Hoàn thiện quy trình thu nhận và phân tích các đặc điểm hóa lý của protein concentrate từ hạt đậu ngự (phaseolus lunatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM HỒN THIỆN QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC ĐIỂM HĨA LÝ CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ HẠT ĐẬU NGỰ GVHD: PHẠM THỊ HOÀN SVTH: PHAN THỊ YẾN DUYÊN TRẦN THANH TRANG SKL008436 Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƢỢNG CAO NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116053 HỒN THIỆN QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC ĐIỂM HĨA LÝ CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ HẠT ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus) SVTH: PHAN THỊ YẾN DUYÊN – 18116053 TRẦN THANH TRANG – 18116130 GVHD: TS PHẠM THỊ HOÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƢỢNG CAO NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022–18116053 HỒN THIỆN QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC ĐIỂM HĨA LÝ CỦA PROTEIN CONCENTRATE TỪ HẠT ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus) SVTH: PHAN THỊ YẾN DUYÊN – 18116053 TRẦN THANH TRANG – 18116130 GVHD: TS PHẠM THỊ HỒN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƢỢNG CAO NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Phan Thị Yến Duyên MSSV: 18116053 Trần Thanh Trang 18116130 Ngành: Công nghệ Thực phẩm Tên khóa luận: Hồn thiện quy trình thu nhận phân tích đặc điểm hóa lý protein concentrate từ hạt đậu ngự (Phaseolus lunatus) Mã số đồ án: 2022–18116053 Nhiệm vụ khóa luận:  Khảo sát yếu tố dung mơi trích ly, pH đẳng điện, tốc độ ly tâm để hoàn thiện quy trình thu nhận protein concentrate từ đậu ngự nhằm tăng hàm lƣợng protein concentrate  Xác định thành phần hóa học thành phần acid amin protein concentrate đậu ngự  Khảo sát ảnh hƣởng độ pH đến số tính chất hóa lý chế phẩm Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: 14/ 02 / 2022 Ngày hồn thành khóa luận: 05 / 08 / 2022 Họ tên ngƣời hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Hồn Phần hƣớng dẫn: Tồn khóa luận Nội dung yêu cầu đồ án tốt nghiệp đƣợc thông qua Trƣởng Ngành Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày Trƣởng Ngành tháng năm 2022 Giảng viên hƣớng dẫn iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới tất quý thầy cô, công nhân viên chức trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật nói chung quý thầy Khoa Cơng nghệ Hóa học Thực phẩm nói riêng tạo mơi trƣờng học tập tốt, đầy động, sáng tạo chƣơng trình học gần gũi, thiết thực Trong suốt năm học tập trƣờng, đƣợc truyền đạt kiến thức kỹ vô quý báu ngành Công nghệ thực phẩm Đặc biệt, xin đƣợc cảm ơn T.S Phạm Thị Hoàn – Trƣởng ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Đào tạo Chất lƣợng cao, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật TP.HCM Cô hỗ trợ dạy tận tình, hƣớng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho chúng tơi từ hình thành ý tƣởng đến hồn thành khóa luận tốt nghiệp Chúng tơi thật biết ơn điều xin ghi nhớ lời dạy cô Bên cạnh đó, chúng tơi xin gửi lời cảm ơn đến cô Hồ Thị Thu Trang – chuyên viên