Luận văn nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Thái Nguyên – năm 2020 m ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HỐ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: 48-CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Người hướng dẫn: PGS.TS Dương Văn Cường ThS Vũ Hoài Nam Thái Nguyên – năm 2020 m i LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp ngồi cố gắng thân, nhận giúp đỡ, bảo, hướng dẫn động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn: Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS.Dương Văn Cường người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Hoài Nam cán bộ, anh chị làm việc Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ln động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Sinh Viên Nguyễn Phi Cường m ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục hóa chất sử dụng đề tài 15 Bảng 3.2: Danh mục trang thiết bị sử dụng đề tài 16 Bảng 4.1: Kết nồng độ DNA sau đo quang phổ 28 m iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư giới ước tính năm 2018 Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi Hình 2.5: Q trình methyl hóa DNA 10 Hình 3.2.2.1: Kết tách DNA phương pháp Campos cộng 23 Hình 3.2.2.2: Kết tách DNA phương pháp sử dụng KIT 23 Hình 3.2.2.3: Kết tách DNA phương pháp NAOH 2N 24 Hình 3.2.2.4: Kết tách DNA phương pháp lysis buffer 25 Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 31 Hình 4.6 Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 32 Hình 4.7 Vị trí kích thước gene AGRN 32 Hình 4.8 Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN 33 m iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxirybonucleic Acid PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Axit CRC : Colorectal Cancer (Ung thư đại trực tràng) SNP : Sequence Number PDU Kb : Kilo base – Kilo bazo nito Ng : Nanogam m v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Ung thư đại trực tràng 2.1.1 Khái niệm ung thư đại trực tràng 2.1.2.Cơ chế gây ung thư 2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng giới 2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng Việt Nam 2.2 Methyl hóa ung thư đại trực tràng 2.2.1 Methyl hóa DNA 2.2.3 Bất thường methyl hóa DNA ung thư đại trực tràng 11 2.3 Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa biến đổi bisulfite 11 2.4 Giới thiệu kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu cao Illumina Infinium 450K 12 2.5 Nghiên cứu nước quốc tế 13 2.5.1 Một số nghiên cứu nước liên quan gene FLI gene AGRN 13 m vi 2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan gene FLI 13 2.5.4 Nghiên cứu quốc tế gene AGRN 14 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.1.Vật liệu 15 3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm 15 3.1.2.Mẫu bệnh phẩm 16 3.1.3.Trang thiết bị 16 3.2.Phương pháp 16 3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde 17 3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết 23 3.2.3.Giới thiệu phương pháp biến đổi bisulfite conversion 25 3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa 26 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 Kết 28 4.1.Kết đo hàm lượng DNA 28 4.1.1.Phương pháp campos cộng 28 4.1.2.Sử dụng KIT 28 4.1.3.Phương pháp NaOH 2N 29 4.1.4.Phương pháp Lysis buffer 29 4.2 Phân tích in silico thiết kế mồi 31 4.4.1 Gene FLI 31 4.4.2 Gene AGRN 32 4.4.3 Kết thiết kế mồi 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 m PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng dạng ung thư hàng đầu giới Việt Nam Trong chế phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng, methyl