xúc tác trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine oxy hố xanthine thành acid uric Việc tìm thảo dược hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng ức chế enzyme XO đồng thời không gây tác dụng phụ vấn đề cần thiết Mục tiêu: (1) Phân lập enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương; (2) đánh giá khả ức chế enzyme XO cao chiết thảo dược; (3) phân lập số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; (4) đánh giá ảnh hưởng cao chiết thảo dược tiềm lên nồng độ acid uric máu chuột thực nghiệm Phương pháp thực hiện: Phân lập enzyme XO thực theo phương pháp kết tủa enzyme ammonium sulfate Khả ức chế enzyme XO cao chiết thảo dược khảo sát phương pháp đo quang phổ bước sóng 290 nm có khơng có mẫu thử Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược thực theo phương pháp chạy sắc ký cột hở Đánh giá ảnh hưởng cao chiết thảo dược tiềm lên nồng độ acid uric máu chuột thực nghiệm thực phương pháp đưa cao chiết vào thể chuột qua đường uống, sau đo nồng độ acid uric máu chuột Chuột làm tăng acid uric máu phương pháp tiêm kali oxonate vào màng bụng Kết cho thấy, enzyme XO phân lập từ sữa bị có hàm lượng protein 0,509 mg/mg enzyme thô, enzyme sau phân lập có hoạt tính hoạt tính riêng 0,2095 U/mg enzyme thô 0,412 U/mg protein Điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme XO phân lập xác định pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO 0,15 mM xanthine Hiệu ức chế allopurinol hoạt tính enzyme XO phân lập enzyme thương mại tương đương Cao ethanol nở ngày, húng chanh, dền gai ức chế enzyme XO yếu Nồng độ ức chế 50% (IC50) enzyme XO cao ethanol sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất cỏ xước 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 17,5±0,1 µg/mL Chất đối chứng allopurinol có IC50 9,24±0,275 µg/mL Năm hợp chất phân lập từ cao ethanol cỏ xước Trong đó, hai hợp chất khơng có hoạt tính ức chế enzyme XO Ba hợp chất cịn lại định danh quercetin, quercitrin hesperetin có tác dụng ức chế enzyme XO với IC50 ii 14,6; 37,7 103,2 µg/mL Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp Cao ethanol cỏ xước khơng có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric máu chuột bình thường, làm giảm đáng kể nồng độ acid uric máu chuột bệnh (186±2,1; 129,4±15,2 128,7±31,9 µmol/L) làm giảm hoạt tính enzyme XO gan chuột tăng acid uric (2,62±0,084; 1,79±0,127 1,87±0,075 mM acid uric /phút/g protein) tương ứng với liều 150; 300 450 mg/kg Nồng độ acid uric máu hoạt tính enzyme XO gan chuột bình thường 127,3±38,4 µmol/L 3,11±0,033 mM acid uric/phút/g protein Allopurinol có tác dụng làm hạ acid uric máu chuột bình thường chuột bị tăng acid uric Kết luận: Từ kết đạt cho thấy, cao ethanol cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO làm nồng độ acid uric máu chuột bị tăng acid uric xuống mức bình thường Cần có định hướng sử dụng cỏ xước phòng trị tăng acid uric máu Từ khóa: acid uric, cỏ xước, quercitrin, xanthine oxidase iii ABSTRACT Introduction: The elevation of uric acid levels might be the main cause of not only gout but also cardiovascular diseases, kidney stones, diabetes and metabolic disorder The formation of uric acid is often associated with the oxidation process catalyzed by xanthine oxidase enzyme (XO) in which hypoxanthine can be oxidized to xanthine and then uric acid The research and exploration of herbs and plant-related substances that perform a potential in inhibiting XO enzyme without causing any negative impacts are critical The purpose of this study is to (1) extract XO enzyme from local cow’s milk; (2) evaluate XO enzyme inhibitory efficiency of extracts from types of herbs; (3) extract a number of substances that are able to inhibit XO enzyme from potential herbs; (4) evaluate the effects of the extracts from potential herbs on serum-uric acid concentration