phụ trách phịng thí nghiệm xƣởng thực hành Bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Cơng nghệ Hóa Học Thực phẩm hỗ trợ tận tình mặt dụng cụ, máy móc, thiết bị phục vụ cho việc thực nghiệm Chúng xin cảm ơn quý thầy phụ trách xƣởng cơng nghệ phịng thí nghiệm tạo điều kiện thuận lợi không gian thực nghiệm Sau cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm, giúp đỡ, ln kề vai sát cánh tạo điều kiện tốt để chúng tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Trong trình thực đề tài, khó tránh khỏi sai sót nên chúng tơi mong nhận đƣợc góp ý q thầy để luận văn chúng tơi đƣợc hồn thiện Một lần xin chân thành cảm ơn kính chúc sức khỏe! iv LỜI CAM ĐOAN Chúng tơi xin cam đoan tồn nội dung đƣợc trình bày khóa luận tốt nghiệp thực với cố vấn T.S Phạm Thị Hồn – Trƣởng ngành Cơng nghệ Thực phẩm – Khoa Đào tạo Chất lƣợng cao, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật TP.HCM Chúng xin cam đoan số liệu kết khóa luận tốt nghiệp hoàn toàn trung thực, nội dung đƣợc tham khảo khóa luận tốt nghiệp đƣợc trích dẫn xác đầy đủ theo quy định Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 08 năm 2022 Sinh viên thực PHAN THỊ YẾN DUYÊN v TRẦN THANH TRANG PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN vi vii PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƢỜI PHẢN BIỆN viii ix Q He et al., “PEGylation of black kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) protein isolate with potential functironal properties”, Colloids Surf B Biointerfaces, vol 164, pp 89– 97, Apr 2018, Doi:10.1016/j.colsurfb.2018.01.029 J F Su, Z Huang, X.–Y Yuan, X.–Y Wang, and M Li, “Structure and properties of carboxymethyl cellulose/soy protein isolate blend edible films crosslinked by Maillard reactions”, Carbohydr Polym., vol 79, no 1, pp 145–153, Jan 2010, Doi:10.1016/j.carbpol.2009.07.035 L Were, N S Hettiarachchy, and U Kalapathy “Modified Soy Proteins with Improved Foaming and Water Hydration Properties”, J Food Sci., vol 62, no 4, pp 821– 824, Jul 1997 Doi:10.1111/j.1365-2621.1997.tb15463.x R Horax; N S Hettiarachchy; P Chen; M Jalaluddin “Functional Properties of Protein Isolate from Cowpea (Vigna unguiculata L Walp.)”, 69(2), 0–0, 2004 Doi:10.1111/j.1365-2621.2004.tb15501.x Kudre, Tanaji G; Benjakul, Soottawat; Kishimura, Hideki “Comparative study on chemical compositions and properties of protein isolates from mung bean, black bean and bambara groundnut” Journal of the Science of Food and Agriculture, 93(10), 2429–2436, 2013 Doi:10.1002/jsfa.6052 Nguyễn Thị Phƣợng “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm bột protein đậu tương cô đặc (soy whey protein isolate) bột protein đậu tương thủy phân (soy whey protein hydrolysate) từ đậu tương” Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, 2019 [Online] Nguyễn Thị Hiền “Thu nhận protein isolate, protein concentrate từ đậu phộng” Luận văn tiến sĩ, Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh, 2017 [Online] Bùi Thanh Bình cộng “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất protein isolate từ đậu nành” Đề tài NV.1534/11, Viện nghiên cứu Dầu