BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana R[.]Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ Nho (Vitaceae)
TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Nho Vitis L
Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [4], chi Nho có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật (Plantae)
Phân Lớp Hoa hồng (Rosidae)
Chi Nho có những đặc điểm chung như sau: Dây leo, thân thường hóa gỗ ở phần gốc; tua cuốn đối diện với lá, thường xẻ đôi ở đỉnh Lá đơn, mọc cách, phiến lá nguyên hoặc có thùy, lá kèm sớm rụng Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá Hoa tạp tính, mẫu 5: dài hình chén, mép nguyên hoặc lượn sóng; cánh hoa 5, dính nhau ở đỉnh thành mũ; bầu 2 ô, mỗi ô 2 noãn, núm nhụy hơi phình to Quả mọng hình cầu hoặc bầu dục Hạt 2- 4, hình trứng ngược, gốc có mỏ ngắn, mặt lưng và bụng thường có gờ và hố nhỏ [1],
1.1.1.3 Sinh thái và phân bố
Trên thế giới, chi Nho có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, chi này có 6 loài, gồm 4 loài bản địa: V balansana Planch., V. flexuosa Thunb., V heyneana Roem & Schult., V retordii Roman du Caill ex Planch. và 2 loài nhập trồng: V larbusca L và V vinifera L [1]. Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam được trình bày tại bảng 1.1.
Bảng 1.1 Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam [1]
STT Tên khoa học Tên thường gọi Sinh thái Vùng phân bố
1 V larbusca L Nho chồn Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8 Thích nghi ở vùng đất khô hạn, nắng nhiều.
Nguồn gốc từ Trung Mỹ, được trồng khắp nơi trên đất nước ta.
Nho rừng, Nho ngũ giác, Nho do
Ra hoa từ tháng 2-4, quả chín tháng 6-8
Mọc rải rác ven rừng, trên các trảng cây bụi và vách đá trên đảo.
Cao Bằng (Ngân Sơn), Lạng Sơn, Quảng Ninh (Hạ Long), Ninh Bình, Nghệ An (Pù Mát), Ninh Thuận (Cà Ròm).
Roman du Caill ex Planch.
Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8 Mọc rải rác ven rừng, trên các trảng cây bụi và vách đá trên đảo.
Cao Bằng (Nguyên Bình), Quảng Ninh (Hạ Long), Ninh Bình, Đắk Lắk (Krong Pắc).
4 V vinifera L Nho Thường ra hoa tháng 4-6, thu hoạch quả tháng 8-10.
Nguồn gốc từ Tây Nam Á và Đông Nam Âu, được trồng ở khắp nơi trên nước ta, nhưng chủ yếu ở các tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ.
Nho rừng, Nho đất, Nho tía, Nho balansa
Ra hoa tháng 5-7, quả chín tháng 7-9 Mọc rải rác ven rừng, ven đường đi, sông suối, trên các trảng cây bụi, quanh làng bản và trên các đảo đá.
Phú Thọ (Thanh Sơn, Tx Phú Thọ), Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Ninh (VQG Bái Tử Long), Hải Phòng, Ninh Bình (Chợ Gềnh, Cúc Phương), Hà Tĩnh (Kỳ Anh), Quảng Bình, Quảng Trị (Đông Hà), Thừa Thiên
Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa (Nha Trang).
Nho cong queo, Nho dịu, Nho dại
Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8 Mọc rải rác ven rừng.
Sơn La (Mộc Châu), Thừa Thiên Huế (Bạch Mã), TâyNinh (Cày Cổng).
1.1.1.4 Khóa phân loại các loài thuộc chi Nho ở Việt Nam
1A Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ lông tơ dày dạng tơ nhện màu trắng, nâu hoặc vàng.
2A Quả hình bầu dục Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ lông tơ nhện màu trắng 1 V labrusca. 2B Quả hình cầu Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ lông tơ nhện màu nâu hoặc vàng.
3A Đường kính quả 1,3-1,5 cm Vỏ hạt nhẵn, mặt bụng của hạt có 2 rãnh dọc Thân và nhánh non có lông cứng và lông cứng dạng tơ nhện. Mép lá có 8-15 đôi răng cưa 2 V heyneana. 3B Đường kính quả 0,8-1cm Vỏ hạt có nhiều nếp nhăn, mặt bụng của hạt gờ hình móng ngựa Thân và nhánh non không có lông cứng. Mép lá có 20-30 đôi răng cưa 3 V retordii. 1B Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa nhẵn hoặc có rất ít lông. 4A Đường kính quả 1,5-2cm Phiến lá có 3-5 thùy, mép lá có răng cưa to, thô và không đều nhau 4 V vinifera. 4B Đường kính quả nhỏ hơn 1cm Phiến lá nguyên, mép có răng cưa nhỏ và đều nhau.
5A Bao phấn hình bầu dục Hạt hình trứng ngược Phiến lá dày, gốc lá hình tim, mép lá có 15-20 đôi răng cưa 5 V balansana. 5B Bao phấn hình gần tròn Hạt hình tim Phiến lá mỏng, gốc lá cụt hoặc lõm, mép lá có 5-10 đôi răng cưa 6 V flexuosa [1].
1.1.2.1 Nhóm hợp chất phenol a Các hợp chất stilbenoid
Cho đến nay đã có gần 100 stilbenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi Nho Các stilbenoid bao gồm monomer stilbenoid, dimer stilbenoid và oligomer stilbenoid.
Trong số gần 100 stilbenoid đã phân lập từ chi Nho, có 13 hợp chất là monomer stilbenoid 1-13 E-resveratrol (7) là chất phổ biến nhất được tìm thấy trong thành phần
6 của 12 loài Nho Các hợp chất còn lại chủ yếu là các dẫn xuất methoxy, dẫn xuất glycosid của resveratrol và piceatannol với 2 dạng đồng phân cis và trans Các hợp chất 11 và 12 là các stilbenoid có sự xuất hiện của vòng γ-lactam trong cấu trúc Trong
13 monomer stilbenoid đã phân lập, có 12 monomer stilbenoid được tìm thấy trong thành phần hóa học của loài V vinifera Tên và cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid đã phân lập từ các loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.2 và hình
Hình 1.1 Cấu trúc chung của các monomer stilbenoid phân lập từ chi Nho
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ chi Nho
Bảng 1.2 Các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ các loài thuộc chi Nho
STT Tên hợp chất Loài Bộ phận TLTK
Lá, thân Quả Thân, quả
Rễ Quả Quả Quả, lá, quả
Lá, thân Quả Quả Quả
Lá, thân, rễ Thân Toàn cây Quả và lá Thân Quả, lá, thân Thân
Rễ Quả Thân Quả, rễ, lá
8 E-Resveratrol 2-C-glucosid (8) V vinifera Rễ, quả [13], [23]
11 E-Resveratrol 4-γ lactam (11) V vinifera Chồi non [25]
12 E-Resveratrol 2-γ lactam (12) V vinifera Chồi non [25]
Cho đến nay, đã có 39 hợp chất dimer stilbenoid 14-52 được phân lập từ chi Nho, trong đó có 26 hợp chất được tìm thấy trong thành phần hóa học của loài V vinifera. Các hợp chất chủ yếu là các dimer của resveratrol, phổ biến nhất là các dẫn xuất của viniferin, pallidol và ε-viniferin Tên và cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid từ các loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.3 và hình 1.3.
Bảng 1.3 Các dimer stilbenoid 14-52 đã phân lập từ các loài thuộc chi Nho
STT Tên hợp chất Loài Bộ phận TLTK
Lá, thân, rễ Thân Toàn cây Thân
Lá, thân Toàn cây Rễ
Thân Toàn cây Rễ Toàn cây Thân Thân
(5R)-5-(3-(3,5-dihydroxy- phenyl)-6-hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4-((E)-4- hydroxystyryl)-2,3- dihydrobenzofuran-5- yl)pyrrolidin-2-on (48)
(5S)-5-(3-(3,5- dihydroxyphenyl)-6- hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4-((E)-4- hydroxystyryl)-2,3- dihydrobenzofuran-5- yl)pyrrolidin-2-on (49)
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid 14-52 phân lập từ chi Nho
Theo các công bố trên thế giới, đã có 19 hợp chất trimer stilbenoid 53-71 được phân lập từ chi Nho, trong đó có 7 hợp chất được tìm thấy từ loài V vinifera Một trimer mới của resveratrol - wenchowenol (69) đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài
V wenchowensis [48] Tên và cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid từ các loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.4 và hình 1.4.
Bảng 1.4 Các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ các loài thuộc chi Nho
STT Tên hợp chất Loài Bộ phận TLTK
Thân Toàn cây Thân Thân
Lá, thân, rễ Toàn cây
Lá, thân, rễ Toàn cây [10], [16], [21]
Lá, thân Rễ Toàn cây Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ
10 E-trans-Miyabenol C (62) V vinifera Lá, thân [36]
17 Wenchowenol (69) V wenchowensis Thân và rễ [48]
18 Z-cis-Miyabenol C (70) V vinifera Chồi non [52]
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ chi Nho
Cho đến nay, đã có 25 hợp chất tetramer stilbenoid 72-96 được tìm thấy trong thành phần hóa học của các loài thuộc chi Nho Hopeaphenol (81) là hợp chất tetramer duy nhất có trong rượu Ngoài ra, 12 hợp chất khác cũng đã được phân lập từ rễ, thân và lá của loài V vinifera Tên và cấu trúc hóa học của các tetramer stilbenoid từ các loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.5 và hình 1.6.
