LUẬN án TIẾN sĩ dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây thuốc thượng

LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận án Viện Dược liệu, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy, cô, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực bạn bè đồng nghiệp gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Thanh Kỳ TS Nguyễn Xuân Nhiệm, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực luận án Xin bày tỏ lòng cảm ơn tới: PGS.TS Phạm Thanh Huyền, TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, ThS Nguyễn Quỳnh Nga, ThS Hồng Văn Tốn - Viện Dược liệu; TS Bùi Văn Thanh - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật; TS Nguyễn Hoàng Ngân - Học viện Quân y có ý kiến đóng góp q báu giúp tơi hồn thiện luận án Xin trân trọng cảm ơn đồng nghiệp Khoa Tài nguyên dược liệu, Phòng Quản lý khoa học đào tạo - Viện Dược liệu; Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Dược lý, Bộ môn Giải phẫu bệnh - Học viện Quân y; Khoa Dược - Viện YHCT Quân đội; Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ cộng tác để hoàn thành luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình ln ủng hộ, chia sẻ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Tác giả LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng cơng trình khác Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ việc hoàn thành luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn luận án ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu luận án MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN Mục lục I Danh mục bảng VI Danh mục hình VIII ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật phân bố chi Phaeanthus Hook f & Thomson .3 1.1.1 Vị trí phân loại chi Phaeanthus Hook f & Thomson 1.1.2.Phân bố thành phần loài chi Phaeanthus Hook f & Thomson 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Phaeanthus Hook f & Thomson .8 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian 16 1.4 Tác dụng sinh học 16 1.4.1 Tác dụng chống viêm 16 1.4.2 Tác dụng giãn mạch máu 17 1.4.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng 18 1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa 20 1.4.5 Tác dụng gây độc tế bào ung thư 20 1.4.6 Tác dụng hệ miễn dịch 21 1.4.7 Tác dụng bệnh loét dày chống trầm cảm 22 1.5 Vài nét thuốc Thượng Việt Nam 22 1.5.1 Phân bố 23 1.5.2 Công dụng theo dân gian 23 1.5.3 Những nghiên cứu thuốc Thượng Việt Nam 24 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 I 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thẩm định tên khoa học xác định đặc điểm vi học 28 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 29 2.2.3 Thử độc tính số tác dụng sinh học 38 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 49 Chương 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 50 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 50 3.1.2 Thẩm định tên khoa học 51 3.1.3 Đặc điểm giải phẫu 52 3.1.4 Đặc điểm bột rễ, thân, 54 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 56 3.2.1 Hợp chất PV1: (7S,8R,8'R)-3,5,3′,5'-tetramethoxy-4,4',7-trihydroxy-9,9'epoxylignan (chất mới) 57 3.2.2 Hợp chất PV2=TC5: 8R,8′R-bishydrosyringenin 64 3.2.3 Hợp chất PV3=TC6:(+)-5,5'-dimethoxylariciresinol 66 3.2.4 Hợp chất PV4: (+)-pinoresinol 68 3.2.5 Hợp chất PV5: 8α-hydroxyoplop-11(12)-en-14-on (chất mới) 70 3.2.6 Hợp chất PV6: spathulenol 77 3.2.7 Hợp chất PV7: 1αH,5βH-aromandendrane-4β,10α-diol 79 3.2.8 Hợp chất PV8 = TC1: 1αH,5βH-aromandendrane-4α,10α-diol .80 3.2.9 Hợp chất PV9: 1βH,5βH-aromandendrane-4α,10β-diol 82 3.2.10 Hợp chất PV10: 3α,4β-dihydroxybisabola-1,10-dien 84 3.2.11 Hợp chất PV11: nerolidol 86 3.2.12 Hợp chất PV12:(1R,2S,4S)-2-E-cinnamoyloxy-4-acetyl-1methylcyclohexan-1-ol (chất mới) 88 3.2.13 Hợp chất PV13=TC2: N-methylcorydaldin 94 3.2.14 Hợp chất PV14=TC3: thalifolin 95 II 3.2.15 Hợp chất PV15 = TC4: moupinamid 97 3.3 Kết nghiên cứu độc tính tác dụng sinh học 99 3.3.1 Độc tính cấp bán trường diễn CL1 CL2 99 3.3.2 Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm cao lỏng CL1 CL2 107 3.3.3 Kết nghiên cứu tác dụng giảm đau cao lỏng CL1 CL2 .113 3.3.4 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập 116 3.3.5 Kết xác