Luận án tiến sĩ nông nghiệp nâng cao năng suất sinh sản của lợn nái landrace và yorkshire thông qua chọn lọc bằng chỉ thị phân tử

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ VINH NÂNG CAO NĂNG SUẤT SINH SẢN CỦA LỢN NÁI LANDRACE VÀ YORKSHIRE THÔNG QUA CHỌN LỌC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ VINH NÂNG CAO NĂNG SUẤT SINH SẢN CỦA LỢN NÁI LANDRACE VÀ YORKSHIRE THÔNG QUA CHỌN LỌC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành : Chăn nuôi Mã số : 62 01 05 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Vũ Đình Tơn HÀ NỘI, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Vinh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS TS Vũ Đình Tơn tận tình hƣớng dẫn, đƣa nhiều ý kiến đóng góp q báu, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn GS Frederic Farnir – Đại học Liege, Vƣơng Quốc Bỉ có nhiều đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành tốt luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Chăn nuôi chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi- Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán công nhân viên Công ty TNHH Lợn giống hạt nhân DABACO (Tỉnh Bắc Ninh) Xí nghiệp Chăn ni lợn Đồng Hiệp (Thành phố Hải Phịng) tạo điều kiện sở vật chất giúp tơi hồn thành tốt luận án Xin chân thành cảm ơn dự án AI ARES – CCD (Dự án Việt Bỉ) tài trợ chuyến thực tập ngắn hạn Khoa Thú y, trƣờng đại học Liege, Vƣơng quốc Bỉ Xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Bộ môn Sinh học động vật, Bộ môn Di truyền giống vật nuôi giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Vinh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học vấn đề nghiên cứu 2.1.1 Giống công tác giống lợn 2.1.2 Tính trạng số lƣợng, di truyền tính trạng số lƣợng yếu tố ảnh hƣởng đến tính trạng số lƣợng 2.1.3 Các tiêu đánh giá suất sinh sản lợn nái 10 2.1.4 Những yếu tố ảnh hƣởng tới suất sinh sản 11 2.1.5 Các phƣơng pháp chọn lọc lợn 15 2.2 Áp dụng công nghệ sinh học công tác giống 17 2.2.1 Tại phải sử dụng công nghệ gen chăn nuôi? 17 2.2.2 Áp dụng công nghệ gen công tác chọn nhân giống lợn 18 2.2.3 Đặc điểm gen RNF4, RBP4 IGF2 27 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 28 2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 28 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 35 iii PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 44 3.2 Địa điểm nghiên cứu 44 3.3 Nội dung nghiên cứu 44 3.3.1 Đánh giá thực trạng suất sinh sản yếu tố ảnh hƣởng đến suất sinh sản đàn lợn nái Landrace Yorkshire nuôi sở nghiên cứu 3.3.2 44 Xác định tính đa hình (tần số alen tần số kiểu gen) gen RNF4, RBP4 IGF2 lợn nái Landrace Yorkshire 3.3.3 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 với suất sinh sản lợn nái Landrace Yorkshire 3.3.4 45 45 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 với sinh trƣởng suất thịt lợn hậu bị Landrace Yorkshire 45 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 3.4.1 Đánh giá thực trạng suất sinh sản yếu tố ảnh hƣởng đến suất sinh