hóa DNA chế có ảnh hưởng lớn Các nghiên cứu methyl hóa DNA đa phần thực quần thể người Châu Âu người Châu Mỹ, hay nói cách khác người da trắng phần người da đen Các nghiên cứu quần thể người da vàng hạn chế mặt số lượng DNA methylation chế epigenetics chế không giống chế di truyền, chế epigenetics có khác biệt yếu tố môi trường Yếu tố môi trường rộng, bao gồm yếu tố chủng tộc, chế độ ăn uống, chế độ sinh hoạt,… Trong năm đầu cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm ung thư đại trực tràng Cơ chế epigenetics chế cần thiết cho phát triển bình thường trì mẫu biểu gen đặc hiệu mơ động vật có vú Sự gián đoạn trình biểu sinh dẫn đến thay đổi chức gen biến đổi tế bào ác tính.[1] Ở người, methyl hóa DNA vấn đề quan tâm nghiên cứu chuyên sâu Trong tế bào bình thường, đảm bảo điều hịa biểu gen làm gen ổn định Quá trình methyl hóa DNA có liên quan đến thay đổi histone tương tác thay đổi biểu sinh, thay đổi quan trọng để điều chỉnh hoạt động gen cách thay đổi cấu trúc chromatin Q trình methyl hóa bị hạn chế dư lượng cytosine chủ yếu gặp dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường viết tắt CpGine) Dinucleotide toàn bộ m gen, xuất với độ dài tăng dần khoảng 0,3 kb khoảng 40% gen người có chứa đảo CpG vùng promoter Việc bổ sung cộng hóa trị nhóm methyl thường xảy cytosine dinucleotide CpG tập trung thành cụm lớn gọi đảo CpG [2] Việc phát ung thư đại trực tràng xem điều cần thiết, để phát sớm không dễ dàng Đặc điểm khối u phát sinh kích thước cịn nhỏ, sau khối u tăng kích thước bám vào thành ruột chưa đâm thủng thành ruột Khi dai đoạn này, tỷ lệ sống sót người mắc bệnh 90% Khối u tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng thành ruột chưa di căn, tỷ lệ sống sót người mắc bệnh lúc giảm cịn 70% Bản thân người mắc ung thư đại trực tràng họ thường biết triệu chứng ban đầu bệnh, tỷ lệ phát bệnh 39% Khi tế bào ung thư di đến vùng khác thể tỷ lệ phát bệnh 61%, lúc tỉ lệ sống sót người bênh cịn 12% phát q muộn Vì vậy, việc phát sớm bệnh tầm quan trọng thay đổi methyl hóa DNA khối u có ý nghĩa lớn người, tương lai methyl hóa phát triển thành số theo dõi phác đồ điều trị ung thư Xuất phát từ lý trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Tìm thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với tần số xuất cao đặc thù quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam m 25 3.2.2.4.Kết phương pháp 4: phương pháp lysis buffer M L U L U Hình 3.2.2.4: Kết tách DNA phương pháp lysis buffer Phương pháp tham khảo thử nghiệm từ phương pháp tách chiết DNA thực vật, không liên quan kết thực tế cho thấy nồng độ DNA đạt yêu cầu, hình ảnh điện di tốt phương pháp lại, độ tinh chưa đạt yêu cầu 3.2.3.Giới thiệu phương pháp biến đổi bisulfite conversion Phương pháp lấy biến đổi bisulfite, phương pháp gồm bước sau: Bước Thêm 130μl CT conversion Reagent vào 20μl mẫu DNA (đã có) vào ống PCR Bước Đặt ống mẫu vào máy PCR thực bước: 98°C 10 phút 64°C 2,5 4°C tối đa 20 Bước Thêm 600μl M – Binding Buffer vào cột IC Zymo – SpinTM đặt cột vào ống thu thập cấp sẵn Bước Lấy mẫu (từ bước 2) cho vào cột IC Zymo - SpinTM có chứa M – binding Buffer Đóng nắp chộn cách đảo ngược nhẹ tay nhiều lần m 26 Bước Ly tâm 10.000 vòng 30 giây, sau loại bỏ dịch chảy qua màng Bước Thêm 100μl M – Wash Buffer vào cột, sau ly tâm 10.000 vòng 30 giây Bước Thêm 200μl đệm M – Desulphonation Bufer vào cột để nhiệt độ phòng (20 - 30°C) 15 – 20 phút Sau ly tâm 10.000 vịng 30 giây, xong ta thêm 200μl M – Wash Buffer ly tâm tiếp 10.000 vòng 30 giây Bước Đặt cột sang ống 1,5ml mới, thêm 10μl M – Elifying Buffer vào cột Sau ly tâm 