Hình 1.5 Cấu trúc khung của một số tetramer stilbenoid phân lập từ chi Nho Bảng 1.5 Các tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ các loài thuộc chi Nho
STT Tên hợp chất Loài Bộ phận TLTK
Rễ Thân Toàn cây Thân Rễ
Lá, rễ, thân Thân Toàn cây Toàn cây Thân Thân
Rễ Rễ Thân, rễ Thân, rễ
Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của một số tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ chi Nho
Các pentamer và hexamer stilbenoid
Có 2 pentamer stilbenoid 97-98 và 2 hexamer stilbenoid 99-100 đã được phân lập từ 3 loài Nho là V amurensis, V chunganensis và V vinifera Tên và cấu trúc hóa học của các hợp chất này được trình bày trong bảng 1.6 và hình 1.7.
Bảng 1.6 Các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 phân lập từ các loài thuộc chi Nho
STT Tên chất Loài Bộ phận TLTK
Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 từ chi Nho
Như vậy, đã có 100 hợp chất stilbenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi Nho Trong số 100 hợp chất này, có 13 hợp chất monomer stilbenoid 1-
13, 39 hợp chất dimer stilbenoid 14-52, 19 hợp chất trimer stilbenoid 53-71, 25 hợp chất tetramer stilbenoid 72-96, 2 hợp chất pentamer stilbenoid 97-98 và 2 hợp chất hexamer stilbenoid 99-100. b Các hợp chất flavonoid
Ngoài stilbenoid, các hợp chất flavonoid cũng đã được tìm thấy trong các loài Nho Từ quả của loài V vinifera, người ta đã phát hiện các flavonoid thuộc nhóm flavan-3- ol, flavonol và anthocyanin [59], [60], [61], [62] Trong đó, các hợp chất có hàm lượng cao là catechin (103), epicatechin (104), quercetin (103), rutin (106) và kaempferol
(107) [59], [62] Tên và cấu trúc của các hợp chất flavonoid thuộc chi Nho được trình bày tại bảng 1.7 và hình 1.9.
Hình 1.8 Cấu trúc của một số khung flavonoid thuộc chi Nho Bảng 1.7 Một số hợp chất flavonoid (101-134) được tìm thấy trong chi Nho
8 Quercetin 3-glucosid (108) III OH Glc
9 Quercetin 3-glucuronid (109) III OH Glcu
10 Rutin (110) III OH Rut V labrusca
12 Kaempferol 3-glucosid (112) III H Glc V vinifera Quả [61]
13 Kaempferol 3-galactosid (113) III H Gal V vinifera Quả [61]
14 Delphinidin-3-O-glucosid (114) IV OH H Glc H V vinifera
16 Peonidin-3-O-glucosid (116) IV H CH3 Glc H V vinifera
17 Malvidin-3-O-glucosid (117) IV OCH3 CH3 Glc H V vinifera Quả [60]
18 Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid (118) IV H H CGlc H V heyneana Quả [37]
19 Peonidin-3-O-coumaroylglucosid (119) IV H CH3 CGlc H V heyneana Quả [37]
20 Malvidin-3-O-coumaroylglucosid (120) IV OCH3 CH3 CGlc H V davidii
21 Delphinidin-3,5-O-diglucosid (121) IV OH H Glc Glc V davidii
22 Cyanidin-3,5-O-diglucosid (122) IV H H Glc Glc V heyneana Quả [37]
23 Petunidin-3,5-O-diglucosid (123) IV OCH3 H Glc Glc V davidii
24 Peonidin-3,5-O-diglucosid (124) IV H CH3 Glc Glc V davidii
25 Malvidin-3,5-O-diglucosid (125) IV OCH3 CH3 Glc Glc V davidii
26 Delphinidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (126) IV OH H AGlc Glc V heyneana Quả [37]
27 Cyanidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (127) IV H H AGlc Glc V heyneana Quả [37]
28 Petunidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (128) IV OCH3 H AGlc Glc V heyneana Quả [37]
(129) IV OH H CGlc Glc V davidii
30 Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (130) IV H H CGlc Glc V heyneana Quả [37]
31 Petunidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (131) IV OCH3 H CGlc Glc V davidii
32 Peonidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (132) IV H CH3 CGlc Glc V heyneana Quả [37]
33 Delphinidin-3-O-coumaroylglucosid (133) IV OH H CGlc H V heyneana Quả [37]
34 Malvidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (134) IV OCH3 CH3 CGlc Glc V davidii
24 c Các hợp chất phenol khác
Tổng quan về loài Nho rừng
Tên khoa học: Vitis heyneana Roem & Schult. Đồng danh:
Vitis ficifolia var pentagona Pamp.
Vitis heyneana subsp heyneana (Batalin) H Hara
Vitis pentagona var honanensis Rehder
Vitis thunbergii var yunnanensis Planch ex Franch.
Cho đến nay, có rất ít các nghiên cứu về loài Nho rừng V heyneana Roem & Schult được công bố Các nghiên cứu này chủ yếu liên quan đến đặc điểm hình thái thực vật và thành phần hóa học.
1.2.1 Đặc điểm thực vật của Nho rừng
Dây leo dài tới 10 m, thân và nhánh non có lông cứng và lông tơ như nhện màu vàng, sau đó nhẵn, có màu nâu đen; cuống, mặt dưới lá và cụm hoa có lông tơ như tơ nhện màu vàng nhạt; tua cuốn đối diện lá, xẻ đôi ở đỉnh Lá đơn, mọc cách, cuống lá dài 1,5-6 cm, thường ngắn hơn nhiều so với phiến lá; phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, cỡ 4-15 x 3-11 cm, nguyên hoặc có 3 thùy nông, gốc lá cụt hoăc lõm, hiếm khi hình tim, mép lá có 8-15 đôi răng cưa nhọn, chóp lá nhọn, thường có mũi; gân lá hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 4-6 đôi gân bên, gân cấp 3 thường song song, nổi rõ ở mặt dưới; lá kèm hình trứng, dài 3-5 mm, sớm rụng Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá, dài 4-15 cm, các nhánh bên phía dưới rất dài, cuống cụm hoa dài 1-4 cm, cuống
44 hoa dài 2-3 mm, không có lông; nụ hoa hình chứng ngược, dài xấp xỉ bằng cuống hoa, không
45 có lông Hoa tạp tính, mẫu 5, đài hình chén, mép nguyên hoặc lượn sóng; cánh hoa hình trứng ngược, dính nhau ở đỉnh thành mũ, rụng khi hoa nở; nhị đối diện cánh hoa, chỉ nhị mảnh, cỡ 1 mm, bao phấn 2 ô hình dầu dục, cỡ 0,5 mm ở hoa đực và hoa lưỡng tính, ở hoa cái bao phấn tiêu giảm; triền mỏng, mép có thùy nông; bầu hình trứng, vòi nhụy hình trụ ngắn, núm nhụy không phình to ở hoa cái, ở hoa đực bầu tiêu giảm còn lại triền hình đĩa Quả mọng hình cầu, đường kính 1,3-1,5 cm, khi chín màu tím đen. Hạt hình trứng ngược, dài 8-10 mm, đỉnh tròn, gốc thuôn nhọn [1], [5].
1.2.2 Thành phần hóa học của Nho rừng
Các công bố đến nay cho thấy, đã có 58 hợp chất được xác định phân bố ở các bộ phận của loài Nho rừng V heyneana như thân, rễ, lá, quả Trong đó 13 hợp chất stilbenoid được phân lập chủ yếu từ thân và rễ, 1 hợp chất phenol, 3 hợp chất sterol và
3 hợp chất triterpenoid được phân lập từ thân, và 2 triterpenoid cùng 5 hợp chất megastigman được phân lập từ lá Nho rừng Các hợp chất phenol (flavonoid và acid hữu cơ) đã được xác định có trong cao chiết quả Nho rừng bằng phương pháp sắc kí hiệu năng cao kết hợp khối phổ Các hợp chất được trình bày tại bảng 1.10.
Bảng 1.10 Các hợp chất đã được phân lập từ loài Nho rừng V heyneana
TT Nhóm cấu trúc Tên chất Bộ phận TLTK
Các hợp chất phenol khác
1.2.3 Tác dụng và công dụng của Nho rừng
Nho rừng đã được sử dụng khá phổ biến trong y học dân gian Việt Nam cũng như các nước lân cận Theo Võ Văn Chi [2], Nho rừng có vị hơi đắng, chua, tính bình.
Rễ, vỏ rễ có tác dụng điều kinh hoạt huyết, thư cân hoạt lạc, chỉ huyết Toàn cây chỉ huyết, khu phong thấp, an thai, thanh nhiệt Lá thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu thũng, giải độc Ở
Trung Quốc và Campuchia, người dân tại đây dùng rễ Nho rừng để trị đòn ngã tổn thương, gân cốt tê đau, viêm phế quản, bệnh lậu, chữa kinh nguyệt không đều và làm thuốc lợi tiểu.