có dầu – Bộ Cơng Thƣơng, 2011 [Online] G Schaafsm ”The Protein Digestibility–Corrected Amino Acid Score” The Journal of Nutrition, 130(7), 1865S–1867S, (2000) Doi:10.1093/jn/130.7.1865S O Moses, I Olawuni, and J O Iwouno, “The proximate composition and functional properties of full–fat flour, and protein isolate of lima bean (Phaseolus lunatus)” Open Access Sci Rep., vol 1, no 7, pp 1–5, 2012 Doi:10.4172/scientificreports.349 61 K D Schwenke, “Reflections about the functional potential of legume proteins A Review”, Food Nahr., vol 45, no 6, pp 377–381, 2001, Doi:10.1002/15213803(20011001)45:63.0.co;2-g S D Arntfield and H D Maskus, al et., “Peas and other legume proteins”, in Handbook of Food Proteins, G O Phillips and P A Williams, Eds Woodhead Publishing, pp 233–266, 2011 Doi:10.1533/9780857093639.233 S B Yellavila, al et “Proximate Composition, Minerals Content and Functional Properties of Five Lima Bean Accessions” Journal of Food Security, Vol 3, no 3, 69 – 74, 2015 Doi:10.12691/jfs-3-3-1 S S De Shpande S S Nielsen “Nitrogenous Constituents of Selected Grain Legumes” Journal of Food Science, 1321–1325, 1987 Doi:10.1111/j.13652621.1987.tb14073.x M Kaur and N Singh, “A comparison between the properties of seed, starch, flour and protein separated from chemically hardened and normal kidney beans”, J Sci Food Agric., vol 87, no 4, pp 729–737, 2007 Doi:10.1002/jsfa.2798 Matak, K E., Tahergorabi, R., & Jaczynski, J “A review: Protein isolates recovered by isoelectric solubilization/precipitation processing from muscle food byproducts as a component of nutraceutical foods” Food Research International, 77, 697–703, 2015 Doi:10.1016/j.foodres.2015.05.048 Osthoff, G., Hugo, A., Wyk, P., Wit, M., & Meyer, S “Characterization of a Spray dried Soymilk powder and changes observed during storage” Food Science Technology of International, 16(2), 169–178, 2010 Doi: 10.1177/1082013209353236 Achmad Subagio, “Characterization of hyacinth bean (Lablab purpureus (L.) sweet) seeds from Indonesia and their protein isolate”, Food Chem., vol 95, no 1, pp 65–70, Mar 2006 Doi:10.1016/j.foodchem.2004.12.042 K Shevkani, N Singh, A Kaur, and J C Rana “Structural and functional characterization of kidney bean and field pea protein isolates: A comparative study”, Food Hydrocoll., vol 43, pp 679–689, Jan 2015 Doi:10.1016/j.foodhyd.2014.07.024 M B K Foh, X Wenshui, I Amadou, and Q Jiang “Influence of pH Shift on Functional Properties of Protein Isolated of Tilapia (Oreochromis niloticus) Muscles and of Soy 62 Protein Isolate”, Food Bioprocess Technol., vol 5, no 6, pp 2192–2200, Aug 2012 Doi:10.1007/s11947-010-0496-0 Y Ji et al “DFT–Calculated IR Spectrum Amide I, II, and III Band Contributions of N – Methylacetamide Fine Components”, ACS Omega, vol 5, no 15, pp 8572–8578, Apr 2020, Doi:10.1021/acsomega.9b04421 M Carbonaro, P Maselli, and A Nucara “Structural aspects of legume proteins and nutraceutical properties”, Food Res Int., vol 76, pp 19–30, Oct 2015, Doi:10.1016/j.foodres.2014.11.007 Ee-San Tan, Ngoh Ying–Yuan & Chee-Yuen Gan “A comparative study of physicochemical