sản đàn lợn nái Landrace Yorkshire nuôi sở nghiên cứu 3.4.2 45 Xác định đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 quần thể lợn nái Landrace Yorkshire 3.4.3 48 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 với suất sinh sản lợn nái Landrace Yorkshire 3.4.4 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 với sinh trƣởng suất thịt lợn hậu bị Landrace Yorkshire PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 50 51 54 Năng suất sinh sản yếu tố ảnh hƣởng đến suất sinh sản đàn lợn nái Landrace Yorkshire nuôi sở nghiên cứu 54 4.1.1 Năng suất sinh sản lợn nái Landrace Yorkshire 54 4.1.2 Ảnh hƣởng yếu tố đến suất sinh sản 55 4.2 Đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 lợn nái Landrace Yorkshire 66 4.2.1 Đa hình gen RNF4 66 4.2.2 Đa hình gen RBP4 68 4.2.3 Đa hình gen IGF2 70 iv 4.3 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 với suất sinh sản lợn nái Landrace Yorkshire 4.3.1 Mối liên quan đa hình gen RNF4, RBP4 IGF2 với suất sinh sản 4.3.2 72 Tác động di truyền cộng gộp (a) trội (d) gen RNF4, RBP4 IGF2 đến suất sinh sản 4.3.3 86 Mối liên quan đa hình gen RNF4 RBP4 với suất sinh sản qua lứa đẻ 4.4 72 93 Mối liên quan đa hình gen RNF4 RBP4 với sinh trƣởng suất thịt lợn hậu bị Landrace Yorkshire 104 4.4.1 Mức độ ảnh hƣởng gen đến sinh trƣởng suất thịt 104 4.4.2 Mối liên quan đa hình gen RNF4 với sinh trƣởng suất thịt 105 4.4.3 Mối liên quan đa hình gen RBP4 với sinh trƣởng suất thịt 106 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 109 5.1 Kết luận 109 5.2 Đề nghị 110 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 111 Tài liệu tham khảo 112 Phụ lục 129 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt a Additive effect (ảnh hƣởng di truyền cộng gộp) ADN Axit deoxyribonucleic BF Backfat thickness (độ dày mỡ lƣng) cs Cộng d Dominance effect (ảnh hƣởng trội) IGF2 Insulin – like growth factors GLM General Linear Model (mơ hình tuyến tính tổng quát) KCLĐ Khoảng cách lứa đẻ KLSSO Khối lƣợng sơ sinh/ổ KLSSC Khối lƣợng sơ sinh/con KLCSO Khối lƣợng cai sữa/ổ KLCSC Khối lƣợng cai sữa/con LD Depth of longgissimus dorsal (độ dày thăn) LM Lean meat percentage (tỷ lệ nạc) LSM Least Square Mean (trung bình bình phƣơng nhỏ nhất) NDTT Nồng độ tinh trùng PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction - Restriction fragment length polymorphism (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) QTL Quantitative Trait Loci (cụm gen tính trạng số lƣợng) RNF4 Ring finger protein RBP4 Retinol binding protein SCSS Số sơ sinh/ổ SCSSS Số sơ sinh sống/ổ SCCS Số cai sữa/ổ SE Standard error: sai số chuẩn SNP Single nucleotide polymorphism (đa hình nucleotit đơn) TĐDLĐ Tuổi động dục lần đầu TĐLĐ Tuổi đẻ lứa đầu vi TGCS Thời gian cai sữa TLSSS Tỷ lệ sơ sinh sống TLSĐCS Tỷ lệ sống đế cai sữa TLTR Tỷ lệ trứng rụng TLKĐDL Tỷ lệ không động dục lại TPGLĐ Tuổi phối giống lần đầu TLTTT Tỷ lệ tinh trùng bình thƣờng TTTD Thể tích tinh dịch vii DANH MỤC BẢNG TT 2.1 Tên bảng Hệ số di truyền số tính trạng lợn 