3 real time pcr

REAL TIME PCR (REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Kim Thạch BM Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch E-mail: nguyenkimthach@pnt.edu.vn 1 Nguyên lý hai hệ thống phát huỳnh quang Phương pháp định lượng tuyệt đối Lịch sử 1991-1993: Holland cộng khám phá khả hoạt động 5’nuclease Taq polymerase, sử dụng probe đánh dấu 32P 1992-1993: Higuchi v cộng  phn tích động học sản phẩm PCR Sử dụng ethidium bromide + ultraviolet + computer + CCD camera (charge coupled device camera) 1993: Lee cộng thiết kế probe gồm quencher & reporter Sử dụng hiệu ứng FRET (Forster resonance energy transfer) Real-time Polymerase Chain Reaction (PHẢN ỨNG TỔNG HỢP CHUỖI NUCLEOTID THỜI GIAN THỰC) • Kỹ thuật sinh học phân tử giúp định lượng DNA RNA • Theo dõi tiến triển phản ứng PCR theo chu kỳ • Nguyên tắc so sánh chu kỳ với điểm lượng sản phẩm PCR nhận nhờ tín hiệu phát huỳnh quang • Số lượng copy tăng dẫn đến gia tăng tín hiệu huỳnh quang Ưu điểm dùng Real-time PCR PCR cổ điển định lượng pha đỉnh (plateau phase) Realtime PCR cho phép thu thập liệu định lượng pha lũy tiến (exponential growth phase) 2n AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 10 15 20 25 PCR CYCLE NUMBER 30 35 10000000000 10000000000 1000000000 1000000000 100000000 100000000 10000000 10000000 1000000 1000000 100000 100000 10000 10000 1000 1000 100 100 10 10 1 10 AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA • Sự gia tăng tính hiệu Fluorescent tỉ lệ với gia tăng số • Một phân tử probe tách đảm bảo xác phiên chép hồn thành 15 10 20 15 25 20 30 25 PCR CYCLEPCR NUMBER CYCLE NUMBER 3530 • Tăng độ đặc hiệu phản ứng PCR • Khơng có giai đoạn sau PCR cổ điển • Phát biểu sai lệch lần Nguyên tắc hoạt động máy Realtime PCR Bộ lọc đơn sắc Bộ lọc đơn sắc Cáp quang học đồng trục Đèn Halogen đĩa lọc ánh sáng trắng dùng hiệu chuẩn PMT Đầu đọc quét giếng Bộ lọc xoay chuyển tương thích theo giếng 96 Well Plate Bộ lọc đơn sắc Bộ lọc đơn sắc Nắp nhiệt Hệ thống luân nhiệt Đèn Tungsten/Halogen Cáp quang cánh tay robot Fluorophore Quencher Fluorophore gắn với Quencher khác Phổ hấp thụ Quencher phải trùng với phổ phát quang Fluorophore Có chế ức chế phát quang Ức chế gần: Deep Dark quencher (Eurogentec), Dabsyl (Nasarabadi) Flourophore gần kề Quencher lượng truyền từ Flourophore sang quencher Năng lượng chuyển thành nhiệt không phát quang Ức chế FRET: Flourophore truyền lượng sang Quencher Năng lượng bị phân rã Hiệu phát quang tùy thuộc vào khoảng cách Flourophore Quencher Hydrolysis probes: Ưu Nhược điểm Ưu điểm: Đặc hiệu cao: tính hiệu q trình lai giảm xuất bắt cặp sai bắt cặp primer Hiệu phản ứng multiplex: phản ứng multiplex xác định phát huỳnh quang probe khác Nhược điểm: Taqman probe phù hợp linh động so với loại khác kỹ thuật realtime để xác định đột biến Nguyên tắc thiết kế probe đòi hỏi nhiều chi tiết Thiết