định hoạt tính kháng viêm in vitro hợp chất phân lập 118 Chương 4- BÀN LUẬN 119 4.1 Về thực vật học 119 4.2 Về thành phần hóa học 120 4.3 Về độc tính tác dụng sinh học 125 4.3.1 Độc tính cấp 126 4.3.2 Độc tính bán trường diễn 127 4.3.3 Tác dụng chống viêm 127 4.3.4 Tác dụng giảm đau 131 4.3.5 Hoạt tính hợp chất phân lập từ thuốc Thượng 133 KẾT LUẬN 138 1.1.Về thực vật học 138 1.2.Về thành phần hóa học 138 1.3.Về độc tính tác dụng sinh học 138 KIẾN NGHỊ 140 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 II Danh mục chữ viết tắt Kí hiệu Tiếng Anh C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance A-549 Lung adenocarcinoma epithelial cell APG Angiosperm Phylogeny Group System NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs LPS Lipopolysaccharide Diễn giải Cộng hưởng tư hạt nhân carbon 13 Cộng hưởng tư hạt nhân proton NO Nitric oxide Nitric oxid CD Circular Dichroism Phổ lưỡng sắc tròn [α]D Specific Optical Rotation Độ quay cực riêng LD50 Lethal dose 50 OD Optical Density Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm Mật độ quang học CC DEPT Column chromatography Sắc kí cột Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid 13 DMEM DMSO FRAP Ferric Reducing Ability Plasma HeLa HepG2 HL-60 HMBC HSQC Tế bào ung thư phổi Hệ thống phân loại thực vật có hoa đại Thuốc chống viêm khơng steroid Lipopolysaccharid +3 in Khả khử Fe huyết tương Human henrietta lack cell Tế bào ung thư cổ tử cung người Human hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người cell Human acute myelocytic Tế bào ung thư bạch cầu người leukemia cell Heteronuclear multiple Bond Tương tác dị nhân đa liên kết Connectivity Heteronuclear Coherence Single-Quantum Tương tác dị nhân lượng tử đơn IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm epidermoid Tế bào ung thư biểu mô người KB LNCaP Human mouth carcinoma cell Human prostatic carcinoma cell LU-1 MCF-7 NF-B OVCAR-3 RP-18 SRB TLC TMS WHO Human lung carcinoma cell Human breast carcinoma cell Nuclear Factor-kappa B Ovarian carcinoma cell Reserve phase C-18 Sulforhodamine B Thin layer chromatography Tetramethylsilane World Health Organization Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người Tế bào ung thư phổi người Tế bào ung thư vú người Yếu tố nhân kappa B Tế bào ung thư buồng trứng Chất hấp phụ pha đảo C-18 Sulforhodamine B Sắc ký lớp mỏng Tetramethylsilan Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân bố loài thuộc chi Phaeanthus Bảng 1.2 Các alcaloid benzyl isoquinolin tư loài thuộc chi Phaeanthus 10 Bảng 1.3 Các alcaloid isoquinolin tư loài thuộc chi Phaeanthus 12 Bảng 1.4 Các alcaloid khác tư loài thuộc chi Phaeanthus 13 Bảng 1.5 Các hợp chất khác tư loài thuộc chi Phaeanthus 14 Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV1 59 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV2 hợp chất tham khảo 65 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV3 hợp chất tham khảo 67 Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV4 hợp chất tham khảo 69 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV5 hợp chất tham khảo 71 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV6 hợp chất tham khảo 78 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV7 hợp chất tham khảo 80 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV8 hợp chất tham khảo 81 Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV9 hợp chất tham khảo 83 Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV10 hợp chất tham khảo 85 Bảng 3.11 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV11 hợp chất tham khảo 86 Bảng 3.12 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV12 90 Bảng 3.13 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV13 hợp chất tham khảo 95 Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV14 hợp chất tham khảo 96 Bảng 3.15 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR PV15 hợp chất tham khảo 98 Bảng 3.16 Độc tính cấp theo đường uống CL1 chuột nhắt trắng (n=12) .99 Bảng 3.17 Độc tính cấp theo đường uống CL2 chuột nhắt trắng (n=12) 101 Bảng 3.18 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 điện tim chuột cống (n=8) .103 Bảng 3.19 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 