Mặc dù đã được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền, tuy nhiên ngoài nghiên cứu của Huang và cộng sự (2011) các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Nho rừng còn khá hạn chế Theo nhóm nghiên cứu của Huang, cao chiết methanol từ thân cây Nho rừng có khả năng ức chế sản sinh NO trong đại thực bào chuột bị kích thích bởi LPS với IC 50 là 132 àg/ml Cao phõn đoạn ethyl acetat cũng thể hiện tỏc dụng chống viờm thụng qua khả năng ức chế sản sinh NO 50% ở nồng độ 50 àg/ml và ức chế 90% ở nồng độ 100 àg/ml Ngoài ra, cao ethyl acetat cựng với hai hợp chất E-ε-viniferin
(34) và 2-(4- hydroxyphenyl)-2,3-dihydrobenzo[b]furan-3,4,6-triol (146) còn có tác dụng bảo vệ gan bị tổn thương bởi CCl 4 , tác dụng tương tự silymarin và resveratrol[33].
Tổng quan về viêm
Khái niệm viêm (inflammation), có nguồn gốc từ tiếng latin “inflammatio” có nghĩa là đốt cháy, là một quá trình quan trọng trong hệ miễn dịch của cơ thể, nhằm loại bỏ hoặc sửa chữa các mô bị tổn thương và vô hiệu hóa tác nhân có hại, sau đó khôi phục lại cân bằng nội môi [174], [175], [176] Trong phản ứng viêm, các hợp chất trung gian gây viêm như bradykinin, serotonin, histamin, prostaglandin và nitric oxid được giải phóng và gây ra các triệu chứng lâm sàng điển hình như sưng, nóng, đỏ, đau [177].
Viêm có thể chia làm 2 dạng chính là viêm cấp tính và viêm mạn tính Viêm cấp tính là đáp ứng tức thì của hệ miễn dịch chống lại mầm bệnh và tổn thương mô.Đây là một quá trình tự giới hạn nhanh, được trung gian bởi các eicosanoid và các amin hoạt mạch, làm tăng chuyển động của huyết tương và bạch cầu tới vị trí bị nhiễm bệnh [178] Các triệu chứng của viêm cấp tính là sưng, nóng, đỏ, đau, phù và mất chức năng hoạt động [177], [179] Viêm cấp tính diễn ra trong thời gian ngắn, và thường được coi như một biện pháp tự điều trị của cơ thể [180] Trong giai đoạn đầu của đáp ứng viêm, các chất trung gian tiền viêm như prostaglandin và leukotrien đóng vai trò quan trọng [181] Tuy nhiên, sự tiến triển từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính trong
49 nhiều căn bệnh phổ biến lại liên quan đến sự gia tăng các chất trung gian gây viêm này [182].
1.3.2 Các chất trung gian trong phản ứng viêm
1.3.2.1 Vai trò của acid arachidonic
Các chất trung gian mạnh của phản ứng viêm đều là các chất dẫn xuất của acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa có nguồn gốc từ màng phospholipid tế bào Trong điều kiện bình thường nồng độ AA tự do bên trong tế bào khá thấp [183]. Khi xuất hiện kích thích như chấn thương cơ học, cytokin và các yếu tố tăng trưởng,
AA được giải phóng khỏi màng phospholipid bởi enzym phospholipase [184].
Quá trình chuyển hóa acid arachidonic diễn ra theo một trong bốn con đường chính sau đây: Một là con đường cyclooxygenase (COX), bao gồm sự tạo thành prostaglandin (PG), thromboxan (Tx), và prostacyclin Hai là con đường lipoxygenase (LOX), trong đó tạo ra leukotrien (LT) và lipoxin Ba là con đường cytochrom P450 monooxygenase, trong đó có sự hình thành acid epoxyeicosatrienoic và hydroxy- eicosatetraenoic Và bốn là con đường peroxy hóa lipid, trong đó tạo ra isoprostan [177].
COX giúp acid arachidonic chuyển thành endoperoxid, bao gồm các chất trung gian hóa học để sản xuất prostaglandin và thromboxan [185], [186]. a Các dạng của COX
COX còn được biết đến với tên gọi là prostaglandin endoperoxid H synthase (PGHS) và tồn tại dưới 2 dạng: PGHS-1 (COX-1) và PGHS-2 (COX-2), với vai trò xúc tác quá trình oxy hóa AA thành prostanoid [187] COX-1 và COX-2 là hai hệ thống tổng hợp prostanoid riêng biệt với các chức năng sinh học khác biệt biệt Trong khi, COX-1 tồn tại trong hầu hết các mô động vật có vú, đóng vai trò trong việc sản xuất PG, kiểm soát các quá trình sinh lý bình thường Ngược lại, COX-2 là một enzyme cảm ứng chịu trách nhiệm sản xuất các PG gây viêm và đau [188]. b Vai trò của COX-2 trong viêm và ung thư
COX-2 là nguồn chính xúc tác tạo ra prostanoid trong viêm [189] Các prostanoid là các chất trung gian hóa học đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm Trong các mô viêm, quá trình sinh tổng hợp của chúng gia tăng đáng kể và góp phần phát triển tín hiệu của chứng viêm cấp [190].
COX-2 bị kích thích mạnh bởi các yếu tố tăng trưởng, cytokin, endotoxin, các phân tử tiền viêm và các promoter khối u, và chịu trách nhiệm chính cho quá trình sản
51 xuất PG trong chứng viêm cấp và viêm mạn tính [191] Sự biểu hiện quá mức củaCOX-2 có
52 liên quan đến nồng độ cao của PGE2 và đã được chứng minh trong một số bệnh lý u ác tính vú, phổi, da, cổ tử cung, đầu và cổ [192].
NOS xúc tác biến đổi L-arginin thành L-citrullin, đồng thời tạo ra NO, một gốc tự do thể khí [193] Hợp chất này hoạt động như một phân tử truyền tải gen đặc biệt trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý quan trọng [194], [195], [196] Quá trình tạo ra nitric oxid được xúc tác bởi 3 isozym NOS tương đồng, trong đó eNOS và nNOS và có nhiệm vụ sản xuất ra NO với nồng độ thấp để điều chỉnh huyết áp và các chức năng thần kinh Ngược lại iNOS kích thích bởi cytokin sẽ sản sinh ra một lượng lớn NO trong các tế bào viêm đã được kích hoạt [197].
NO được tổng hợp từ L-arginin bởi iNOS là một chất trung gian đa chức năng liên quan đến quá trình giãn mạch trong phản ứng viêm và là một chất tín hiệu quan trọng cũng như gây độc tế bào Sự sản sinh quá mức gốc tự do này sẽ dẫn đến gây bệnh cho mô chủ, bởi NO có thể liên kết với các gốc tự do superoxid khác gây tổn thương đến chức năng tế bào [195], [198] iNOS được biểu hiện ở nhiều loại tế bào khác nhau trong điều kiện bình thường và bệnh lý, bao gồm các đại thực bào, tế bào thần kinh đệm, tế bào keratinocyt, tế bào gan, và tế bào biểu mô mạch máu Với các tác nhân kích thích nhiễm trùng và kích thích tiền viêm, lượng protein iNOS được sinh ra rất cao để tạo thành NO trong phạm vi micromol, trong khi đó lượng NO sản sinh từ các enzym nNOS và eNOS là hằng số và chỉ ở phạm vi nanomol [194] Sự biểu hiện của iNOS có thể được điều chỉnh bởi các tác nhân như interferon-γ, IL-1β, TNF-α, LPS và stress oxy hoá [199].
1.3.2.4 NF-κB và mối quan hệ giữa COX-2 và iNOS trong phản ứng viêm
Tín hiệu nuclear factor kappa B (NF-κB) đóng vai trò trung tâm trong việc điều chỉnh phản ứng viêm thông qua sự phiên mã gen tiền viêm COX-2 và iNOS Mặc dù ở tế bào bình thường, yếu tố này ở trạng thái bất hoạt, nhưng trong tế bào ung thư yếu tố này ở trạng thái hoạt hóa Sự hoạt hóa này gây ra bởi các chất kích thích khác nhau (như các mitogen, các cytokin viêm và LPS), các chất gây ung thư, và các sản phẩm gen trung gian hình thành khối u [200], [201].
