Tổng quan về FISH Tổng quan về FISH FISH (fluorescence in situ hydridization) – kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Là sự kết hợp chính xác của phép lai 1 đoạn oligonucleotit ( đầu dò) có gắn tín hiệu hu[.]
I Tổng quan FISH FISH (fluorescence in situ hydridization) – kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ Là kết hợp xác phép lai đoạn oligonucleotit ( đầu dị) có gắn tín hiệu huỳnh quang với trình tự ADN đích đặc trưng Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, phân tử huỳnh quang phát sáng với màu sinh động cho phép hiển thị đoạn ADN , nhiễm sắc thể hay tế bào đích Có thể nhận dạng, liệt kê định vị tế bào sinh vật mẫu môi trường tự nhiên hay mô bệnh phẩm II Quy trình thực FISH dị tìm phát trình tự acid nucleic loài vi sinh vật mong muốn cách dùng đầu dò đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với trình tự đích đặc hiệu bổ sung với bên tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào) Chuẩn bị đầu dị: • lựa chọn đầu dò lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang Chuẩn bị mẫu Lựa chọn đầu dị • Đầu dò: oligonucleotide dài từ 15-30 bp tạo từ thiết bị tổng hợp tự động, có trình tự bổ sung với rRNA 16s tế bào sinh vật • Xem xét đến tính đặc hiệu, độ nhạy & khả xâm nhập vào tế bào Lựa chọn đầu dị • rARN 16S: ổn định mặt di truyền, số lượng nhiều cấu trúc bán bảo tồn -> nhận biết định danh loài vi sinh vật trở nên dễ dàng Đánh dấu huỳnh quang (a) Đánh dấu đầu 5’ (b) gắn nucleotide đầu 3’ (c) Dùng chất thị DIG TSA (d) đánh dấu enzym (e) đầu dò polyribonucleotide HRP Bảng 1: Một số thuốc nhuộm sử dụng để dị tìm vi sinh vật phương pháp FISH Chuẩn bị mẫu Mẫu chứa vsv & đầu dò Chất tạo tủa: ethanol (methanol)