2.2 Kỹ thuật thị ADN 23 2.3 Marker liên quan đến sinh trƣởng chất lƣợng thịt lợn 24 2.4a Marker liên quan đến suất sinh sản lợn 25 2.4b Marker liên quan đến suất sinh sản lợn 26 3.1 Dung lƣợng mẫu đánh giá suất sinh sản 46 3.2 Dung lƣợng mẫu phân tích kiểu gen 48 3.3 Trình tự mồi, sản phẩm PCR, enzyme cắt giới hạn gen RNF4, RBP4 Trang IGF2 49 4.1 Năng suất lợn nái Landrace Yorkshire 54 4.2 Mức độ ảnh hƣởng yếu tố đến suất sinh sản 56 4.3 Ảnh hƣởng trại đến suất sinh sản lợn nái Landrace 58 4.4 Ảnh hƣởng trại đến suất sinh sản lợn nái Yorkshire 59 4.5 Ảnh hƣởng mùa vụ đến suất sinh sản lợn nái Landrace 60 4.6 Ảnh hƣởng mùa vụ đến suất sinh sản lợn nái Yorkshire 61 4.7 Ảnh hƣởng lứa đẻ đến suất sinh sản lợn nái Landrace 64 4.8 Ảnh hƣởng lứa đẻ đến suất sinh sản lợn nái Yorkshire 65 4.9 Tần số alen kiểu gen gen RNF4 gene quần thể lợn nái Landrace Yorkshire 4.10 68 Tần số alen kiểu gen gen RBP4 gene quần thể lợn nái Landrace and Yorkshire 4.11 69 Tần số alen kiểu gen gen IGF2 gene quần thể lợn nái Landrace and Yorkshire 4.12 71 Mối liên quan đa hình gen RNF4 với suất sinh sản lợn nái Landrace 4.13 73 Mối liên quan đa hình gen RNF4 với suất sinh sản lợn nái Yoskshire 4.14 74 Mối liên quan đa hình gen RBP4 với suất sinh sản lợn nái Landrace 4.15 79 Mối liên quan đa hình gen RBP4 với suất sinh sản lợn nái Yorkshire 80 viii 149 Oczkowicz M., A Mucha, M Tyra, K Ropka-Molik, and K Piorkowska (2013) Lack of the associations of the polymorphisms in IGF2, MC4R and GNAS genes with reproduction traits in pigs and imprinting analysis of IGF2 gene in ovary and cornus uteri Reproduct Domest Anim., 48: 562-568 150 Ollivier L., L A Messer, M F Rothschild, and C Legault (1997) The use of selection experiments for detecting quantitative trait loci, Genet Resear., 69(03): 227-232 151 Omelka R., M Martiniaková, D Peškovičová, and M Bauerová (2008) Associations between RBP4/MspI polymorphism and reproductive traits in pigs: an application of animal model, J Agrobiol., 25: 77-80 152 Perry J S (1954) Fecundity and embryonic mortality in pigs J Embryol exp Morph 2,308 153 Plastow G., S Sasaki, and T P Yu 2003 Practical application of DNA markers for genetic improvement Record of Proceedings National Swine Improvement Federation Conference and Annual Meeting 154 Poukka H., P Aarnisalo, H Santti, O A Janne, and J J Palvimo (2000) Coregulator small nuclear RING finger protein (SNURF) enhances Sp1- and steroid receptormediated transcription by different mechanisms, J Biol Chem., 275: 571-579 155 Riha J., V Jakubec, and S Kamlerova (2000) An analysis of some factors affecting the reproductive performance of sows, Animal Breeding Abstracts, 68(5) ref., 2780 156 Rohrer G., J Ford, T Wise, J Vallet, and R Christenson (1999) Identification of quantitative trait loci affecting female reproductive traits in a multigeneration Meishan-White composite swine population, J Anim Sci., 77(6): 1385-1391 157 Rothschild M F and J P Bidanel (1998) The genetics of the pig Chapter 10 Biology and genetics