NF-κB hiện diện trong tế bào chất ở dạng phức hợp không hoạt động kết hợp với một protein ức chế là IκB Sự tiếp xúc của tế bào với kích thích viêm kích động sẽ làm
53 cho phức hợp NF-κB / IκB phân ly bởi phản ứng phosphoryl hóa IKK (IκB kinase), sau đó phosphorylates IκB ở Ser-32 và Ser-36, theo sau là sự thoái hóa proteosomal của IκB Tiếp theo, NF-κB chuyển vị từ tế bào chất sang nhân Trong nhân tế bào, NF- κB thúc đẩy quá trình phiên mã số lượng lớn các gen mục tiêu mã hoá các enzym gây viêm, bằng cách liên kết với yếu tố cis-acting κB (Hình 1.13) Trong số các chất điều hòa phiên mã trong vùng promoter của iNOS và COX-2, NF-κB dường như là yếu tố phiên mã thiết yếu nhất cho sự biểu hiện của các enzym viêm trong các tế bào bị kích thích bởi LPS [201], [202], [203], [204], [205] Vì sự biểu hiện và hoạt động của cả iNOS và COX-2 đều gây ra bởi các tác nhân tiền viêm giống nhau và có những điểm tương đồng trong sinh lý bệnh, người ta đã đề xuất rằng việc ức chế cả iNOS và COX-
2 sẽ tạo ra tác dụng chống viêm mạnh nhất Do đó, iNOS và COX-2 là đích tiếp cận đầy hứa hẹn trong chống viêm cũng như phòng ngừa ung thư [206].
Phiên mã gen COX-2, iNOS
Hình 1.12 Sơ đồ cơ chế viêm theo con đường NF-κB [201], [202], [203]
1.3.3 Một số mô hình đánh giá tác dụng chống viêm
1.3.3.1 Mô hình in vitro a Tế bào và thử nghiệm gây độc tế bào của mẫu thử
Tế bào đại thực bào chuột thường được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm in vitro Bởi đây là những tế bào thiết yếu được hình thành và chuyên biệt từ các monocyte để đáp ứng với các kích thích gây bệnh Nhiều dòng tế bào đại thực bào đã được sử dụng, phổ biến nhất là dòng RAW264.7, dòng J774, hay dòng NR8383 [110], [118], [56].
Tế bào đại thực bào được nuôi cấy ở môi trường thích hợp Sau đó, người ta đánh giá tác dụng gây độc tế bào của mẫu thử Thử nghiệm MTT assay được sử dụng phổ biến Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào trên hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống sót còn lại sau khi được xử lý với các mẫu thử Enzym này biến đổi tetrazolium có màu vàng nhạt thành formazan có màu vàng đậm, cơ chế phát hiện dựa trên sự đo màu ở bước sóng λ
= 570 nm [86]. b Các đích nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ
Phần trên mặt đất loài Nho rừng mọc tự nhiên tại xã Bản Mế, huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai, được thu hái vào tháng 9/2016.
Mẫu nghiên cứu là phần trên mặt đất loài Nho rừng mọc tự nhiên tại xã Bản Mế, huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai, được thu hái vào tháng 9/2016 Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội (HN) và được TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định.
Mẫu nghiên cứu sau khi thu hái, được sấy ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi đạt độ ẩm khoảng 5% Làm nhỏ mẫu đến kích thước phù hợp và bảo quản trong túi kín.
- Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cân nặng 150 - 180 g do Học viện Quân Y cung cấp.
- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino khỏe mạnh, cân nặng 18 - 20 g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên, cho ăn bằng thức ăn chuẩn, uống nước tự do Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm tại Bộ môn Dược lực - Đại học Dược Hà Nội tối thiểu 5 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu.
2.1.4 Thuốc thử, hóa chất, dung môi
- Hóa chất cho nghiên cứu thực vật: Javen, đỏ carmin, xanh methylen, nước cất.
- Các dung môi dùng trong chiết xuất như methanol (MeOH), n-hexan, EtOH, ethyl acetat (EtOAc), aceton, dichloromethan (DCM) là dung môi công nghiệp đã cất lại; các dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung Quốc.
- Các dung môi, hóa chất dùng trong định tính đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.
- Silica gel 60 (sắc ký cột pha thường), cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (Merck); silica gel pha đảo YMC (30 − 35 μm, FuJisilisa Chemical Ltd); MIC, Sephadex, bản mỏng silica gel G F254 (Merck), RP18 (Merck).
- Chất gây viêm lipopolysaccharid (LPS, cat: L4391), meloxicam (cat: M3935) và
MTT (cat: M2128) của hãng Sigma (St Louis, MO, Mỹ).
- Tế bào RAW264.7 từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD); 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, a tetrazol-MTT) do công ty hóa chất Roche (USA) cung cấp.
- Kháng thể β-actin của hãng Sigma (St.Louis, MO, cat: A5316, Mỹ).
- Huyết thanh bò, DMEM, RPMI, trypsin từ Gibco BRL (Grand Island, NY, Mỹ).
- COX-2 (1:1000, cat: 610204) và heat shock protein 90 (HSP90) (1:1000, cat
- Khỏng sinh penicillin, streptomycin (100 àg/ml), NaCl, Tris-HCl, NP40 của hóng Sigma (St Louis, MO, Mỹ).
- Kháng thể chuột thứ cấp hoặc thỏ thứ cấp liên hợp HRP (1:5000 hoặc 1:10000) của hãng Cell Signaling (Mỹ).
- 5-Bromo-2′-deoxy-uridine (BrdU) labeling và kit phát hiện của Roche
- ELISA kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Mỹ) để đo PGE2.
- BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, Mỹ).
- Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) kit (cat 34095, Pierce West Femto, Thermo Fisher Scientific, Mỹ).
- Plasmid NF-κB, thuốc thử LipofectAMINE2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad,
- microRNeasy kit mini (Qiagen, 217.004, Germany)
- Quantifast SYBR Xanh RT-PCR (Qiagen, 204.156, Germany).
- Thuốc thử chuyển gen Oligofectamine (Life Technologies, Mỹ).
- Thuốc chứng dương: Indomethacin 25 mg của Domesco, aspirin 100 mg của Traphaco, Prednisolon 5 mg của Dược phẩm Nam Hà.
- Các hóa chất dùng trong nghiên cứu dược lý thực nghiệm: Acid acetic (Merck, Đức), carrageenan (Sigma Aldrich), Na-CMC 0,1% (Sigma Aldrich, Mỹ).
2.1.5.1 Các thiết bị dùng trong nghiên thực vật học
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Kính hiển vi quang học Leica, kính lúp soi nổi Leica, máy ảnh kỹ thuật số Canon.
2.1.5.2 Các thiết bị và máy móc dùng trong nghiên cứu hóa học
- Cột sắc ký các loại
- Bếp điện, bếp đun cách thủy
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Đức)
- Tủ sấy Memmert (Memmert, Mỹ)
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy Sĩ)
- Đèn UV-Vilber lourmat (Vilber, Pháp)
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Hwashin, Hàn Quốc)
Điểm nóng chảy: GALLENKAMP (Sanyo, Nhật Bản)
Góc quay cực: JASCO V-550 UV/Vis spectrometer (Tokyo, Nhật Bản)
Phổ khối lượng phun mù điện: Varian Agilent 1100LC-MSD
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR (Bucker, Mỹ) của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.1.5.3 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu hoạt tính sinh học
- Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co., Mỹ).
- Máy chụp western blot và PCR (LAS 4000, Nhật Bản).
- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190 - 800 nm (Shimadzu, Nhật Bản)
- Bộ Western blot (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, Mỹ).
- StepOnePlus RT-PCR cycler, Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Mỹ)
Địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu thực vật
- Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
- Phòng Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu hóa học
- Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu.
- Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3 Địa điểm nghiên cứu tác dụng sinh học
- Khoa Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
- Bộ môn Dược lực – Đại học Dược Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thu thập, xử lý mẫu nghiên cứu
- Thu thập mẫu nghiên cứu ở phía Bắc Việt Nam.
- Sấy mẫu dược liệu ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi đạt độ ẩm khoảng 5%.
- Xử lý mẫu đến kích thước phù hợp và bảo quản trong túi kín cho tới khi đưa vào nghiên cứu.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực vật học
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
- Phương pháp hình thái so sánh được áp dụng để xác định loài Các mẫu nghiên cứu được so sánh và đối chiếu với khóa phân loại và bản mô tả trong các tài liệu [1],
- Áp dụng phương pháp vi học để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu các bộ phận rễ, thân, lá của loài [207].
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.3.1 Phương pháp định tính Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [208], [209].
2.3.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất
- Dược liệu được chiết bằng phương pháp hồi lưu với EtOH 96%; phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần (n-hexan và EtOAc).
- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột; theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng.
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các dữ liệu phổ bao gồm: Điểm chảy, góc quay cực riêng, phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, đồng thời so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất đã biết.
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu một số tác dụng sinh học
Tác dụng chống viêm in vitro
- Chuẩn bị cao ethanol 96% (VH) và các cao phân đoạn (n-hexan - VHH, ethyl acetat
- VHE và cao nước - VHW) của cao EtOH 96% phần trên mặt đất của Nho rừng theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2.
- Chuẩn bị một số hợp chất stilbenoid và oligostilbenoid từ cao phân đoạn VHE của Nho rừng bằng phương pháp sắc kí cột.
Tác dụng giảm đau, chống viêm in vivo:
Chuẩn bị cao VHE theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2
2.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm
Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro a Đánh giá khả năng ức chế mức độ biểu hiện COX-2 mRNA bằng kỹ thuật RT – PCR
Nuôi cấy tế bào: Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2 trong môi trường RPMI có chứa 10% huyết thanh bào thanh bò FCS 1% kháng sinh penicillin
(100 đơn vị/ml) và streptomycin (100 μg/ml) Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế bào được nuôi đến mật độ 80-90% và chịu không quá 20 lần phân chia tế bào.