10.000 vòng 30 giây để rửa giải DNA 3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa  Truy xuất trình tự gene từ sở liệu Ensembl Cơ sở liệu Ensembl trình duyệt quốc tế gene mới, nhẹ dễ dàng cập Trang web thiết kế cho phép tìm kiếm thông tin gene cho số lượng lớn lồi, nhằm mục đích cung cấp thơng tin gen Ngồi việc truy cập trực tiếp vào tất tệp trang web, duyệt tệp có sẵn tìm liên kết nhanh để tải xuống tệp thích gen trình tự gen  Xác định trình tự promoter gene khoảng cách tới vị trí CpG đích Việc dị tìm đầu 5´ thách thức lớn việc dị tìm gene khó xác định xác promoter điểm khởi phiên mã (transcriptional start site TSS) Hiện nay, xấp xỉ 17.000 gene người xuất Genbank có khỏang 3000 gene ghi TSS Hầu hết cDNA lấy từ mRNA bị cắt ngắn đầu 5´ trình phiên mã ngược tạo đầu 5´ Hoạt động promoter trình khởi phiên mã thực phức tạp Sau chromatin khu vực chứa promoter tái cấu trúc theo hướng duỗi thẳng siêu acetyl hóa, phức hợp tiền khởi gắn lên vùng promoter lõi (nằm xấp xỉ 100 bp hai phía TSS) Q trình phiên mã sau điều khiển chủ yếu yếu tố phiên mã gắn lên vùng lân cận m 27 promoter (khoảng1 kb theo hướng thượng nguồn TSS) vùng intron Trong trường hợp người ta có vùng không gian DNA rộng lớn genome người việc lập đồ trình tự TSS cần độ phân giải thấp (khoảng xấp xỉ 2kb) đồng thời TSS có liên hệ với CpG ta kết hợp hai thuộc tính CpG promoter cho q trình dị tìm [21]  Thiết kế mồi - Methyl Primer Express v1.0 MethPrimer chương trình thiết kế bisulfit chuyển đổi dựa Methylation PCR mồi Hiện tại, thiết kế mồi cho hai loại PCR bisulfite: PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) PCR Bisulfite-Sequences PCR (BSP) PCR Bisulfite-Restriction MethPrimer dự đoán đảo CpG chuỗi DNA Để xác định mức độ methyl hóa, ta thiết kế cặp mồi cho promoter Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa cặp mồi dùng để xác định ADN khơng bị methyl hóa m 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết 4.1.Kết đo hàm lượng DNA Bảng 4.1: Kết hàm lượng DNA sau đo quang phổ Tên phương pháp Số mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ DNA DNA DNA DNA 1000ng/μl 500ng/μl 100ng/μl 10 Sử dụng KIT 43 0 37 Phương pháp NaOH 2N 0 Phương pháp Lysis buffer 84 32 18 31 12 Phương pháp campos cộng 100ng/μl 4.1.1.Phương pháp campos cộng - Nồng độ DNA không ổn định với 40% 1000mg/ul 60% từ 120 – 366 - Khối lượng mẫu 125mg - Tỷ lệ OD 260/280 có mức ổn định từ 1.6 - 1.7 chiếm 60% - Tỷ lệ OD 260/230 hầu hết < 1.8, cịn lẫn nhiều tạp chất - Có mẫu sát với tiêu nồng độ, tỷ lệ OD chiếm 10% - mẫu nhiễm phenol chiếm 60% - Có mẫu có số gần đạt tiêu chuẩn chiếm 10% tất thí nghiệm 4.1.2.Sử dụng KIT - Tổng có 43 mẫu DNA (khơng tính mẫu mơ lợn) - Khối lượng mẫu cân toàn khoảng từ 25-30 mg m 29 - Có thí nghiệm có nồng độ DNA 100ng/ul chiếm 13.95% tất thí nghiệm KIT - Có 13 thí nghiệm có tỷ lệ OD 260/280 từ 1,6-1,7 chiếm 30% , có mẫu đạt 1,8 mẫu lợn tươi - Kết OD 260/230 không ổn định > 1.8 có 10 mẫu chiếm 23,25 % - Hầu hết thí nghiệm sử dụng KIT khơng cịn phenol mẫu chiếm 83% 4.1.3.Phương pháp NaOH 2N - Tổng số mẫu : mẫu (khơng tính mẫu mơ lợn) - Khối lượng mẫu cân 125 mg - Số mẫu có nồng độ DNA 1000ng/ul: mẫu chiếm 50% - Số mẫu có nồng độ DNA 500ng/ul : mẫu chiếm 37.5% - Không có nồng độ 100ng/ul - Nồng độ OD 260/280: mẫu có nồng độ từ 1.76-1.78 chiếm 37.5% - Nồng độ OD 260/230 có mẫu 2.0 cịn lại hầu hết thấp 1.5 - Số mẫu nhiễm tạp chất: mẫu chiếm 75% 4.1.4.Phương pháp Lysis buffer - Tổng số mẫu: 84 - Khối lượng: mẫu chưa rõ khối lượng - 12 mẫu có khối lượng : 25 mg - mẫu có khối lượng : từ 50 - 80mg - 71 mẫu có khối lượng 125 mg - Số mẫu có nồng