lên số tiêu huyết học (n=8) 104 Bảng 3.20 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 chức gan thận (n=8) .105 Bảng 3.21 Đường kính khớp cổ chân chuột cống trắng (n=10) 108 Bảng 3.22 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 tới tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột cống (n=10) 110 Bảng 3.23 Tỷ lệ % ức chế phù bàn chân chuột cống (I%) (n=10) 111 Bảng 3.24 Tác dụng giảm khối lượng u hạt cao lỏng (n=10) 112 Bảng 3.25 Ngưỡng đau tổ chức viêm cấp bàn chân chuột cống đánh giá tác dụng cao lỏng CL1 CL2 (n=10) 113 Bảng 3.26 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 tới số đau quặn chuột nhắt mơ hình gây đau quặn acid acetic (n=10) 114 Bảng 3.27 Ảnh hưởng cao lỏng CL1 CL2 tới thời gian đáp ứng đau chuột nhắt trắng (n=10) 115 Bảng 3.28 Tác dụng gây độc tế bào ung thư hợp chất 117 Bảng 3.29 Tác dụng ức chế sản sinh NO hợp chất 118 VII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chất tư thuốc Thượng 36 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập chất tư thân cành thuốc Thượng .37 Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái thuốc Thượng .50 Hình 3.2 Vi phẫu rễ thuốc Thượng 52 Hình 3.3 Vi phẫu thân thuốc Thượng .53 Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu thuốc Thượng 54 Hình 3.5 Đặc điểm bột rễ thuốc Thượng .55 Hình 3.6 Đặc điểm bột thân thuốc Thượng 55 Hình 3.7 Đặc điểm bột thuốc Thượng 56 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học PV1 hợp chất tham khảo (PV1a) 57 Hình 3.9 Các tương tác HMBC NOESY hợp chất PV1 58 Hình 3.10 Phổ CD hợp chất PV1 58 Hình 3.11 Phổ HR-ESI-MS hợp chất PV1 .60 Hình 3.12 Phổ 1H-NMR hợp chất PV1 60 Hình 3.13 Phổ 13C-NMR hợp chất PV1 61 Hình 3.14 Phổ HSQC hợp chất PV1 61 Hình 3.15 Phổ HMBC hợp chất PV1 62 Hình 3.16 Phổ COSY hợp chất PV1 62 Hình 3.17 Phổ NOESY hợp chất PV1 63 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học hợp chất PV2 64 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC PV3 66 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC PV4 68 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học hợp chất PV5 hợp chất tham khảo .70 Hình 3.22 Các tương tác HMBC NOESY hợp chất PV5 72 Hình 3.23 Phổ HR-ESI-MS hợp chất PV5 72 Hình 3.24 Phổ 1H-NMR hợp chất PV5 73 VIII 14.3 Phổ 13C-NMR hợp chất PV13 14.4 Phổ DEPT hợp chất PV13 14.5 Phổ HSQC hợp chất PV13 14.6 Phổ HMBC hợp chất PV13 14.7 Phổ 1H hợp chất TC2 15 Phụ lục phổ hợp chất PV14 - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C11H13NO3 - Khối lượng phân tử: M = 207 - Phổ HR-ESI-MS: m/z 208,0968 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C11H14NO3]+, 208,0968) - Phổ NMR đo dung môi CD3OD - Phổ 1H-NMR (400 MHz) - Phổ 13C-NMR (100 MHz) - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC 15.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất PV14 15.2 Phổ 1H-NMR hợp chất PV14 15.3 Phổ 13C-NMR hợp chất PV14 15.4 Phổ DEPT hợp chất PV14 15.5 Phổ HSQC hợp chất PV14 15.6 Phổ HMBC hợp chất PV14 15.7 Phổ 1H hợp chất TC3 16 Phụ lục phổ hợp chất PV15 - Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: C18H19NO4 - Khối lượng phân tử: M = 313 - Phổ HR-ESI-MS: m/z 314,1370 [M+H]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức [C18H20NO4]+, 314,1387) - Phổ NMR đo dung môi CD3OD - Phổ 1H-NMR (400 MHz) - Phổ 13C-NMR (100 MHz) - Phổ DEPT - Phổ HSQC - Phổ HMBC 16.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất PV15 16.2 Phổ 1H-NMR hợp chất PV15 16.3 Phổ 13C-NMR hợp chất PV15 16.4 Phổ DEPT hợp chất PV15 16.5 Phổ HSQC hợp chất PV15 16.6 Phổ HMBC hợp chất PV15 16.7 Phổ HMBC dãn hợp chất PV15 16.8 Phổ 1H hợp chất TC4 ... đích nghiên cứu cách hệ thống đầy đủ, thành phần hóa học tác dụng sinh học thuốc Thượng, luận án thực với tên: ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học thuốc Thượng. .. nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, đánh giá độc tính tác dụng chống viêm, giảm đau thuốc Thượng cần thiết có ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ... định tên khoa học xác định đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học mẫu nghiên cứu - Chiết xuất phân lập số chất phận - Thử độc tính số tác dụng sinh học (chống viêm, giảm đau, gây độc số dòng tế bào