of reproduction M.F Rothchild & A Ruvinsky (Eds) CAB International 158 Rothschild F M., L Messer, L Day, R Wales, T Short, O Southwood, and G Plastow (2000) Investigation of the retinol-binding protein (RBP4) gene as a candidate gene for increased litter size in pigs, Mammal Genom., 11(1): 75-77 159 Rothschild M F., C.,Jacobson, D Vaske, C Tuggle, L Wang, T Short, G Eckardt, S Sasaki, A Vincent, and D Mclaren (1996) The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs, Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(1): 201-205 160 Rothschild M F (1998) Analysis of new candidate genes for reproduction in the pig Plant and Animak genome VI conference San Diego USA (1998), W61 125 161 Rydhmer L., L Eliasson, S Stern, K Andersson, and S Einarsson (1989) Effects of piglet weight and fraternity size on performance, puberty and farrowing results, Acta Agriculturae Scandinavica, 39(4): 397-406 162 Sato S., T Hayashi, and E Kobayashi (2011) Fine mapping the number of corpora lutea quantitative trait loci on SSC3: Analysis of the porcine follicle stimulating hormone receptor gene, Anim Sci., 82(5): 633-641 163 Saville B., H Poukka, M Wormke, O A Janne, J J Palvimo, M Stoner, I Samudio, and S Safe (2002) Cooperative coactivation of estrogen receptor α in ZR-75 human breast cancer cells by SNURF and TATA-binding protein, J Biol Chem, 277: 2485–2497 164 Schindler J (1986) Retinoids, polyamines and differentiation, Retinoids and Cell Differentiation (MI Sherman, Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL: 137-159 165 Serenius T and K J Stalder (2006) Selection for sow longevity, J Anim Sci., 84(13 suppl): E166-E171 166 Smet M N., V Segoviano, L Durand, M H Liardou, H Juin, G Gandemer, and C Legault (1998).Reference research on the evaluation of Gascon and Limousin pigs for quality products Meat quality Anim Breed Abstracts 66 (4): 361 167 Soede N M., C C H Wetzels, W Zondag, M De Koning, and B Kemp (1995) Effects of time of insemination relative to ovulation, as determined by ultrasonography, on fertilization rate and accessory sperm count in sows, J Reprod Fertil., 104: 99-106 168 Sohst E (1997) Investigation on factors affecting herd fertility in large pig herds Anim Prod Sci 86: 119-130 169 Spotter A., S Muller, H Hamann, and O Distl (2009) Effect of polymorphisms in the genes for LIF and RBP4 on litter size in two German pig lines, Reprod Domest Anim., 44(1): 100-5 170 Stinckens A., P Mathur, S Janssens, V Bruggeman, O M Onagbesan, M Schroyen, G Spincemaille, E Decuypere, M Georges, and N Buys (2010) Indirect effect of IGF2 intron3 g.3072G>A mutation on prolificacy in sows, Anim Genet., 41(5): 493-8 171 Su G., M S Lund, and D Sorensen (2004) Variance components for litter size and survival in Danish Landrace and Yorkshire pigs 55th EAAP, Bled, Slovenia, September 5th – 9th, 2004 172 Suwanasopee T., S Koonawootrittriron (2011) Genetic Markers on Reproductive Traits in Pigs Thai J Vet Med Suppl 2011 41: 73-76 126 173 Tantasuparuk W., N