độ DNA 1000ng/ul: 32 mẫu – chiếm 34.40% - Số mẫu có nồng độ DNA 500ng/ul: 18 mẫu – chiếm 19.35% - Số mẫu có nồng độ DNA 100ng/ul: 31 mẫu – chiếm 33.33% - Các mẫu tồn dư phenol : 54 mẫu - chiếm 58.06 % m 30 - Tỷ lệ OD 260/280 : từ 1.8 - 2.0 : mẫu đo lại lần cho kết khác - Tỷ lệ OD 260/230: khơng có mẫu từ 1.8 - 2.0 TỔNG KẾT: Trong phương pháp, phương pháp sử dụng KIT tối ưu phương pháp thiết kế phù hợp với mẫu mô cố định formaldehyde Phương pháp sử dụng KIT cho độ tinh cao, nồng độ DNA phần lớn số mẫu đạt yêu cầu Sử dụng KIT phương pháp chuẩn để tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formal, kết tách chiết chưa đạt yêu cầu thao tác tách chiết chiết thao tác điện di chưa tốt Phương pháp Lysis buffer phương pháp chúng tơi chọn để thử nghiệm, thực tế cho nồng độ DNA đạt yêu cầu hình ảnh điện di tốt nhất, DNA bị tạp nhiễm, phương pháp cần phải tối ưu Phương pháp NAOH 2N phương pháp thử nghiệm từ phương pháp khó khác phương pháp tách chiết DNA móng tay Phương pháp cho kết nồng độ DNA đạt yêu cầu, DNA cịn bị nhiễm tạp chất điện di khơng hiển thị band DNA nên phương pháp không phù hợp bị loại bỏ Phương pháp campos cộng phương pháp tách chiết DNA có sử dụng phenol, phương pháp cho kết DNA đạt yêu cầu, DNA tồn dư tạp nhiễm phenol nhiều trình tách chiết phương pháp có sử dụng phenol, hình ảnh điện di phương pháp Phương pháp cần tối ưu tốt m 31 4.2 Phân tích in silico thiết kế mồi Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa để phân biệt cách tối ưu DNA bị methyl hóa DNA khơng bị methyl hóa Các mồi khơng methyl hóa khuếch đại DNA chuyển đổi natri bisulfite có DNA khơng methyl hóa, mồi methyl hóa khuếch đại DNA methyl hóa natri bisulphite [22] 4.4.1 Gene FLI Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI Chromosome số hệ gene, chiều dài từ 65,058,434-65,058,508 bp - Dữ liệu trích xuất từ sở liệu Ensembl geneome - Để xác định mức độ methyl hóa, ta thiết kế cặp mồi cho promoter Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị methyl hóa cặp mồi dùng để xác định ADN không bị methyl hóa Sử dụng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0 (Applied Biosystem, Hoa kỳ) Trình tự mồi sử dụng dựa vào trình tự nucleotid promoter thuộc tế bào dòng chuẩn ngân hàng gen - Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI m 32 Hình 4.6 Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 4.4.2 Gene AGRN Hình 4.7 Vị trí kích thước gene AGRN Chromosome số hệ gene, chiều dài từ 1,047,475-1,047,838 bp - Dữ liệu lấy từ sở liệu Ensembl geneome - Sử dụng phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0 - Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN m 33 Hình 4.8 Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN 4.4.3 Kết thiết kế mồi AGRN CpG M-F TTTTATTTATTTTTTTAGTTTCGCG AGRN CpG M-R CGAAAATCTACTATCCCCGTC AGRN CpG U-F TTTATTTATTTTTTTAGTTTTGTGG AGRN CpG U-R CCAAAAATCTACTATCCCCATC AGRN Promoter M-F TTTTTCGTTTGCGTTATGGTC AGRN Promoter M-R GTATACTACACCGAATCCACGTT AGRN Promoter U-F GTTTTTTGTTTGTGTTATGGTTGG AGRN Promoter U-R ACATATACTACACCAAATCCACATT FLI1 Promoter M-F AATGTGTTTGGGTATTTTCGC 10.FLI1 Promoter M-R AAATAACTTCACTTTACGAATCGAA 11.FLI1 Promoter U-F TATGAATGTGTTTGGGTATTTTTGT 12.FLI1 Promoter U-R AAATAACTTCACTTTACAAATCAAA m 34 13.FLI1 CpG M-F CGTTCGTATAGATTTTTAGCGTTTC 14.FLI1 CpG M-R TTACAACCTAAACCCAAACTTAACG 15.FLI1 CpG U-F TTTGTTTGTATAGATTTTTAGTGTTTT 16.FLI1 CpG U-R CAACCTAAACCCAAACTTAACA m 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Qua q trình thí nghiệm, tách chiết thành công DNA cố định formaldehyde bốn phương pháp - Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa phần mềm chuyên dụng Methyl Primer Express Software v1.0 Kiến nghị - Tối ưu hóa phương pháp tách chiết DNA campos phương pháp lysis buffer để DNA đạt độ tinh cao - Sử dụng mồi PCR đặc hiệu methyl hóa thiết kế cho mục đích thí nghiệm m 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Moore, L D., Le, T & Fan, G DNA methylation and its basic function Neuropsychopharmacology vol 38 23–38 (2013) Von Känel, T & Huber, A R DNA methylation analysis Swiss Med Wkly 143, (2013) Dekker, E., Tanis, P J., Vleugels, J L A., Kasi, P M & Wallace, M B Colorectal cancer The Lancet vol 394 1467–1480 (2019) Colon Cancer Treatment (PDQ®)–Patient Version - National Cancer Institute https://www.cancer.gov/types/colorectal/patient/colon- treatment-pdq Lucas, C., Barnich, N & Nguyen, H T T Microbiota, inflammation and colorectal cancer International Journal of Molecular Sciences vol 18 (2017) Bray, F et al Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA Cancer J Clin 68, 394–424 (2018) Rawla, P., Sunkara, T & Barsouk, A Epidemiology of colorectal cancer: Incidence, mortality, survival, and risk factors Przeglad Gastroenterologiczny vol 14 89–103 (2019) Noi, H., Phong, H., Nguyen, T., Minh, H C & Tho, C CANCER CONTROL IN VIETNAM: WHERE ARE WE NOW? Okugawa, Y., Grady, W M & Goel, A Epigenetic Alterations in Colorectal Cancer: Emerging Biomarkers Gastroenterology 149, 12041225.e12 (2015) 10 Illumina CpG Loci Identification www.illumina.com/literature (2010) 11 Vu, T L., Nguyen, T T., Doan, V T H & Vo, L T T Methylation profiles of BRCA1, RASSF1A and GSTP1 in Vietnamese women with breast cancer Asian Pacific J Cancer Prev 19, 1887–1893 (2018) m 37 12 Truong, P K., Lao, T D & LE, T A H Hypermethylation of DcR1 Genebased Biomarker in Non-invasive Cancer Screening of Vietnamese Cervical Cancer Patients Iran J Public Health 47, 350–356 (2018) 13 Vo, T T L., Ta, B T., Ta, V T., Vuong, D L & Nguyen, Q U Promoter methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancer and benign hyperplasia in Vietnamese men Turkish J Med Sci 46, 228–235 (2016) 14 Elzi, D J., Song, M., Houghton, P J., Chen, Y & Shiio, Y The role of FLI1-EWS, a fusion gene reciprocal to EWS-FLI-1, in Ewing sarcoma Genes Cancer 6, 452 (2015) 15 Riggi, N et al EWS-FLI1Utilizes Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma Cancer Cell 26, 668–681 (2014) 16 Lennard Richard, M L., Nowling, T K., Brandon, D., Watson, D K & Zhang, X K Fli-1 controls transcription from the MCP-1 gene promoter, which may provide a novel mechanism for chemokine and cytokine activation Mol Immunol 63, 566–573 (2015) 17 Lefebvre, C et al Mutational Profile of Metastatic Breast Cancers: A Retrospective Analysis PLoS Med 13, (2016) 18 Li, X et al Oncogenic properties of NEAT1 in prostate cancer cells depend on the CDC5L–AGRN transcriptional regulation circuit Cancer Res 78, 4138–4149 (2018) 19 Zhang, L., Zhang, Z & Yu, Z Identification of a novel glycolysis-related gene signature for predicting metastasis and survival in patients with lung adenocarcinoma J Transl Med 17, (2019) 20 Gilbert, M T P et al The Isolation of Nucleic Acids from Fixed, ParaffinEmbedded Tissues-Which Methods Are Useful When? PLoS One 2, (2007) m 38 21 Zhang, M Q Computational prediction of eukaryotic protein-coding genes Nature Reviews Genetics vol 698–709 (2002) 22 Huang, Z., Bassil, C F & Murphy, S K Methylation-specific PCR Methods Mol Biol 1049, 75–82 (2013) m 39 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên ngày… tháng… năm…… Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên) chữ ký ghi rõ họ tên) m