of experimental mice Methods: The extraction of XO enzyme was conducted followed by method using ammonium sulfate in order to precipitate enzyme The inhibitory effect XO of the herbal was determined by spectroscopy at 290 nm The mixture reaction without sample was used as a blank control The extraction of substances functionalizing in the XO enzyme inhibition from herbs was performed using a column chromatography The investigation of impacts of extracts from potential herbs in serum-uric acid concentration was performed by giving mice extracts, and then measuring uric acid concentration in rat blood Rats had increased uric acid in the blood by injecting potassiumoxonate into the peritoneum Results: XO enzyme extracted from cow’s milk contains 0.509 mg/mg of raw enzyme The extracted enzyme activity and specific activity were calculated to be 0.2095 U/mg and 0.412 U/mg protein, respectively The optimal conditions for the activity of XO enzyme were determined at pH 7.5; 0.02 U/mL enzyme and 0.15 mM xanthine The inhibitory efficiency of allopurinol versus the activity of the extracted XO enzyme and commercial enzyme was approximate The ethanol extracts of Gomphrena globosa, Plectranthus amboinicus, Amaranthus spinosus showed a low efficiency in the inhibition of XO enzyme The half maximal inhibitory concentration (IC50) XO enzyme of ethanol extracts in terms of Mesona chinensis, Orthosiphon stamineus, Elsholtzia ciliata, Gomphrena celosiodes and Achyranthes aspera” were 222±2.65; 143±4.04; 138±1.73; 42.5±2.99 17.5 µg/mL, respectively The positive control allopurinol has the IC50 value of 9.24 µg/mL Five compounds from ethanol extract of Achyranthes aspera were isolated Among iv them, two compounds did not exhibit an XO enzyme inhibitory activity Three other compounds have been identified as quercetin, quercitrin and hesperetin indicated an effective activity in XO enzyme inhibition in which IC50 values are 14.6; 37.7 and 103.2 µg/mL, respectively Quercitrin compound inhibited XO enzyme according to mixed type Achyranthes aspera ethanol-extract did not cause a change in serum-uric acid concentration in normal mouse but significantly reduced the serum-uric acid concentration in mouse model for hyperuricemia (186±2.1; 129.4±15.2 128.7±31.9 µmol/L) and XO enzyme activity in increased-uric acid mouse liver corresponding to 150; 300 and 450 mg/kg treatments The uric acid concentration in blood and XO enzyme activity in normal mouse liver were 127.3±38.4 µmol/L and 3.11±0.033 mM acid uric /min/g protein, respectively The result illustrated that allopurinol had an effect on releasing serum-uric acid level in terms of either normal mouse or increased-uric acid mouse In conclusion, Achyranthes aspera ethanol extract efficiently induced an inhibition on XO enzyme and reduced the serum-uric acid concentration in increased-uric acid mouse to a normal threshold The use of Achyranthes aspera in preventing increased uric acid level in blood should be further investigated Keywords: Achyranthes aspera, uric acid, quercitrin, xanthine oxidase v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iv CAM KẾT KẾT QUẢ vi MỤC LỤC vii DANH SÁCH BẢNG .x DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .1 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 1.4.1 Thời gian nghiên cứu 1.4.2 Địa điểm nghiên cứu 1.5 Những đóng góp đề tài 1.6 Ý nghĩa luận án CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ảnh hưởng chất ức chế đến hoạt động enzyme 2.2 Enzyme xanthine oxidase (E.C 1.17.3.2) 2.2.1 Cấu trúc 2.2.2 Cơ chế hoạt động 11 2.2.3 Thông số động học enzyme xanthine oxidase 12 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme xanthine oxidase 12 2.2.5 Phân lập enzyme xanthine oxidase 14 2.3 Xanthine oxidase bệnh lý 14 2.3.1 Tăng acid uric máu gout 14 2.3.2 Tăng acid uric máu