Lundeheim, A M Dalin, A Kunavongkrit, and S Einasson (2002) Reproductive performance of purebred Landrace and Yorkshire sows in thailand with special reference to seasonal influnce and parity munber, Theriogenology, 54: 481-496 174 Terman A., K Marek, P Daniel, and P Konrad (2007) Retinol binding protein gene and reproductive traits in pigs Arch Tierz., Dummerstorf 50: 181-185 175 Tom Long T E (1995) BLUP and PIGBLUPS Animal Breeding the Morden Approach by Post Graduate Foudation in Veterinary Science-University of Sydney 176 Tribout T., J C Caritez, J Gruand, M Bouffaud, P Guillouet, Y Billon, C Péry, E Laville, and J P Bidanel (2010) Estimation of genetic trends in French Large White pigs from 1977 to 1998 for growth and carcass traits using frozen semen, J Anim Sci., 88(9): 2856-2867 177 Tuz R., J Koczanowski, C Klocek, and W Migdal (2000) Reproductive performance of purebred and crossbred sows mated to Duroc x Hampshire boars, Anim Breed Abstracts, 68(8): 4740 178 Tummaruk P., N Lundeheim, S Einarsson, and A M Dalin (2000) Reproductive performance of purebred Swedish Landrace and Swedish Yorkshire sows: I Seasonal variation and parity influence, Acta Agricult Scand Sect A, J Anim Sci., 50: 205-216 179 Tummaruk P., W Tantasuparuk, M Techakumphu, and A Kunavongkrit (2010) A: Seasonal influences on the litter zise at birth of pig are more pronounced in the gilf than sow litter, J Agri Sci., 148: 421-432 180 Tummaruk P (2012) Effects of season, outdoor climate and photo period on age at first observed estrus in landrace x Yorkshire crossbred gilts in Thailand, Livest Sci., 144: 163-173 181 Vallet J L., B A Freking, K A Leymaster, and R K Christenson (2005) Allelic variation in the erythropoietin receptor gene is associated with uterine capacity and litter size in swine., Anim Genet., 36: 97-103 182 Van Laere A S., M Nguyen, and M Braunschweig (2003) A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig, Nature., 425: 832-6 183 Vangen O and E Sehested (1997) Swine production and research in Norway Pig News Info 18:29N–34N 184 Venanzi J D and O Verde (1997) Genetic and environmental factors, affecting litter traits in pig herds in Venezuela, Animal Breeding Abstracts, 65(10) ref., 5370 127 185 Vincent A., C Tuggle, M F Rothschild, G Evans, T Short, O Southwood, and G Plastow (1998) The prolactin receptor gene is associated with increased litter size in pigs 186 Wang X., A Wang, J Fu, and H Lin (2006) Effects of ESR1, FSHB and RBP4 genes on litter size in a Large White and a Landrace Herd Arch Tierz., Dummerstorf 187 Webb J (2000) Swine Genetics for the Next 25 Years NSIF Proceedings Cotswold International Rothwell, Lincoln LN7 6BJ, United Kingdom 188 West K P., S C Leclerq, S R Shrestha, L S F Wu, E K Pradhan, S K Khatry, J Katz, R Adhikari, and A Sommer (1997) Effects of vitamin A on growth of vitamin A-deficient children: field studies in Nepal, J Nutri., 127(10): 1957-1965 189 White B R., J Baknes, and M B Wheeler (1997) Reproductive physiology in