Mẫu chứng (C): Tế bào RAW264.7 không được kích thích viêm bằng LPS hay cao chiết và được ủ với DMSO (1% thể tích DMSO/ thể tích môi trường tế bào).
Mẫu đối chứng dương: Tế bào RAW264.7 được kích thích viêm bằng LPS pha với DMSO đạt nồng độ 5 àg/ml và khụng bổ sung cao chiết.
Mẫu thử (T): Tế bào RAW264.7 được kích thích viêm bằng LPS pha với DMSO đạt nồng độ 5 àg/ml và bổ sung cao chiết (cao chiết tổng, cao n-hexan, cao ethyl acetat, cao nước) pha trong DMSO đạt nồng độ 50 àg/ml.
Tách RNA tổng số và định lượng RT - PCR
Tế bào nuôi cấy được thu gom, rửa và ly giải trong 700 ul Qiazol và sau đó kỹ thuật cô lập RNA được thực hiện bằng microRNeasy kit mini theo hướng dẫn của nhà sản xuất Phản ứng RT-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng bộ Quantifast SYBR Xanh RT-PCR Các điều kiện phản ứng được sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất Các xét nghiệm sau Quantitect Primer đã được sử dụng để phát hiện mRNA: COX- 2 (Ptgs2), Mm_GADPH Trình tự các đoạn mồi là độc quyền của Qiagen.
Tính theo công thức của Livak
R: tỉ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thử so với mẫu chứng ΔΔCt = [Ct(T/Tg) - Ct(T/Ref)] - [Ct(C/Tg) - Ct(C/Ref)]
Ct(T/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gen đích COX-2 trong mẫu thử
Ct(T/Ref) : Chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu GADPH trong mẫu thử Ct(C/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gen đích COX-2 trong mẫu chứng
Ct(C/Ref): Chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu GADPH trong mẫu chứng Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 6 lần Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (M SE). b Đánh giá khả năng ức chế mức độ biểu hiện COX-2 và iNOS bằng phân tích
Tế bào đại thực bào RAW264.7 được bổ sung 5 àg/ml LPS ủ trong 18 h cú hoặc không có các chất được phân lập Các tế bào được thu và rửa sạch với nước muối đệm phosphat lạnh (PBS) Các tế bào được ly giải trên băng trong 30 phút trong 100 ul dung dịch ly giải [60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol] Dịch chiết tế bào sau đó được đun sôi trong 5 phút (100°C) và ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 30 phút Nồng độ dịch chiết tế bào được xác định bằng phương pháp BCA và điện di trên gel SDS – polyacrylamid 10% Sau khi điện di kết thúc, protein trong gel được chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó được ủ với kháng thể nguyên cấp (COX-2 1:1000, iNOS 1:1000 và β-actin 1:5000) Màng sau đó được ủ thêm với kháng thể thứ cấp peroxidase liên hợp (chuột hoặc thỏ 1:4000).
Mật độ các băng protein được phát hiện bằng dung dịch west femto, hình ảnh được phát hiện và phân tích bằng máy LICOR [213]. c Đánh giá khả năng ức chế mức độ sản sinh PGE2 bằng phương pháp miễn dịch gắn kết enzym liên kết (ELISA)
Bước 1: Sàng lọc độc tính của mẫu thử trên dòng tế bào RAW264.7 để lựa chọn nồng độ tối đa mà không thể hiện độc tính trên tế bào cho các thử nghiệm sau.
Bước 2: Các tế bào RAW264.7 được nuôi trong 6 ngày trong môi trường RPMI có bổ sung 10 % huyết thanh phôi bò.
Bước 3: Tế bào được tách ra, rửa và pha lại trong môi trường mới rồi chuyển vào đĩa 96 giếng với mật độ 10 4 tế bào/giếng qua đêm.
Bước 4: Thêm vào các giếng mẫu cần thử với nồng độ thích hợp trong 24 h. LPS được sử dụng là chất đối chứng Sau 24 giờ ủ với các chất thử, hàm lượng PGE2 trong môi trường được định lượng bằng phương pháp ELISA.
* Tính kết quả : Đánh giá hoạt tính ức chế PGE2 dựa vào kết quả đo mật độ quang của chất thử với mẫu trắng được xử lý bằng DMSO thay cho chất thử.
% ức chế của mẫu thử = mật độ quang của mẫu thử × 100 % mật độ quang của đối chứng dương d Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính phiên mã NF-kB bằng thí nghiệm phân tích hoạt động luciferase
Bước 1: Các tế bào RAW264.7 được nuôi trong 6 ngày trong môi trường RPMI có bổ sung 10 % huyết thanh phôi bò.
Bước 2: Tế bào được tách ra, rửa và pha lại trong môi trường mới có chứa FCS rồi chuyển vào đĩa 12 giếng với mật độ 5x10 5 tế bào/giếng qua đêm.
Bước 3: Chuẩn bị COX-2 plasmid 2 ug + Hilymax 8 ul được trộn đều trong 70 ul môi trường RPMI không chứa FCS, kháng sinh và được ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút trong ống nghiệm nhựa nhỏ Hỗn hợp này được sử dụng cho 1 giếng thí nghiệm và trộn đều cẩn thận từng giếng với hỗ hợp.
Bước 4: Thêm vào các giếng mẫu cần thử với nồng độ thích hợp và LPS 1ng/ml trong 24 h Sau 24 giờ ủ với các chất thử, COX-2 luciferase được được bằng phản ứng phát quang.
Tác dụng của mẫu thử = mật độ luminescent của mẫu thử mật độ luminescent của DMSO e Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO
Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
Dây leo, thân và nhánh non có lông tơ như tơ nhện màu vàng - trắng, sau đó nhẵn; cuống, mặt dưới lá và cụm quả có lông tơ như tơ nhện màu nâu vàng; tua cuốn đối diện với lá, xẻ đôi ở đỉnh, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc lúc non, sau nhẵn.
Lá đơn, mọc so le; lá kèm rụng sớm, có vết lá kèm ở gốc cuống lá; cuống lá dài 2-6 cm, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc, ngắn hơn rất nhiều so với phiến lá; phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, kích thước 4-10 x 3-7 cm, nguyên hoặc có 3 thùy nông; gốc lá hình tim hoặc cụt, mép lá có 19-22 đôi răng cưa nhọn, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn; gân lá hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 5-7 cặp, gân cấp 3 song song, nổi rõ ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên; mặt dưới lá phủ lông tơ màu nâu xám, mặt trên có lông tơ dạng mạng nhện lúc non, sau nhẵn (Hình 3.1) Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá, dài đến 12 cm, các nhánh bên phía dưới dài đến 4 cm, các nhánh bên ngắn dần, cuống cụm hoa dài 2,5-3 cm, cuống hoa dài khoảng 2 mm, không có lông; nụ hoa hình trứng ngược, khoảng 2 x 1,6 mm, đỉnh tròn, không có lông Hoa mẫu 5-6 hoặc 7; đài hình chén, không chia thùy hoặc thùy rất ngắn; cánh hoa hình trứng ngược hoặc giáo, khoảng 2 x 0,6-0,8 mm, nhẵn, màu xanh, dính nhau ở đỉnh thành mũ, rụng ngay khi hoa nở; số nhị bằng số cánh hoa, mọc đối diện với cánh hoa, chỉ nhị mảnh, nhẵn, dài 1 mm, bao phấn hai ô, đính gốc, màu vàng nhạt, khoảng 0,6 x 0,5 mm; bầu hình trứng, màu xanh, nhẵn, khoảng 1,5 x 1,1 mm, vòi nhụy ngắn, núm nhụy màu trắng, tròn hoặc chia thùy nông, mép tua (Hình 3.2) Cụm quả chùm kép, đối diện lá, dài 10-
15 cm, cuống cụm quả dài 3-4 cm, chia nhiều nhánh, các nhánh phía dưới dài hơn các nhánh phía trên Quả mọng hình cầu, kích thước không đều trong cùng một cụm,đường kính 0,9-1,4 cm, khi chín màu tím đen, nhẵn, vị rất chua Hạt 3-4 trong một quả, hình trứng ngược, đỉnh tròn, gốc thuôn nhọn, hơi xẻ 2, kích thước khoảng 6 x 4 mm; vỏ hạt nhẵn, mặt lưng có một đốm màu nâu ở giữa với đường sọc màu vàng nâu kéo dài qua đỉnh sang hết mặt bụng đến gốc hạt, mặt bụng có hai rãnh dọc xuất phát từ đỉnh hạt đến gần đỉnh, khía sâu vào hạt (Hình 3.1).
Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của loài Nho rừng
Chú thích: a Cành mang lá, chùm quả; b Thân già; c Thân non; d Tua cuốn; e Lá; f Gốc lá; g Chóp lá; h Chùm quả; i Quả; j Quả (cắt ngang); k Hạt (mặt bụng); l Hạt (mặt lưng); m Hạt (cắt ngang); n Hạt (cắt dọc).