bệnh tim mạch, bệnh thận 15 2.4 Các phương pháp đánh giá khả ức chế enzyme xanthine oxidase 15 2.4.1 Các phương pháp đánh giá khả ức chế enzyme xanthine oxidase in vitro 15 2.4.1.1 Phương pháp đánh giá khả ức chế xanthine oxidase in vitro phương pháp quang phổ 15 2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò huỳnh quang 17 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng chất ức chế đến nồng độ acid uric thể động vật 17 2.5 Các nghiên cứu xác định số thảo dược có khả ức chế enzyme xanthine oxidase 18 2.5.1 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase giới 18 vii 2.5.2 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase Việt Nam 29 2.6 Tổng quan nguyên liệu nghiên cứu 31 2.6.1 Húng chanh 31 2.6.2 Kinh giới 32 2.6.3 Cây râu mèo 32 2.6.4 Cây sương sáo 33 2.6.5 Dền gai 34 2.6.6 Nở ngày 34 2.6.7 Nở ngày đất 35 2.6.8 Cỏ xước 36 2.7 Các kỹ thuật ly trích cao chiết 37 2.7.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 37 2.7.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (rắn – lỏng) 38 2.8 Các phương pháp phổ nghiệm xác định công thức phân tử hợp chất 38 2.8.1 Phổ hồng ngoại (IR) 38 2.8.2 Phổ tử ngoại – Khả kiến (UV-VIS) 39 2.8.3 Phổ khối lượng (MS) 39 2.8.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 39 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………… 45 3.1 Phương tiện nghiên cứu 41 3.1.1 Nguyên liệu 41 3.1.2 Hóa chất 41 3.2 Phương pháp nghiên cứu 41 3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase 42 3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò 43 3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan hỗn hợp enzyme XO trích theo phương pháp Folin-Lowry 45 3.2.1.3 Xác định diện enzyme xanthine oxidase sau phân lập phương pháp điện di SDS-PAGE 46 3.2.1.4 Xác định hoạt tính enzyme xanthine oxidase sau phân lập 47 3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích 48 3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng 48 3.2.1.7 So sánh hoạt tính enzyme xanthine oxidase phân lập từ sữa bò enzyme xanthine oxidase thương mại 49 3.2.2 Khảo sát khả ức chế enzyme xanthine oxidase loại thảo dược 50 3.2.2.1 Phương pháp trích cao dung môi ethanol 70% 50 3.2.2.2 Khảo sát khả ức chế enzyme xanthine oxidase cao tổng ethanol chiết từ loại thảo dược 51 3.2.2.3 IC50 cách xác định 52 3.2.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase53 3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả ức chế enzyme xanthine oxidase cao phân đoạn chiết từ thảo dược tiềm 53 3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập chất từ cao phân đoạn ethyl acetate 54 viii Phụ lục 2.16: Phổ 13C-NMR giãn rộng CXQ05 Phụ lục 2.17: Phổ DEPT CXQ05 Phụ lục 2.18: Phổ HSQC CXQ05 Phụ lục 2.19: Phổ HSQC giãn rộng CXQ05 Phụ lục 2.20: Phổ HSQC giãn rộng CXQ05 Phụ lục 2.21: Phổ HMBC CXQ05 Phụ lục 2.22: Phổ HMBC giãn rộng CXQ05 Phụ lục 2.23: Phổ HMBC giãn rộng CXQ05 Phụ lục 3: Hình ảnh số trang thiết bị sử dụng Phụ Hình 3.1: Máy đo quang phổ UV-VIS V-730 Jasco Phụ Hình 3.2: Máy quang phổ UV-VIS 96 giếng Thermo Scientific Phụ Hình 3.3: Máy ly tâm lạnh Phụ Hình 3.4: Thiết bị điện di Phụ Hình 3.5: Cột sắc ký Phụ lục 4: Một số dung dịch sử dụng việc xác định hàm lượng protein - Dung dịch albumin huyết bò (BSA) 1mg/mL dung dịch NaCl 0,9% - Dung dịch A: Na2CO3 2% NaOH 0,1N - Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% kali natri tartrate 1% - Dung dịch C: Pha dung dịch A B theo tỉ lệ thể tích 50:1 trước dùng - Thuốc thử Folin Phụ lục 5: Một số hình ảnh thí nghiệm chuột Phụ Hình 5.1: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng cao ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric máu chuột Phụ Hình 5.2: Cách cho chuột uống dung dịch cao chiết ethanol cỏ xước Phụ Hình 5.3: Tiêm dung dịch kali oxonate qua màng bụng chuột Phụ Hình 5.4: Lấy máu từ tim chuột Phụ Hình 5.5: Cách lấy gan chuột