Chinese Meishan pigs A University of Illinois perspective Anim Breed Abstracts 65(8): 4238 190 Whittemore C T and I Kyriazakis (2008) Whittemore's science and practice of pig production, John Wiley & Sons 191 Wuensch U., G Niter, U Beryfelt, and L Schueler (2000) Genetic and economic evaluation of genetic improvement schemes pigs, II: Comparison of selection strategies a three-way crossbreeding scheme, Anim Breed Abstracts, 68(8): 4708 192 Yen H F., G A Isler, W R Harvey, and K M Irvin (1987) Factors affecting reproductive - performance in swine, J Anim Sci., 64(5): 1340-1348 193 Yonggang L and X Xueshan (2012) Molecular characterization, tissue expression, polymorphism and association of porcine LCK gene, Molecul Biol Report., 39(4): 4023-4028 128 PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ACID DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ LỢN Sử dụng Kit QIAamp FOR TISSUE hãng QIAGEN Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm, hóa chất dụng cụ thí nghiệm: 1.1 Vật liệu thí nghiệm: Mẫu đuôi tai lợn đựng ống chuyên dụng đƣợc bảo quản nhiệt độ 0-4oC trƣớc tiến hành tách chiết ADN 1.2 Hóa chất: + Bộ kit tách chiết ADN cho mô hãng QIAgen 100 phản ứng/bộ Thành phần đƣợc sử dụng gồm có: STT Thành phần kit1 Thể tích cung cấp Sử dụng cho phản ứng Cột SV3 100 cột 01 cột Ống thu dung dịch 300 ống 03 ống Dung dịch Buffer TL 30 ml 200 - 400 μl Dung dịch Buffer TB 50 ml 400 - 800 μl Dung dịch Buffer BW 80 ml 600 μl Dung dịch Buffer TW 100 ml 700 μl Dung dịch Buffer AE 30 ml 200 - 400 μl Proteinase K (20 mg/ml) 2,4 ml 20 - 40 μl Tổng số phản ứng 100 phản ứng + Dung dịch cồn 70o + Thuốc nhuộm DNA Runsafe 1ml Các dung dịch đệm Buffer TL, TB, BW, TW kit không đƣợc nhà sản xuất cung cấp thông tin chi tiết thành phần Thể tích dụng dịch TL, TB proteinase K sử dụng cho phản ứng phụ thuộc vào lƣợng mô sử dụng để tách chiết Thể tích dung dịch AE đƣợc sử dụng hay nhiều cho phép thu ADN với nồng độ khác Cột SV: cột ly tâm silica cho phép gắn chọn lọc ADN Dung dịch Buffer AE có tác dụng hịa tan ADN, chứa 0.5 mM EDTA,10 mM Tris-HCl, pH9.0 Có thể thay dung dịch AE nƣớc khử ion 129 + Agarose Serva Wide Range molecular biology grade dạng bột + Đệm TBE buffer (10X) Molecular biology grade + Thang DNA ladder 1000 bp 1.3 Thiết bị: + Máy vortex mixer + Máy li tâm tốc độ 12.000 vòng/phút + Bộ cấp điện bể điện di + Tủ thao tác an toàn sinh học 1.4 Dụng cụ vật tư khác: + Micropipet đầu côn 10 μl, 200 μl, 1000 μl + Ống Eppendorf 1.5 ml + Găng tay trang phịng thí nghiệm Các bƣớc tách chiết ADN từ mẫu mô lợn: Bƣớc 1: Loại bỏ phần lông sụn mẫu, nghiền nát 25 - 50 mg mô mềm từ tai đuôi lợn lƣỡi dao dao mổ sắc đƣa vào ống 1.5ml Thêm 200 - 400 μl dung dịch đệm Buffer TL (tùy thuộc khối lƣợng mẫu) trộn máy vortex 15 giây Bƣớc 2: Tùy thuộc khối lƣợng mô, thêm 20 - 40 μl dung dịch Proteinase K nồng độ 600 IU/ml vào ống đựng mô Trộn pipet máy vortex trƣớc ủ waterbath 56oC 1-2 tiếng quan sát thấy mô bị phân giải hết tạo thành huyền phù đặc ống Trong thời gian ủ, cần