characteristics and functionalities of pinto bean protein isolate (PBPI) against the soybean protein isolate (SPI) after the extraction optimization” Food Chemistry, 152, 447–455, 2014 Doi:10.1016/j.foodchem.2013.12.008 Surewicz, W K., & Mantsch, H H “New insight into protein secondary structure from resolution–enhanced infrared spectra”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/ Protein Structure and Molecular, 952(none), 115–130, 1988 Doi:10.1016/01674838(88)90107-0 Y Peng, K Kyriakopoulou, M Ndiaye, M Bianeis, J K Keppler, and A J van der Goot, “Characteristics of Soy Protein Prepared Using an Aqueous Ethanol Washing Process”, Foods, vol 10, no 9, p 2222, Sep 2021 Doi: 10.3390/foods10092222 M Carbonaro “7S Globulins from Phaseolus vulgaris L.: Impact of Structural Aspects on the Nutritional Quality”, Biosci Biotechnol Biochem., vol 70, no 11, pp 2620– 2626, Nov 2006 Doi:10.1271/bbb.60203 A Kimura, T Fukuda, M Zhang, S Motoyama, N Maruyama, and S Utsumi, “Comparison of Physicochemical Properties of 7S and 11S Globulins from Pea, Fava Bean, Cowpea, and French Bean with Those of Soybean – French Bean 7S Globulin Exhibits Excellent Properties”, J Agric Food Chem., vol 56, no 21, pp 10273–10279, Nov 2008 Doi:10.1021/jf801721b C Brinegar, B Sine, and L Nwokocha, “High–Cysteine 2S Seed Storage Proteins from Quinoa (Chenopodium quinoa)”, J Agric Food Chem., vol 44, no 7, pp 1621– 1623, Jan 1996 Doi:10.1021/jf950830+ A Shoaib et al., “Use of pea and rice protein isolates as source of meat extenders in the development of chicken nuggets” 2018 42(9): p e13763 Doi:10.1111/jfpp.13763 63 M Garcia-Vaquero, M Lopez-Alonso, and M Hayes, “Assessment of the functional properties of protein extracted from the brown seaweed Himanthalia elongata (Linnaeus) S F Gray”, Food Res Int., vol 99, pp 971–978, Sep 2017 Doi: 10.1016/j.foodres.2016.06.023 Price, K., et al., “The chemistry and biological significance of saponins in foods and feedingstuffs”, 26(1): p 27-135, 1987 DOI:10.1080/10408398709527461 [1] E W Lusas, et al., “Soy protein products: processing and use”, 1995 Doi:10.1093/jn/125.3_Suppl.573S P Kathirvel and P Kumudha, “A comparative study on the chemical composition of wild and cultivated germplasm of Phaseolus lunatus L.”, Nternational J Appl Biol., 2011 T J Buma & S Henstra “Particle structure of spray dried caseinate and spray–dried lactose as observed by a scanning electron microscope” Neith, Milk Dairy Journal, 25, 278, 1971 Debouk, D G La agricultura en Mesoamerica Frijoles (Phaseolus spp.) In Cultivos Andinos FAO Ologhobo, D.A and Fetuga, B.L (1982b) “Carbohydrate constituents of some lima bean (Phaseolus lunatus) varieties” Nutr Rep Int., 26, 981 ISSN: 0029–6635 Ologhobo, D.A and Fetuga, B.L (1983a) Trypsin inhibitor activity in some lima bean (Phaseolus lunatus) varieties as affected by different processing methods Nutr Rep Int., 27, 41–7 ISSN: 0029–6635 FAO, “Cultivos Andinos Cultivos Autoctonos Subexplotados de Mesoamerica” 2020 L Sair and E Park “Method of extracting protein from defatted soybean material”, U S Pat Off., p 3, 