Hình 3.2 Đặc điểm hoa của loài Nho rừng
Chú thích: a Cụm hoa; b Một phần cụm hoa; c Nụ hoa; d Tràng hoa (mẫu 5 - 6 - 7); e Tràng hoa; f-g-h Hoa đã bỏ tràng, bộc lộ bộ nhị và nhụy (nhìn từ mặt bên, dưới, trên); i Bầu. Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật, loài Nho rừng được sơ bộ xác định thuộc chi Vitis L., họ Nho (Vitaceae) và được TS Nguyễn Thế Cường – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học là Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho (Vitaceae). Mẫu mang số hiệu TL07 được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Đặc điểm vi phẫu thân
Vi phẫu có thiết diện tròn Từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì cấu tạo bởi 1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau, vách ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, thỉnh thoảng có lông che chở đơn bào (1) Tiếp theo là mô dày tập trung thành từng đám, gồm khoảng 20 hàng tế bào, có vách dày bằng cellulose, dày lên ở các góc (2) Mô mềm rất mỏng gồm 1-2 hàng tế bào hình đa giác, hình tròn, kích thước lớn sắp xếp lộn xộn nhau tạo thành các khoảng gian bào (3) Sợi (4) gồm khoảng 10 hàng tế bào màng dày hóa gỗ, xếp tạo thành hình cung phía trên bó dẫn Mô dẫn tạo thành từng bó riêng biệt, gồm libe (5) và gỗ (6) tiếp xúc nhau ở một mặt, libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong, tạo nên bó chồng, giữa các bó mô dẫn là tia ruột Mô mềm ruột ở trong cùng cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác kích thước lớn, thành mỏng, xếp lộn xộn (7) Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác ở mô mềm libe và mô mềm ruột (8), tinh thể calci oxalat hình kim có nhiều ở mô mềm ruột (9) (Hình 3.3).
Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân loài Nho rừng
Chú thích: 1 Biểu bì; 2 Mô dày; 3 Mô mềm vỏ; 4 Sợi; 5 Libe; 6 Gỗ; 7 Mô mềm ruột
8 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 9 Tinh thể calci oxalat hình kim.
Đặc điểm vi phẫu lá
Gân lá: Mặt trên hơi lõm Mặt dưới lồi thành hình cung Từ dưới lên trên gồm:
Biểu bì dưới (1) cấu tạo bởi 1 hàng tế bào hình tròn xếp xít nhau, vách ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, thỉnh thoảng có lông che chở đơn bào (11) Mô dày dưới phân bố ở toàn bộ mặt gân dưới gồm khoảng 3 hàng tế bào, vách dày lên đều đặn xung quanh tế bào
(2) Mô mềm gồm các tế bào hình tròn, kích thước lớn, xếp lộn xộn nhau để hở các khoảng gian bào (3) Mô dẫn tạo thành bó, bó to nhất ở dưới biểu bì trên, gồm libe ở trên (5), gỗ ở dưới (4) Mô cứng (6) gồm 2-3 hàng tế bào, nằm ngay trên libe Mô dày trên tập trung thành đám, gồm khoảng 8 hàng tế bào, vách dày lên đều đặn xung quanh tế bào (7) Biểu bì trên (8) gồm 1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau (Hình 3.4).
Phiến lá: Cấu tạo bởi biểu bì trên (8) và biểu bì dưới (1) Mô giậu gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau (9) Mô khuyết (10) gồm những tế bào không đều, để hở những khoảng gian bào lớn, rỗng, chứa đầy khí Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (11) nằm rải rác trong mô khuyết và tinh thể calci oxalat hình kim (12) nằm trong mô giậu (Hình 3.4).
Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá loài Nho rừng
Chú thích: 1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày dưới; 3 Mô mềm; 4 Gỗ; 5 Libe; 6 Mô cứng; 7 Mô dày trên;8 Biểu bì trên; 9 Mô giậu; 10 Mô khuyết; 11 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 12. Tinh thể calci oxalat hình kim; 13 Lông che chở.
3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu
Bột màu xám, không mùi, không vị Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau: Tinh thể calci oxalat hỡnh kim dài khoảng 60-80 àm (1), hỡnh cầu gai kớch thước khoảng 25 x 25 àm (7) và hỡnh khối kớch thước khoảng 10 x 10 àm (9) Hạt tinh bột hỡnh chuụng kớch thước khoảng 20 x 25 àm (2) Sợi (3) Mảnh mạch xoắn (4) và mảnh mạch điểm (8) Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, xếp lộn xộn (5) Lông che chở đơn bào dài khoảng 300 àm (6) (Hỡnh 3.5).
Hình 3.5 Đặc điểm bột thân loài Nho rừng
Chú thích: 1 Tinh thể calci oxalat hình kim; 2 Hạt tinh bột hình chuông; 3 Sợi; 4 Mạch xoắn;5 Mảnh mô mềm; 6 Lông che chở đơn bào; 7 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 8. Mạch điểm; 9 Tinh thể calci oxalat hình khối.
Bột màu xám, không mùi, không vị Soi bột trên kính hiển vi có các đặc điểm sau: Tinh thể calci oxalat hinh kim dài khoảng 60-80 àm (1a, 1b) và hỡnh cầu gai kớch thước khoảng 25 x 25 àm (5) riờng lẻ hoặc tập trung thành đỏm Mảnh mạch xoắn (2) và mạch điểm (3a, 3b) Hạt tinh bột đơn, hỡnh trũn đường kớnh khoảng 25 àm (4). Lụng che chở đơn bào dài khoảng 300 àm (7) (Hỡnh 3.6).
Hình 3.6 Đặc điểm bột lá loài Nho rừng
Chú thích: 1a,1b Tinh thể calci oxalat hình kim; 2 Mạch xoắn; 3a,3b Mạch điểm; 4 Hạt tinh bột; 5 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 6 Mảnh mạch; 7 Lông che chở.
Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học
3.2.1 Kết quả định tính Định tính các nhóm chất chính trong phần trên mặt đất của loài Nho rừng cho thấy sự có mặt của các nhóm chất như flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất béo và sterol (Bảng 3.1).
Bảng 3.1 Kết quả định tính phần trên mặt đất của loài Nho rừng
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả
Phản ứng với TT Mayer -
Phản ứng với TT Dragendorff -
Phản ứng với TT Bouchardat -
5 Coumarin Phản ứng mở và đóng vòng lacton -
Phản ứng với chì acetat 10% ++
Phản ứng với đồng acetat ++
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 -
9 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin 3% ++
10 Đường khử Phản ứng với TT Fehling +
11 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol ++
12 Chất béo Vết mờ trên giấy bóng kính +
13 Sterol Phản ứng Liebermann-Burchardat ++
14 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc -
(-) Phản ứng âm tính; (+) Phản ứng dương tính; (++) Phản ứng dương tính rõ
3.2.2 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất
Quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ phần trên mặt đất loài Nho rừng được tóm tắt trong sơ đồ 3.1, sơ đồ 3.2, và sơ đồ 3.3.
Phần trên mặt đất Nho rừng
(1,5 kg) Chiết hồi lưu EtOH 96%, 3 lần x 3h
Phân tán trong nước, lắc lần lượt với n- hexan và EtOAc
Sơ đồ 3 1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt đất loài Nho rừng
Phần trên mặt đất loài Nho rừng được phơi khô, cắt nhỏ (1,5 kg) và chiết hồi lưu với ethanol 96% (3 h × 3 lần × 36 l) Lọc, gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol (VH, 68,11 g) Phân tán cắn trong nước nóng (tỉ lệ 1:1), chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi là n-hexan và ethyl acetat Các phân lớp được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn tương ứng là n- hexan (VHH, 7,83 g), ethyl acetat (VHE, 39,16 g) và cắn nước (13,43 g).