kế Probe Chiều dài 30 bases Số lượng G-C chiếm 50 % Các probe không trùng lấp bổ sung với primer Probes không chứa G đầu kết thúc 5’ Tm cao 5-10°C so với primer Hybridisation probes (HybProbes) Ưu điểm: - Đặc hiệu cao - Linh động cao thiết kế - Probe không bị phá hủy dùng lại sau chu kỳ Nhược điểm: thiết kế Taqman probe Molecular beacons - Đặc hiệu độ xác cao - Nhiệt độ phản ứng < Tm, cấu trúc kẹp tóc  khơng lai, khơng tín hiệu huỳnh quang Scorpion primer - Blocker HEG ngăn chặn tái phân tử beacon - Một kỹ thuật tốt So sánh hiệu phát quang Probe Scorpion Beacon TaqMan Đồ thị khuếch đại tính hiệu Baseline – chu kỳ đầu PCR, nơi có thay đổi tín hiệu fluorescence Threshold – cắt ngang đồ thi khuếch xác đinh CT Có thể cài đặt tay tự động CT – (cycle threshold) tín hiệu phát quang cắt ngang threshold số chu kỳ Passive reference dye - ROX Rn – (normalized reporter) Rn – (Rn- baseline) NTC – no template control – cho phép xác định ngoại nhiễm vào phản ứng khuếch đại Giải thích kết a) Plateau phase (pha đỉnh) b) Linear phase (pha thẳng) c) Exponential phase (pha lũy tiến) d) Background e) Baseline (pha biên) Baseline Baseline Đường cong khuếch đại bắt đầu sau baseline lớn Baseline thấp Đường cong khuếch đại bắt đầu xa phía bên phải baseline lớn Giá trị tăng dần chu kỳ kết thúc Baseline cao Đường cong khuếch đại bắt đầu trước baseline lớn Giá trị giảm dần chu kỳ kết thúc Threshold Threshold Chọn Threshold đường cong khuếch đại pha lũy thừa Chọn Threshold độ lệnh chuẩn tối ưu Threshold thấp Chọn threshold pha lũy tiến đường khuếch đại Threshold cao Chọn threshold pha lũy tiến đường khuếch đại Phương pháp định lượng tuyệt đối Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) 250 200 150 100 50 Ct 106 105 104 103 102 101 0 10 20 30 40 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 atzA 18 23 28 33 38 Ct Cycle Cycle Ví dụ • Hiệu = 10(-1/hệ số góc) • Nếu hệ số góc = -3.32, Hiệu = (100%) -1/hệ số góc = -1/0.26  hệ số góc = - 3.846 Yêu cầu bắt buộc hệ số góc -3.32 đến -3.8 Hiệu = 10(0.26) –1 = 1.82 – = 0.82 ~ 82 % y = x (1 + E)n E=1 y=x 2n y = số gen thu x = số gen ban đầu E = hiệu n = số chu kỳ Khi E = : Ct = +  tăng x Ct= + 3.32  tăng x 10 R (Correlation Coefficient) Hệ số tương quan (x1,y1), (x2,y2), (xn,yn)  R n 1   n  x i  x  yi  y   i1  sxs y x  x  xn x n y  y  yn y n S (standard deviation): Độ lệch chuẩn     n 2 Sx  x x n1 n 2 Sy  y y n1 Yêu cầu bắt buộc R2 > 0.95  Lỗi lầm pipette  Khơng có tương quan Ct nồng độ LOG điểm chuẩn  Bị nhiễm yếu tố ức chế q trình pha lỗng điểm chuẩn Ví dụ: Standard Curve HCV điểm Ct UI logUI S1 29.19 3.0E+70 7.47712 S2 32.65 5.60E+60 6.74818 S3 36.04 1.50E+50 5.17609 S4 39.42 3.40E+40 4.45314 x  34.325, y  5.983 x  1192.724, y  37.192 S x  4.399, S y  1.363 R 29.1934.3257.4775.98332.6534.3256.7485.98336.0434.3255.1765.97339.4234.3254.4535.983 0.971141 ( 4.399)(1.363)