phải trộn dung dịch ống đựng mẫu máy vortex từ 2-3 lần để tăng hiệu phân giải Bƣớc 3: Kiểm tra dung dịch đệm Buffer TB thấy có kết tủa cần nâng nhiệt độ lên 37oC để kết tủa tan hoàn toàn Sử dụng dung dịch đệm có kết tủa làm giảm mạnh hiệu suất tách chiết Bƣớc 4: Quay li tâm tốc độ 6.000 vòng/phút 10 giây để thu hết giọt dung dịch bám thành ống đựng mẫu Bƣớc 5: Tùy thuộc vào lƣợng mẫu ban đầu, thêm 400 - 800 μl dung dịch đệm Buffer TB vào ống đựng mẫu trộn dung dịch máy vortex Quay li tâm tốc độ 6.000 vòng/phút 10 giây để thu hết giọt dung dịch bám thành ống đựng mẫu Bƣớc 6: Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột SV đƣợc cung cấp kèm kit, mẫu sử dụng 01 cột, đánh số thứ tự ghi tên mẫu thành miệng ống đựng cột Quay 130 li tâm tốc độ 13.000 vòng phút Loại bỏ ống thu dung dịch chuyển cột lên ống thu dung dịch Nếu lƣợng dung dịch ống đựng mẫu nhiều 700 μl, chia đơi lƣợng dung dịch đổ lên cột 02 lần, sau lần loại bỏ dung dịch lọc tái sử dụng ống để ly tâm lần sau toàn dung dịch ống đựng mẫu đƣợc lọc qua cột SV Bƣớc 7: Thêm 600 μl dung dịch đệm Buffer BW lên cột SV, ý không nhả dung dịch với áp lực mạnh trực tiếp lên lớp silica cột SV Quay li tâm tốc độ 13.000 vòng 30 giây Tƣơng tự nhƣ bƣớc trên, loại bỏ ống thu dụng dịch đƣa cột lên ống thu dung dịch Bƣớc 8: Thêm 700 μl dung dịch đệm Buffer TW lên cột SV, ý không nhả dung dịch với áp lực mạnh trực tiếp lên lớp silica cột SV Quay li tâm tốc độ 13.000 vòng 30 giây Lần này, loại bỏ dung dịch lọc đƣa cột SV trở lại lên ống thu dung dịch cũ Bƣớc 9: Quay ly tâm tốc độ 13.000 vòng phút để loại bỏ dung dịch đệm rửa cịn sót lại Nếu quan sát thấy dung dịch đệm TW cột SV, quay li tâm thêm phút để loại bỏ hồn tồn Sau đặt cột SV lên ống eppendorf 1,5 ml Bƣớc 10: Thêm 200 μl dung dịch đệm AE nƣớc khử ion lên cột SV ủ nhiệt độ phòng phút Quay li tâm phút Sau thêm 200 μl dung dịch AE nƣớc khử trùng lên cột SV để 30 giây để tráng tồn ADN cịn sót lại cột Cuối cùng, quay ly tâm phút để thu toàn dung dịch chứa ADN vào ống eppendorf 1,5ml Kiểm tra bảo quản ADN tổng số 3.1 Kiểm tra ADN tổng số Bước 1: Kiểm tra sản phẩm ADN tổng số đƣợc tách chiết phƣơng pháp điện di gel agarose 1%, hiệu điện 110V, cƣờng độ dòng điện 91mA 15-20 phút Mỗi giếng điện di chứa µl sản phẩm PCR trộn với µl loading dye 6X Một giếng chứa thang ADN 1000 bp Gel agarose đƣợc trộn với µl thuốc nhuộm huỳnh quang Red Safe Kết đƣợc đọc dƣới tia UV buồng đọc IGenius3 Sản phẩm ADN tổng số mong muốn đƣợc thể Hình Các mẫu mô khác cho sản phẩm tách chiết ADN có nồng độ khác Các mẫu ADN cho vạch rõ sáng vật liệu tốt cho thí nghiệm Ngƣợc lại mẫu ADN cho vạch mảnh mờ cho kết không rõ ràng không cho kết phân tích Bước 2: Kiểm tra phƣơng pháp đo nồng độ tƣơng đối quang phổ kế (phƣơng pháp đo OD) Sản phẩm tách chiết ADN lý tƣởng có số OD đạt 100 ng/μl với 131 độ tinh (tỷ lệ A260/A280) đạt 1,8 ~ 2,2 Hình 1: Kết kiểm tra điện di sau tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô đuôi lợn (sử dụng thang ADN 1000bp) c Bảo quản ADN Sau tách chiết, ADN