Cắn VHE (34,0 g) được tiến hành phân lập bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung môi DCM-MeOH (100:1-1:100, v/v), thu được 7 phân đoạn (VHE1- VHE7) Phân đoạn VHE4 (1,5 g) được phân lập trên cột sắc ký pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (20:1, v/v) thu được hợp chất VH4 (13,0 mg) và 4 phân đoạn (VHE4.1-VHE4.4) Phân đoạn VHE4.2 (200,0 mg) được rửa bằng hệ DCM-MeOH (1:1, v/v) thu được hợp chất VH1 (50,0 mg) Phân đoạn VHE4.3 (150 mg) được rửa giải trên cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H 2 O (2:1, v/v) thu được
2 hợp chất VH5 (13,0 mg) và VH6 (40,0 mg) Phân đoạn VHE5 (1,2 g) được phân lập trên cột sắc ký pha thường sử dụng hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (15:1, v/v) thu được 10 phân đoạn (VHE5.1-VHE5.10) Phân đoạn VHE5.3 (100 mg) rửa giải trên cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H2O (5:1, v/v) thu được hợp chất VH7 (25,0 mg). Phân lập phân đoạn VHE5.4 (500 mg) trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (1:2, 1:1, 2:1, v/v) thu được 3 hợp chất VH8 (25,0 mg), VH10 (13,0 mg) và VH9 (22,0 mg), cùng 5 phân đoạn (VHE5.4.1-VHE5.4.5) Phân đoạn VHE5.4.3 (120 mg) rửa giải trên cột MCI với hệ dung môi MeOH-H 2 O (3:2, v/v) thu được hợp chất VH11 (14,0 mg) Phân đoạn VHE6 (300 mg) được phân lập trên cột Sephadex với hệ dung môi MeOH- H2O (1:1, v/v) thu được 2 hợp chất VH2 (12,0 mg) và VH3 (25,0 mg) Phân đoạn VHE7 (500 mg) được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo,rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (8:2, v/v) thu được hợp chất VH12 (15,0 mg).Phân tách VHH (6,0 g) bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung môiDCM- MeOH (50:1-30:1, v/v), thu được 12 phân đoạn (VHH1-VHH12) Phân đoạnVHH2 (135 mg) được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (6:1, v/v) thu được hợp chất VH13 (30,0 mg) Phân đoạn VHH3 (2,33 g) được phân tách bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexan-aceton(7:1, v/v) thu được 8 phân đoạn (VHH3.1-VHH3.8) Phân đoạn VHH3.3 kết tinh trong aceton thu được hợp chất VH14 (105,0 mg) Phân đoạn VHH9, VHH10 kết tinh trong aceton, lần lượt thu được hợp chất VH15 (100 mg) và VH16 (61,0 mg).
Silica gel, DCM – MeOH (20:1, v/v) MeOH- H 2 O (1:1, v/v) C-18, Aceton –
(1:1, v/v) MeOH - H 2 O (2:1, v/v) Sephadex Silica gel, DCM – MeOH (15:1, v/v)
Sơ đồ 3 2 Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat của loài Nho rừng (V heyneana)
Me 2 CO – H 2 O (6:1, n-hexan - Me 2 CO (7:1,
Rửa / Me 2 CO Rửa / Me 2 CO
Cao n-hexan (6,6 g) Silica gel, DCM – MeOH (50:1, 40:1, 30:1 v/v)
Silica gel, n-hexan - Aceton (7:1, v/v) Kết tinh, Aceton Kết tinh, Aceton
VHH1 VHH2 VHH3 VHH4- VHH9 VHH10 VHH11-
Sơ đồ 3 3 Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan của loài Nho rừng (V heyneana)
Bột kết tinh màu kem; t o nc: 261-263ºC; ESI-MS m/z: 227,1 [M-H] - ; dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR: Xem bảng 3.2.
Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất VH1 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH1
C/H C* Ca,b Ha,c (độ bội, J = Hz)
* C của resveratrol đo trong CD 3 OD, 75 MHz [217]; a Đo trong CD 3 OD, b 125 MHz, c 500 MHz
Phổ khối ESI-MS có pic ion tại m/z 227,1 [M-H]- (negative) cho biết khối lượng phân tử của VH1 là M = 228, dự đoán công thức phân tử là C14H12O3, gợi ý là một hợp chất stilben Phổ 1 H-NMR xuất hiện các cặp tín hiệu proton đặc trưng cho một stilben khung resveratrol (có hai vòng thơm và một nối đôi) ở δ H 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, H-6), 6,18 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,79 (2H, d, J
= 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,83 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-α), 6,96 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-β), hằng số tương tác J = 16,0 Hz giữa H- α và H- β chứng tỏ sự tồn tại ở cấu hình trans của hợp chất resveratrol Phổ 13 C-NMR chỉ rõ sự có mặt của ba carbon vòng thơm liên kết với hydroxy xuất hiện ở δ C 159,6 (C-3, C-5) và 158,3 (C-4′) cùng với 11 carbon lai hóa sp 2 ở trong khoảng δ C 102,7-140,9 Trên cơ sở dữ kiện phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và tài liệu đã công bố [217], cấu trúc của VH1 được xác định là trans-3,5,4′- trihydroxystilben hay trans- resveratrol (Hình 3.7).
Tinh thể hình kim màu trắng; t o nc: 223-226ºC; ESI-MS m/z: 413,1 [M+Na] + ; phổ
Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất VH2 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH2
C/H C& C* Ca,b Ha,c (độ bội, J = Hz)
& C của VH1 đo trong CD 3 OD, 125 MHz, * C của piceid đo trong CD 3 OD, 150 MHz [218]; a Đo trong CD 3 OD, b 125 MHz, c 500 MHz
Phổ khối ESI-MS của VH2 cho pic ion tại m/z 413,1 [M+Na] + (positive) cho biết khối lượng phân tử của VH2 là M = 390, dự đoán công thức phân tử là C20H22O8 Phổ
1H-NMR của hợp chất VH2 tương tự như hợp chất VH1 Tuy nhiên VH2 còn xuất hiện thêm các tín hiệu của gốc đường glucose ở H 3,39-4,92 Tín hiệu proton anomer tại H 4,92 với hằng số tương tác cao (J = 7,5 Hz) chứng tỏ rằng cấu hình của gốc đường là β Sự chuyển dịch về trường thấp của proton thơm ở vị trí số 2 trong VH2
VH1 (H 6,47) gợi ý vị trí của gốc đường tại C-2 Phổ 13 C-NMR của VH2 xuất hiện thêm 6 tín hiệu carbon của một gốc đường glucose [C 102,4 (C-1ʺ), 78,2 (C-5ʺ), 78,1 (C- 3ʺ), 75,0 (C-2ʺ), 71,5 (C-4ʺ) và 62,6 (C-6ʺ)] ngoài 14 tín hiệu carbon của khung resveratrol Từ các dữ liệu phổ NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo [218] cho phép xác định VH2 là trans -resveratrol-3- O - β -ᴅ-glucosid với tên gọi khác là piceid hay polydatin (Hình 3.8).
Chất rắn màu nâu xám; t o nc: 301-302ºC; [α] 25 D = +132,9 (MeOH); ESI-MS m/z 929,3 [M+Na] + ; dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR: Xem bảng 3.4.
Hình 3.9 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất
VH3 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH3
C/H C* H* (độ bội, J = Hz) Ca,b Ha,c (độ bội, J = Hz)
* C, H của và 2-r-viniferin đo trong aceton-d 6, 100 MHz/400 MHz [219]; a Đo trong aceton-d 6 , b 125 MHz, c 500 MHz
Phổ khối ESI-MS cho peak ion tại m/z 929,3 [M+Na]+ (positive) cho biết khối lượng phân tử của VH3 là M = 906, cùng với phổ NMR cho thấy công thức phân tử là
C56H42O12, dựa đoán là một tetramer stilben Phổ 1 H-NMR cũng cho tín hiệu đặc trưng của một tetramer resveratrol với 23 tín hiệu proton của vòng thơm tại δ H 6,06-7,18 trong đó có 3 vòng thơm thế AA′BB′; 1 vòng thơm thế AA′M; hai tín hiệu của methin olefin δ H 6,39 (2H, s, H-7′, H-8′); hai tín hiệu proton oxymethin tại δ H 5,88 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-7‴), 5,35 (1H, brd, H-7), hai tín hiệu proton methin tại δ H 4,39 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-8), 4,24 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-8‴) gợi ý sự xuất hiện của hai vòng benzofuran và hai tín hiệu proton methin olefin tại δ H 5,48 (1H, s, H-8″), 5,36 (1H, s, H-7″) Trên phổ 13 C- NMR cho tín hiệu của 56 carbon tương ứng với một tetramer resveratrol (C14H13O3); kết hợp với phổ DEPT cho thấy xuất hiện tín hiệu của 12 carbon tại δ C 155,2-160,5 đặc trưng cho carbon vòng thơm bị hydroxyl hóa và 38 carbon lai hóa sp 2 với δ C 96,0-147,1 Bốn tín hiệu carbon methin tại δ C 40,6-57,1 và hai tín hiệu carbon oxymethin tại δ C 93,8 (C-7), 88,4 (C-7‴) Tương tác trên phổ HSQC, HMBC cho phép xác định các vị trí carbon-proton của bốn đơn vị resveratrol Trên phổ HMBC xuất hiện sự tương tác giữa H-7, H-8 với C-10′, C-11′, giữa H-7‴, H-8‴ với C-10″, C-11″ cho thấy sự xuất hiện của hai vòng benzofuran Tương tác giữa H-7″ với C-9‴, C-10‴ gợi ý sự xuất hiện của vòng 7 cạnh Ngoài ra còn có sự tương tác giữa H-8″ và C-3′ gợi ý cho việc xác định cấu trúc của VH3 Từ kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, MS, so sánh tài liệu [219] có thể kết luận chất VH3 là 2- r -viniferin (Hình
Chất rắn màu trắng, [α] 25 D = +28,9 (MeOH); ESI-MS m/z: 453,1 [M+H] + , 475,2 [M+Na] + ; dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR: Xem bảng 3.5.