1961 Martin, al et “Chemical composition and nutritional evaluation of a cowpea protein concentrate” Global Advanced Research Journal of Food Science and Technology, 2(3), 035–043, 2003 Retrieved from http://garj.org/garjfst/index.htm AOAC, Official Methods of Analysis of the Association ofOfficial Analytical Chemists (17th edn) Association of Official Analytical Chemists, Gaithersberg, MD (2000) Miller, G L (1959) Analytical Chemistry, 31, 426–428 64 Z Berk, “Technology of Production of Edible Flours and Protein Products from Soybeans” Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1992 P J, A Narikimelli, M Sajini, and S Vincent, ―Optimization for autolysis assisted production of fish protein hydrolysate from underutilized fish Pellona ditchela,‖ vol 4, Dec 2014 M Aremu, O Olaofe, and E Akintayo, “Functional properties of some Nigerian varieties of legume seed flours and flour concentration effect on foaming and gelation properties”, J Food Technol., vol 5, pp 109–115, Jan 2007 Nguyễn Thị Bắc Nguyễn Đặng Chung, “Thu nhận, đánh giá tính chất hóa ly, lý đặc điểm chức protein concentrate từ hạt đậu ngự”,Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh, Mã số: 2021-17116055, 2021 Brink, M., Belay, G., & De Wet, J M J (2006) Plant resources of tropical Africa 1: Cereals and pulses Wageningen, The Netherlands: PROTA Foundation ISBN 905782-171-0 65 PHỤ LỤC Phụ lục Kết đo thành phần acid amin mẫu PPC 66 67 Phụ lục Kết đo thành phần acid amin mẫu PPC* 68 69 Phụ lục Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein Phương pháp sử dụng: Kjeldahl AOAC 979.09 Lƣợng protein đƣợc xác định từ hàm lƣợng nitrogen hữu phƣơng pháp Kjeldahl Các hợp chất nitrogen khác đƣợc chuyển thành ammonium sulphate cách cho chúng phản ứng với acid sulphuric đậm đặc Ammonium sulphate đƣợc hình hành đƣợc thủy phần với dung dịch kiềm, điển hình NaOH Lƣợng ammonia giải phóng đƣợc hấp thụ 1ƣợng dƣ dung dịch acid chuẩn, sau đƣợc chuẩn độ lại với dung dịch kiềm chuẩn Hóa chất: Sulfuric acid đậm đặc – trọng lƣợng riêng 1,84; 30% NaOH – hòa tan 300 mg NaOH vào 1000 mL nƣớc; Dung dịch Hydrochloric acid chuẩn – 0,1 N; Dung dịch NaOH 10%; Chất thị Phenolphtalein (C20H14O4), Kali sunfat (K2SO4), Boric Acid (H3BO3), Chất thị Methyl Red– hòa tan 0,5 mg methyl red 100 mL cồn, Chất thị Bromocresol Green (C21H14Br4O5S), Sulfat pentahydrat (CuSO4.5H2O) Cách tiến hành: Vơ hóa mẫu: cân 0,5g mẫu bỏ vào ống Kjeldahl Sau cho 0,075 g chất xúc tác CuSO4, 2.5g chất trợ sôi K2SO4, 10 mL H2SO4 đậm đặc vào ống Kjeldahl Chuyển ống Kjeldahl vào thiết bị gia nhiệt, đậy kín thiết bị hút khí độc Gia nhiệt, phân hủy mẫu trở nên suốt Chƣng cất: Mẫu sau đƣợc vơ hóa đƣợc chuyển qua thiết bị chƣng cất Đặt bình erlen đầu thiết bị chứa 10 mL dung dịch (Boric Acid (H3BO3) + Methyl Red + Bromocresol Green) Cài đặt chƣơng trình cho máy cho máy chạy Kết thúc trình lấy bình erlen đƣa chuẩn độ Chuẩn độ: Lấy erlen khỏi hệ thống; sau chuẩn độ HCl 0,1N Khi dung chuyển màu hồng nhạt, đọc buret xác đến 0,05 mL Tính tồn Hàm lƣợng phần trăm nitơ mẫu: Trong đó: Wn: hàm lƣợng nitơ phần trăm khối lƣợng a: (mL) thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu b: (mL) thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng m: (g) khối lƣợng mẫu đem vô hóa Thành phần phần trăm hàm lƣợng protein mẫu đƣợc xác định theo cơng thức: 70 Trong đó: Wp: hàm lƣợng protein thô Wn: hàm lƣợng nitơ phần trăm khối lƣợng 6,25: hệ số chuyển đổi hàm lƣợng nitơ thành hàm lƣợng protein thô Phụ lục Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ẩm Phương pháp sử dụng: AOAC 925.09 Cách tiến hành: Rửa đĩa cho làm khô cách sấy nhiệt độ 105 – 110oC, đem cân đến khối lƣợng không đổi Cân xác khoảng gam mẫu đĩa làm khơ làm nhỏ kích thƣớc trƣớc sấy Sau – thời gian nên đƣợc tính từ thời điểm lò đạt đƣợc 105°C sau đặt đĩa vào, lấy để nguội bình hút ẩm cân Đĩa phải đƣợc đặt trở lại lò khoảng thời gian nửa đạt đƣợc khối lƣợng khơng đổi Thơng số kỹ thuật kích thƣớc đĩa cần đƣợc xác định Cách tính: Trong đó: W1: (g) khối lƣợng đĩa vật liệu trƣớc sấy W2: (g) khối lƣợng đĩa vật liệu sau sấy W: (g) khối lƣợng đĩa Phụ lục Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro Phương pháp sử dụng: AOAC 923.03 Cách tiến hành: Nung chén sứ chén kim loại rửa lị nung tới 550– 600℃ đến trọng lƣợng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001g Cho vào chén khoảng 2g mẫu, cân tất cân phân tích với độ xác nhƣ Cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ 550–600℃ Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thời gian nung thƣờng khoảng 6–7 Trƣờng hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân với độ xác nhƣ Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân trọng lƣợng không đổi Kết gữa lần nung cân liên tiếp không đƣợc cách 0,0005g cho 1g mẫu thử Cách tính: 71 Trong đó: W1: (g) khối lƣợng chén nung vật liệu sấy khô W2: (g) khối lƣợng chén nung tro W: (g) khối lƣợng chén nung Phụ lục Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất béo Phương pháp sử dụng: Sử dụng phƣơng pháp Soxhlet 4.5.01 có số thay đổi Hóa chất: Dymethyl ether petroleum ether Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu đậu sấy khơ hồn tồn sau đƣợc nghiền mịn Cho khoảng 2g mẫu đậu đƣợc nghiền mịn vào túi giấy chuyên dùng cho Soxhlet xác định khối lƣợng giấy gói Chuyển mẫu vào trụ chiết Sau đó, đổ dung mơi bao gồm dimethyl ether petroleum ether theo tỷ lệ 1:1 từ phía ống sinh hàn chảy qua trụ chiết cuối chảy xuống bình đựng dung mơi Mở nguồn nƣớc làm lạnh ống sinh hàn bật nguồn nhiệt để làm bay dung môi Dung môi bay đƣợc làm lạnh hệ thống ống sinh hàn ngƣng tụ, chảy xuống trụ chiết thực q trình trích ly chảy xuống bình đựng dung mơi Q trình trích ly hồn tồn lipid kéo dài khoảng – 12 tiếng Kiểm tra mẫu trích ly hồn tồn cách lấy dung mơi từ trụ chiết nhỏ lên giấy lọc Dung mơi bay hồn tồn khơng để vết loang dầu kết thúc Tính thành phần phần trăm khối lƣợng lipid thu đƣợc Tính tốn: Hàm lƣợng chất béo mẫu tính % theo cơng thức: Trong đó: m1: (g) khối lƣơng giấy m2: (g) khối lƣợng giấy khối lƣợng chất béo sau sấy G: (g) khối lƣợng mẫu Phụ lục Phƣơng pháp xác định tổng carbohydrate Phương pháp sử dụng: Sử dụng phƣơng pháp Phenol – sulfuric axit AOAC 988.12 Hóa chất: Dung dịch glucose chuẩn 100 mg/L; Phenol 80% (w/w) nƣớc: pha cách thêm 20 g nƣớc cất vào 80 g tinh thể phenol tinh khiết; Axit sulfuric đậm đặc Cách tiến hành: Phản ứng với H2SO4 phenol: lấy ống nghiệm, lần lƣợt thêm vào ống nghiệm dung dịch với thể tích nhƣ bảng bên dƣới Các ống 1–6 để dựng đƣờng chuẩn, ống 7–9 mẫu protein đƣợc lặp lần Các phản ứng ống đƣợc xảy phần nhờ nhiệt tỏa thêm H2SO4 vào dung dịch, H2SO4 cần 72 đƣợc cho rơi thẳng xuống bề mặt dung dịch ống nghiệm để chảy dọc theo thành ống nghiệm Sau lần thêm chất lỏng vào ống nghiệm lắc kỹ tay máy lắc vortex Để yên ống nghiệm 10 phút, sau để bể điều nhiệt để làm nguội đến nhiệt độ phòng trƣớc đo độ hấp thụ Số thứ tự 7–9 Dung dịch glucose gốc (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0 0 0,5 Phenol 5% (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 H2SO4 đặc (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Nƣớc cất (mL) Mẫu pha loãng (mL) Đo độ hấp thụ: đeo găng tay rót mẫu vào cuvet Để mẫu chuẩn với µg glucose làm mẫu trắng (blank) đo độ hấp thụ 490 nm mẫu từ đến so với mẫu trắng Trƣớc cho cuvet vào đo cần kiểm tra bề mặt mà ánh sáng qua có bị ƣớt hay có vết bẩn hay khơng, có phải lau miếng vải mềm Phụ lục Phƣơng pháp Lowry Nguyên tắc: Phƣơng pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret với việc khử thuốc thử Folin-Ciocalteau phenol (axit phosphomolybdic-phosphotungstic) tyrosine tryptophan dƣ protein Màu xanh đƣợc phát triển đƣợc đọc bƣớc sóng 750 nm (độ nhạy cao nồng độ protein thấp) 500 nm (độ nhạy thấp nồng độ protein cao) Quy trình ban đầu đƣợc Miller Hartree sửa đổi để cải thiện độ tuyến tính phản ứng màu sắc với nồng độ protein Thủ tục: Quy trình sau dựa quy trình sửa đổi Hartree: Protein cần phân tích đƣợc pha lỗng đến phạm vi thích hợp (20 – 100 μg) Dung dịch K Na Tartrat-Na2CO3 đƣợc thêm vào sau để nguội ủ nhiệt độ phòng 10 phút CuSO4-K Na Dung dịch tartrat-NaOH đƣợc thêm vào sau để nguội ủ nhiệt độ phòng 10 phút Thuốc thử Folin chuẩn bị đƣợc thêm vào sau trộn hỗn hợp phản ứng ủ 50oC 10 phút Độ hấp thụ đƣợc đọc bƣớc sóng 650 nm Đƣờng cong tiêu chuẩn BSA đƣợc xây dựng cẩn thận để ƣớc tính nồng độ protein chƣa biết 73 Các ứng dụng: Vì tính đơn giản độ nhạy nó, phƣơng pháp Lowry đƣợc sử dụng rộng rãi sinh hóa protein Tuy nhiên, khơng đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định protein hệ thống thực phẩm mà không chiết xuất protein từ hỗn hợp thực phẩm trƣớc Thuận lợi:  Rất nhạy cảm: nhạy 50-100 lần so với phƣơng pháp biuret, nhạy 10–20 lần so với phƣơng pháp hấp thụ UV 280 nm, độ nhạy tƣơng tự nhƣ Nesslerization; nhiên, thuận tiện Nesslerization  Ít bị ảnh hƣởng độ đục mẫu  Cụ thể hầu hết phƣơng pháp khác  Tƣơng đối đơn giản; đƣợc thực 1–1,5 Nhược điểm: Vì lý sau, quy trình Lowry yêu cầu tiêu chuẩn hóa cẩn thận cho ứng dụng cụ thể:  Màu sắc thay đổi theo protein khác mức độ lớn so với phƣơng pháp biuret  Màu sắc không tỷ lệ thuận với nồng độ protein  Phản ứng bị cản trở mức độ khác sacaroza, lipid, chất đệm photphat, monosaccharid hexoamines  Nồng độ cao đƣờng khử, amoni sulfat hợp chất sulfhydryl cản trở phản ứng 74 S K L 0