đƣợc bảo quản ống eppendorf 1,5ml Chất lƣợng ADN đƣợc trì nhƣ lúc tách chiết - năm bảo quản nhiệt độ -80oC, - tháng bảo quản -20oC -3 tháng bảo quản 4oC Nếu cần tiến hành nhiều đợt thí nghiệm khác nên chia nhỏ lƣợng ADN vào ống để dễ dàng sử dụng tránh rã đông nhiều lần để giảm thiểu nguy làm đứt gãy ADN 132 PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH KIỂU GEN RNF4, RBP4 VÀ IGF2 SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR - RFLP A ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG ĐỐI TƢỢNG: Toàn Acid Deoxyribonucleic (ADN) genome tinh lợn MỤC TIÊU: - Nhân đƣợc đoạn đoạn gen mong muốn phƣơng pháp khuếch đại gen PCR (Polymerase Chain Reaction) - Xác định đƣợc kiểu gen lợn phƣơng pháp đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) PHẠM VI ÁP DỤNG Quy trình áp dụng cho việc xác định kiểu gen RNF4, RBP4 IGF2 phƣơng pháp PCR - RFLP ADN genome lợn C NỘI DUNG QUY TRÌNH Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm hóa chất dụng cụ thí nghiệm: 1.1 Vật liệu thí nghiệm: Mẫu ADN genome lợn đƣợc tinh sạch, đựng ống chuyên dụng nồng độ từ 10 - 30 ng/ml, hệ số A260/A280 từ 1,8 – 2,2 1.2 Hóa chất: STT Hóa chất Hãng sản xuất Bộ dNTP gồm 04 lọ dATP, dCTP, dGTP dTTP, 100mM/lọ New England Biolabs Taq ADN Polymerase 2000U New England Biolabs Dung dịch đệm ThermoPol® Buffer 10X, thành phần gồm: New England Biolabs - 200 mM Tris-HCl - 100 mM (NH4)2SO4 - 100 mM KCl - 20 mM MgSO4 133 - 1% Triton® X-100 - pH 8.8 25°C Enzyme SacII 2000U New England Biolabs Enzyme Mspl 5000U New England Biolabs Enzyme NciI 2000U New England Biolabs Forward primer IGF2, 100 nM IDT Reverse primer IGF2, 100 nM IDT Forward primer RNF4, 100 nM IDT Reverse primer RNF4, 100 nM IDT 10 Forward primer RBP4, 100 nM IDT 11 Reverse primer RBP4, 100 nM IDT 12 Dung dịch đệm Cut Smart Buffer 10X, thành phần gồm: New England Biolabs - 500 mM Potassium Acetate - 200 mM Tris-acetate - 100 mM Magnesium Acetate - mg/ml BSA - pH 7.9 25°C 13 Thuốc nhuộm ADN Runsafe, 1ml Cleaver Scientific 14 Gel loading dye tím 6X New England Biolabs 15 De-ion ultrapure water Sigma-Aldrich 16 Dung dịch cồn tuyệt đối Merck 17 Agarose Serva Wide Range molecular biology grade dạng bột Serva 18 Thang ADN ladder 100 bp 19 Đệm TBE buffer 10M (10X) Molecular biology grade New England Biolabs 134 Serva Trình tự cặp mồi: Mồi xuôi (5’-3’) Gen Mồi ngƣợc (5’-3’) RNF4 CGAAATGCCAGGGAAGAG CCATGCAGATCGGACAACT RBP4 GAGCAAGATGGAATGGGTT CTCGGTGTCTGTAAAGGTG IGF2 CACAGCAGGTGCTCCATCGG GACAGGCTGTCATCCTGTGGG 1.3 Thiết bị: + Máy luân nhiệt dùng cho phản ứng PCR + Máy vortex mixer + Máy spinning máy ly tâm có chế độ spinning + Bộ cấp điện bể điện di + Tủ thao tác an toàn sinh học d Dụng cụ vật tƣ khác: + Micropipet đầu côn 10 μl, 200 μl, 1000 μl + Ống Eppendorf 1,5 ml + Găng tay trang phịng thí nghiệm Các bƣớc xác định kiểu gen: Phần 1: Khuếch đại số lƣợng gen phƣơng pháp PCR Bước 1: Thiết kế mồi - Cặp mồi phải có trình tự bổ sung với hai đầu đoạn ADN cần khuếch đại Đoạn ADN cần khuếch đại không dài, độ dài lý tƣởng