Hình 3.10 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất
VH4 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH4 C/H C* H * (độ bội, J = Hz) Ca,b H a,c (độ bội, J = Hz)
* C, H của và betulifol A đo trong pyridin-d 5 , 100 MHz/400 MHz [29]; a Đo trong aceton-d 6 , b 125 MHz, c 500 MHz
Phổ khối ESI-MS xuất hiện các peak ion ở m/z 453,1 [M+H]+, 475,1 [M+Na]+ cho thấy khối lượng phân tử của hợp chất VH4 là M = 452, tương ứng với công thức phân tử là C28H24O8, gợi ý đây là một dimer stilben Phổ NMR mang đặc điểm của nhóm stilben, trong đó phổ 1 H-NMR xuất hiện 8 tín hiệu proton, phổ 13 C-NMR xuất hiện 14 tín hiệu carbon Từ phổ MS và số lượng tín hiệu trên phổ NMR, gợi ý đây là một dimer stilben có cấu trúc đối xứng Phổ 1 H-NMR xuất hiện 6 tín hiệu proton của vòng thơm đặc trưng cho hai vòng thơm của một đơn vị resveratrol tại δ H 7,57 (4H, d,
J = 8,5 Hz, H-2, H-6, H-2′, H-6′), 6,94 (4H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5, H-3′, H-5′), 6,18 (2H, d, J 2,0 Hz, H-12, H-12′), 6,16 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-14, H-14′), một tín hiệu proton oxymethin tại δ H 5,47 (2H, d, J = 11,0 Hz, H-7, H-7′) và một tín hiệu proton methin tại δ H 4,53 (2H, d, J = 11,0 Hz, H-8, H-8′) gợi ý sự đóng vòng benzofuran giữa hai đơn vị resveratrol Kết hợp phổ 13 C-NMR và phổ DEPT cho thấy tín hiệu đặc trưng cho 3 carbon vòng thơm bị hydroxy hóa tại δ C 160,1 (C-11, C-11′), 159,7 (C-13, C-13′),159,3 (C-4, C-4′) và 9 carbon lai hóa sp 2 ở δ C 96,9-137,3 đặc trưng cho hai vòng thơm của một đơn vị resveratrol, một carbon oxymethin tại δ C 93,7 (C-7, C-7′) và một carbon methin tại δ C 48,6 (C-8, C-8′) Dựa trên phổ HSQC xác định được vị trí carbon- proton của một đơn vị resveratrol Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa proton H-7,H-8 với C-10′, cho thấy có sự đóng vòng benzofuran giữa H-7, H-8 của một đơn vị resveratrol và C- 10, C-11 của đơn vị còn lại, đồng thời tương tác giữa proton H-14/H-
7814′ với C-8/C-8′ gợi ý sự hình thành vòng 6 cạnh giữa 2 đơn vị resveratrol, tạo nên cấu trúc đối xứng Từ
79 kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp với tài liệu [29], có thể kết luận hợp chất VH4 là betulifol A (Hình 3.10).
Bột màu vàng; [α] 25 D = +87,5 (MeOH); ESI-MS m/z: 429,1 [M+H] + , dữ liệu phổ
Hình 3.11 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất
VH5 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH5
C/H C* H* (độ bội, J = Hz) Ca,b Ha,c (độ bội, J = Hz)
* C, H của và vitisinol C đo trong aceton-d 6 , 125 MHz/500 MHz [44]; a Đo trong aceton-d 6 , b 125 MHz, c 500 MHz
Phổ khối ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 429,1 [M+H]+ (positive) cho thấy khối lượng phân tử của VH5 là M = 428, tương ứng với công thức phân tử là
C27H24O5 Phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của hai vòng thơm AA′BB′ tại δ H
5′), 7,32 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2′, H-6′); tín hiệu δ H 6,07 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-12) và 6,08 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-10, H-14) đặc trưng cho vòng AA′M Ngoài ra còn có tín hiệu multiplet tại δ H 3,29 (1H, m, H-7), 3,23 (1H, m, H-8) đặc trưng cho proton methin, hai tín hiệu proton methylen tại δ H 3,01 (2H, m, H-12′) và 3,11 (2H, m, H-13′), một tín hiệu proton olefinic methin tại δ H 6,24 (1H, s, H-10′) đặc trưng cho nối đôi nội vòng, hai tín hiệu proton olefinic methin tại δ H 6,71 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7′), 6,86 (1H, d, J
= 16,0 Hz, H-8′) với hằng số tương tác J = 16,0 cho thấy hai proton liên kết nối đôi với cấu hình trans Phổ 13 C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 1 carbon carbonyl tại δ C
204,2, 4 carbon vòng thơm bị hydroxy hóa tại δ C 157,1-158,5 và 11 carbon lai hóa sp 2 của carbon không no tại δ C 106,0-147,3 đặc trưng cho ba vòng thơm, trong đó có 2 vòng AA′BB′ và một vòng AA′M, ba carbon olefinic methin tại δ C 135,6 (C-7′), 127,7 (C-8′), 129,5 (C-10′) và một carbon bậc 4 nối đôi tại δ C 155,4 (C-9′) đặc trưng cho một nối đôi nội vòng và một nối đôi ngoại vòng, hai carbon methylen tại δ C 33,6 (C-13′), 49,2 (C- 12′) và hai carbon methin tại δ C 51,7 (C-8), 45,6 (C-7) Trên phổ HMBC cho thấy các carbon - proton methylen, methin và methin olefin nội vòng có tương tác với nhau, proton methylen δ H 3,01 (H-12′) tương tác với carbon carbonyl δ C 204,2 (C-11′), proton methin δ H 3,23 (H-8) tương tác với carbon olefinic δ C 155,4 (C-9′) gợi ý có sự xuất hiện của vòng 7 cạnh Tương tác giữa proton olefin δ H 6,86 (H-8′) với carbon olefinic δ C 129,5 (C-10′) và carbon methylen δ C 33,6 (C-13′) cho thấy nối đôi gắn vào vòng 7 cạnh tại vị trí carbon nối đôi bậc 4 Từ các dữ liệu phổ, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo
[44] có thể xác định VH5 là vitisinol C (Hình 3.11).
Chất rắn màu nâu xám; tºnc: 150-152ºC; [α] 25 D = -47,0 (MeOH); ESI-MS m/z:
477,1 [M+Na] + ; dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR: Xem bảng 3.7.
Hình 3.12 Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY (─), HMBC chính (→) của hợp chất VH6
Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH6
C/H C* H* (độ bội, J = Hz) Ca,b Ha,c (độ bội, J = Hz)
* C, H của (-)-trans-ε-viniferin đo trong aceton-d 6 , 100 MHz/400 MHz [28]; a Đo trong aceton-d 6 , b 125 MHz, c 500
Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học
3.3.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm
3.3.1.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro a Tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết phần trên mặt đất loài Nho rừng
Tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết EtOH 96% (VH) và các cao phân đoạn n-hexan (VHH), ethyl acetat (VHE) và phân đoạn nước (VHW) của Nho rừng được thể hiện qua hình 3.22 và bảng 3.17.
Hình 3.22 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol 96% và 3 phân đoạn từ phần trên mặt đất
Nho rừng lên mức độ biểu hiện COX-2 mRNA.
***: p < 0,001 khi so sánh với lô chứng DMSO, # : p < 0,05 khi so sánh với lô đối chứng dương LPS.
Bảng 3.17 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế COX-2 của cao ethanol 96% và 3 cao phân đoạn phần trên mặt đất Nho rừng
STT Mẫu Mức độ biểu hiện COX-2 mRNA
2 Mẫu đối chứng dương LPS (5 àg/ml) 6,25 ± 0,56 ***
3 LPS (5 àg/ml) + VH (50 àg/ml) 2,85 ± 0,31 #
4 LPS (5 àg/ml) + VHH (50 àg/ml) 3,78 ± 0,91
5 LPS (5 àg/ml) + VHE (50 àg/ml) 2,38 ± 0,47 #
6 LPS (5 àg/ml) + VHW (50 àg/ml) 4,86 ± 1,39
Trong đó: Tác dụng ức chế COX-2 in vitro được trình bày dưới dạng M ± SE với n = 6,
M là giá trị trung bình của các lần thí nghiệm, SE là sai số chuẩn ***: p < 0,001 khi so sánh với lô chứng, # : p < 0,05 khi so sánh với lô đối chứng dương.
Mức độ biểu hiện COX-2 mRNA ở mẫu chứng không thêm lipopolysaccharid xấp xỉ 1 và khi tế bào bị kớch thớch viờm bởi LPS 5 àg/ml thỡ mức độ biểu hiện COX-2 mRNA tăng lên 6,12 lần so với mẫu chứng (p < 0,001).
Cao VHH và VHW ở nồng độ 50 àg/ml làm giảm khụng đỏng kể mức độ biểu hiện COX-2 mRNA so với nhóm đối chứng dương, mức độ biểu hiện COX-2 mRNA lần lượt là 3,78 ± 0,91 và 4,86 ± 1,39 Trong khi cao VHE và VH (50 àg/ml) đều làm giảm có sai số thống kê mức độ biểu hiện COX-2 mRNA so nhóm đối chứng dương, mức độ biểu hiện COX-2 mRNA lần lượt là 2,38 ± 0,47 (p